The vascular adventitia has long been postulated to play a key role in atherosclerosis, but the relevant adventitial cell populations and the mechanisms by which they influence atherosclerosis have remained elusive. To characterize relevant adventitial cells and their regulators, we have combined single cell multi-omic murine and human data with human genetics. Single cell transcriptomic and epigenetic analysis of both murine and human arterial tissue revealed a unique population of adventitial fibroblasts (AdvFib). Transcriptome and epigenome analysis revealed disproportionate enrichment for coronary artery disease (CAD) GWAS risk loci and genes in AdvFib, suggesting that AdvFib actively contributes to disease. Leveraging this rich information, we created a novel AdvFib specific CreERT2 murine model to enable AdvFib specific genetic manipulation. Murine lineage tracing using this novel AdvFib-specific model of atherosclerosis revealed early expansion and transcriptomic alteration of AdvFib during plaque development, akin to phenotypic modulation of SMC. Cell-cell communication analysis demonstrated an increase in AdvFib-driven crosstalk with other cell types during early phases of atherosclerosis, including activation of pro-inflammatory (Il6, Ccl2/7, Cxcl12) genes. Computational enrichment analysis of regulatory region of genes associated with AdvFib modulation points to a prominent role for TCF21 , a CAD GWAS risk gene. Single cell time course data of atherosclerosis demonstrates that Tcf21 is expressed primarily in AdvFib with dynamic alteration of its expression during atherosclerosis. AdvFib-specific Tcf21 loss in murine model of atherosclerosis resulted in altered expression of ECM and inflammatory genes, with corresponding changes in recruitment of inflammatory cells. Mechanistically, through histone modification cut-and-tag in human coronary AdvFib, we showed that TCF21 regulates AdvFib activation through epigenetic reprograming of key cytokine and cell fate regulators by binding and altering H3K27Acetylation. Collectively, our results begin to establish the role of AdvFib in atherosclerosis and highlight the importance of TCF21 in this process through a precise epigenetic mechanism.

Despite decades of progress, coronary artery disease (CAD) remains the top cause of death worldwide. Additionally, trends in outcomes have worsened recently, highlighting the critical need for additional treatments. Human genetics has identified over 300 loci associated with CAD, but understanding the molecular mechanisms leading to disease remains a huge barrier to developing new therapies. These CAD-associated loci are enriched in smooth muscle cells (SMC) of the vascular wall, but no current therapies target these cells. Since insulin resistance is an important risk factor for CAD, understanding the molecular functions of genes associated with both insulin resistance and CAD will prioritize therapeutic candidates, especially if expressed in SMCs. One promising candidate is the gene PRDM16 (PR domain containing 16), which is highly expressed in vascular tissue. PRDM16 regulates cell fate decisions and insulin resistance in adipose tissue, but its role in atherosclerosis and SMC function is unknown. Recent advances in lineage tracing and conditional SMC knockout mouse models in conjunction with single cell technologies have demonstrated the cellular trajectories of SMC into several cellular states, including fibromyocytes (FMC) and chondromyocytes (CMC). Here, we employ this innovative approach to understand the role of Prdm16 on SMC phenotypic modulation in vivo and its role in the development of FMC and CMC. We also demonstrate the impact of Prdm16 in atherosclerosis and other important lesion characteristics relating to disease risk. We validate these effects in vitro and employ epigenetic analysis to identify the gene regulatory mechanisms whereby PRDM16 mediates its effects on SMC phenotypic modulation. Collectively these data demonstrate that PRDM16 is a causal factor that promotes risk of CAD.

We have recently identified rs2019090 and PDGFD as the functional variant and gene mediating CAD risk at the 11q22.3 locus, with our initial analysis using a global knockout (KO) model showing that this gene may promote phenotypic changes in smooth muscle cells (SMCs) in the plaque and contribute to neointimal vascular calcification. Nonetheless, the specific cell-type and phenotypic states through which PDGFD may confer disease risk remains unexplored.To delineate the impact of SMC-derived PDGFD signalling on cell state transitions and plaque progression in atherosclerosis, we have developed a novel SMC-specific lineage tracing and Pdgfd KO mouse ( Pdgfd ΔSMC/ΔSMC , Myh11 CreERT2 , ROSA tdT/+ , ApoE -/- ) allowing us to confidently define the impact of SMC-derived Pdgfd in the vascular SMC lineage as well as in neighbouring populations. Leveraging our lineage tracing KO mutants on a hypercholesterolemic diet, we have employed single cell RNA sequencing (scRNAseq) and histological analyses to characterize the cellular and molecular effect of Pdgfd in vascular disease. SMC-specific Pdgfd deletion resulted in alterations in the distribution of transitioning SMC populations, as well as previously unexplored gene expression differences within these cell types. This was accompanied by a significant reduction in atherosclerotic burden and plaque size across the aorta, including aortic root as well as descending abdominal aorta. Histological analysis revealed decreased monocyte recruitment, show by quantifying CD68+ cells within the plaque. To explore this further we interrogated the scRNAseq dataset to identify major pathways of cell-cell communication and the impact of altered Pdgfd signalling across different cell types. Overall, these data reveal that SMC-derived PDGFD substantially alters lesional SMC cell phenotype transitions, as well as inflammatory cell recruitment, implicating it as a major regulator of atherosclerotic disease progression.

