Background: Neutrophils by releasing extracellular traps (NETs) provide a scaffold for platelet activation and coagulation, thereby facilitating venous thrombosis (VT) development. Emerging evidence suggests that neutrophil activation and NETs formation (NETosis) is an energy-intensive process, accompanied by an increased rate of aerobic glycolysis (lactate formation in the presence of oxygen). The metabolic enzymes pyruvate dehydrogenase kinases (PDKs) inhibit the pyruvate dehydrogenase complex to divert the pyruvate flux (final product of glycolysis) from oxidative phosphorylation towards aerobic glycolysis. Recently, we reported the role of PDK2 and PDK4 (PDK2/4) in platelet activation and arterial thrombosis. The regulatory role of PDKs in neutrophils and VT has not been explored. Aim: To test the hypothesis that PDK2/4 promotes NETosis and VT by promoting glycolysis in neutrophils. Methods: Double-deficient PDK2/4 -/- and wild-type (WT) mice were subjected to 48 hours of inferior vena cava stenosis to test the susceptibility to VT. In vitro , neutrophils were stimulated with Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and the glycolytic proton efflux rate (glycoPER) was measured using the Seahorse XF Analyzer. Results: The PDK2/4 -/- mice were less susceptible to DVT as measured by the primary outcome of reduced thrombus burden (weight, length and % incidence) and marker of NETs such as citrullinated histones (P<0.05 vs WT). In the WT platelet aggregation assay mediated by PMA-stimulated WT or PDK2/4 -/- neutrophils, we observed reduced platelet aggregation evoked by PMA-stimulated PDK2/4 -/- neutrophils (P<0.05 vs WT). Impaired aggregation was associated with reduced release of cathepsin G and elastase from PMA-stimulated PDK2/4 -/- neutrophils (P<0.05 vs WT). Mechanistically, PMA-stimulated PDK2/4 -/- neutrophils exhibited reduced NETosis that was associated with decreased calcium mobilization and Erk1/2 phosphorylation (P<0.05 vs WT), known contributors of NETosis. Furthermore, PMA-stimulated PDK2/4 -/- neutrophils displayed reduced glycoPER (P<0.05 vs WT), suggesting reduced aerobic glycolysis. Conclusions: These findings for the first time demonstrate the regulatory role of PDK2/4 in NETosis and acute progression of VT.

Introduction: Several factors released from activated platelets via exocytosis contribute to venous thrombosis (VT) by potentiating neutrophil extracellular traps formation (NETosis) at the sites of inflammation. The metabolic enzyme pyruvate kinase M2 (PKM2) contributes to platelet activation and arterial thrombosis. PKM2 possess protein kinase activity. The regulatory role of PKM2 in platelet granule exocytosis, NETosis, and VT has not been investigated yet. Aim: To test the hypothesis that dimeric PKM2 regulates SNAP23-mediated platelet granule exocytosis, and thereby contributes to NETosis, and VT. Methods: We utilized platelet-specific PKM2 –/– (PKM2 fl/fl PF4Cre + ), littermate (PKM2 fl/fl ) mice, and wild-type (WT) mice treated with small molecule ML265 (limits PKM2 dimerization) or vehicle to test the susceptibility to VT in inferior vena cava (IVC)-stenosis model. In vitro NETs formation was evaluated by co-incubating WT neutrophils with agonist (thrombin or convulxin)-stimulated platelets. The SNAP23 phosphorylation and PF4 release were measured using Western blot. Results: PKM2 fl/fl PF4Cre + or WT mice pre-treated with ML265 exhibited reduced susceptibility to VT in the 48 hours IVC-stenosis model as evaluated by less thrombus burden (% incidence, length, and weight, n=11-12/group, P<0.05 vs. controls). Myography revealed that limiting PKM2 dimerization improves the venous wall function post-VT. Activated PKM2 –/– or ML265 pre-treated WT platelets exhibited decreased SNAP23 phosphorylation and PF4 secretion suggesting a regulatory role for PKM2 in SNAP23 exocytosis and PF4 secretion. Furthermore, neutrophils stimulated with activated platelets from either PKM2 fl/fl PF4Cre + or WT mice pre-treated with ML265 showed reduced NETosis. Finally, we demonstrate that the % of the area covered by the thrombus is profoundly reduced in the ML265-treated human whole blood perfused over a tissue factor-coated surface at the venous shear. Conclusions: Dimeric PKM2 is a novel regulator of SNAP23-mediated platelet granule exocytosis. Targeting dimeric PKM2 in platelets inhibits NETosis in neutrophils stimulated with activated platelets and reduces susceptibility to experimental VT.

Abstract Neutrophils contribute to deep vein thrombosis (DVT) by releasing prothrombotic neutrophil extracellular traps (NETs). NET formation (known as NETosis) is an energy-intensive process that requires an increased rate of aerobic glycolysis. The metabolic enzymes pyruvate dehydrogenase kinases (PDKs) inhibit the pyruvate dehydrogenase complex to divert the pyruvate flux from oxidative phosphorylation toward aerobic glycolysis. Herein, we identified that the combined deletion of PDK2 and PDK4 (PDK2/4–/–) renders mice less susceptible to DVT (measured by thrombus incidence, weight, and length) in the inferior vena cava–stenosis model at day 2 after surgery. Compared with wild-type (WT) mice, the venous thrombus obtained from PDK2/4–/– mice exhibited reduced citrullinated histone content, a known marker of NETs. In line with in vivo observations, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)–stimulated PDK2/4–/– neutrophils displayed reduced NETosis and secretion of cathepsin G and elastase compared with PMA-stimulated WT neutrophils. The formation of platelet aggregates mediated by PMA-stimulated PDK2/4–/– neutrophils were significantly reduced compared with PMA-stimulated WT neutrophils. Finally, PDK2/4–/– neutrophils exhibited reduced levels of intracellular Ca2+ concentration, extracellular signal-regulated kinase 1/2 (Erk1/2) phosphorylation, and glycolytic proton efflux rate (a measure of aerobic glycolysis), known to facilitate NETosis. Together, these findings elucidate, to our knowledge, for the first time, the fundamental role of PDK2/4 in regulating NETosis and acute DVT.