Introduction: Electronic cigarettes pose a serious emerging threat to cardiovascular health. The use of electronic nicotine delivery systems (ENDS) such as electronic cigarettes (e-cigs) have increased exponentially, especially among adolescents. Emerging data suggest e-cig use has been implicated in promoting atherosclerosis. This work explores the mechanism of e-cig exposure accelerated the atherosclerotic lesion development and vascular remodeling. Methods: SMC-lineage tracing mice (n=16) on a ApoE null hyperlipidemic background were put on high fat diet for 12 weeks and exposed to pod-based e-cigs (Juul) three times a week for 12 weeks in a whole-body chamber (inExpose, Scireq) and compared to WT mice exposed to air (n=16). The aortic sinus was dissected and digested, FACS was performed to sort for live single cells, then single-cell RNA-Seq (sc-RNAseq) and ATAC-seq were performed on the 10X Genomics platform. Analyses were completed with Seurat and Signac tools. The osteogenic load was assessed by histology with alkaline phosphatase (AP) enzymatic assay using the Ferangi Blue Chromogen kit. Results: scRNA-Seq analysis revealed that e-cig accelerated the SMC transition to a chondrogenic phenotype (CMC). We found a significantly increased proportion of chondromyocytes (CMC) expressing specific markers such as Col2a1 and Acan in the e-cig exposed mice compared to control. The scATAC-seq profiles showed that e-cig exposed mice develop a cell cluster that enriched for markers related to nicotine, glutamatergic and dopaminergic pathways. The genes highly enriched for chromatin accessibility in this cluster included Grin2a , a gene that encodes a N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) GluN2A, which was found to be expressed in the fibromyocyte and CMC population of the scRNA-seq. Consistent with our finding from the scRNA-Seq data showing a greater CMC proportion in the e-cig exposed mice, we found the relative AP-stained area to be larger in the exposed group than in the WT group. Conclusion: Overall, these data indicate that e-cig exposure can promote atherosclerosis through adverse SMC phenotypic modulation. Moreover, e-cig exposure induces NMDAR activation that may be implicated in SMC modulation to a chondrogenic phenotype.

Our lab has recently shown that several coronary artery disease (CAD)-protective genes inhibit the transition of smooth muscle cells from plaque-stabilising fibromyocytes (FMCs) to chondrocyte-like chondromyocytes (CMCs) that localise to areas associated with plaque vulnerability, namely acellular and calcified regions. To further investigate the molecular mechanisms underlying the transition from FMCs to CMCs, and to determine the CMC impact on lesional stability, we induced SMC-specific deletion of endochondral master regulator Sox9 and performed single-cell genomics and histological assays in a murine model of atherosclerosis. Whilst deletion of Sox9 resulted in only modest gene expression differences in the contractile SMC and FMC clusters, near total CMC ablation was observed, accompanied by marked downregulation of CMC marker genes, including Col2a1 and Ibsp . Importantly, a substantial decrease in neointimal calcium deposition was also observed. Although Sox9 deletion resulted in closure of chromatin at many CMC genes, overall, a net opening was observed in CMC cluster cells, particularly at genes implicated in FMC-associated processes including inflammation and cytoskeletal dynamics. Peaks of de novo open chromatin were enriched for the motifs of athero-protective, anti-chondrogenic transcription factors, including SMAD3 and AHR, implicating SOX9 as an epigenetic antagonist of anti-chondrogenic programs. In addition, Sox9 ablation substantially reduced total plaque burden in non-aortic root arteries, which was not due to altered serum lipid levels, but which in vitro evidence suggested may in part be due to altered SMC proliferation. Taken together, these data implicate SOX9 as a major regulator of CMC formation and suggest pathological roles for SOX9 beyond intimal calcification. The elucidation of genes and pathways implicated in the FMC to CMC transition could identify novel targets to bias SMC towards plaque-stabilising and away from plaque-destabilising fates.

Mapping the genomic architecture of complex disease has been predicated on the understanding that genetic variants influence disease risk through modifying gene expression. However, recent discoveries have revealed that a significant burden of disease heritability in common autoinflammatory disorders and coronary artery disease is mediated through genetic variation modifying post-transcriptional modification of RNA through adenosine-to-inosine (A-to-I) RNA editing. This common RNA modification is catalyzed by ADAR enzymes, where ADAR1 edits specific immunogenic double stranded RNA (dsRNA) to prevent activation of the double strand RNA (dsRNA) sensor MDA5 ( IFIH1 ) and stimulation of an interferon stimulated gene (ISG) response. Multiple lines of human genetic data indicate impaired RNA editing and increased dsRNA sensing to be an important mechanism of coronary artery disease (CAD) risk. Here, we provide a crucial link between observations in human genetics and mechanistic cell biology leading to progression of CAD. Through analysis of human atherosclerotic plaque, we implicate the vascular smooth muscle cell (SMC) to have a unique requirement for RNA editing, and that ISG induction occurs in SMC phenotypic modulation, implicating MDA5 activation. Through culture of human coronary artery SMCs, generation of a conditional SMC specific Adar1 deletion mouse model on a pro-atherosclerosis background, and with incorporation of single cell RNA sequencing cellular profiling, we further show that Adar1 controls SMC phenotypic state, is required to maintain vascular integrity, and controls progression of atherosclerosis and vascular calcification. Our data implicates MDA5 activation to occur in SMC phenotypic modulation and accelerates formation of chondromyocytes in a distinct cellular lineage trajectory — indicating a cell type and context specific requirement of RNA editing. Through this work, we describe a fundamental new mechanism of CAD, where RNA editing and sensing of dsRNA in a cell type and context specific mechanism mediates disease progression, bridging our understanding of human genetics and disease causality.