Rationale: Autophagy, a bulk degradation process of cytosolic proteins and organelles, is protective during nutrient starvation in cardiomyocytes (CMs). However, the underlying signaling mechanism mediating autophagy is not well understood. Objective: We investigated the role of FoxOs and its posttranslational modification in mediating starvation-induced autophagy. Methods and Results: Glucose deprivation (GD) increased autophagic flux in cultured CMs, as evidenced by increased mRFP-GFP-LC3 puncta and decreases in p62, which was accompanied by upregulation of Sirt1 and FoxO1. Overexpression of either Sirt1 or FoxO1 was sufficient for inducing autophagic flux, whereas both Sirt1 and FoxO1 were required for GD-induced autophagy. GD increased deacetylation of FoxO1, and Sirt1 was required for GD-induced deacetylation of FoxO1. Overexpression of FoxO1(3A/LXXAA), which cannot interact with Sirt1, or p300, a histone acetylase, increased acetylation of FoxO1 and inhibited GD-induced autophagy. FoxO1 increased expression of Rab7, a small GTP-binding protein that mediates late autophagosome–lysosome fusion, which was both necessary and sufficient for mediating FoxO1-induced increases in autophagic flux. Although cardiac function was maintained in control mice after 48 hours of food starvation, it was significantly deteriorated in mice with cardiac-specific overexpression of FoxO1(3A/LXXAA), those with cardiac-specific homozygous deletion of FoxO1 (c-FoxO1 −/− ), and beclin1 +/− mice, in which autophagy is significantly inhibited. Conclusions: These results suggest that Sirt1-mediated deacetylation of FoxO1 and upregulation of Rab7 play an important role in mediating starvation-induced increases in autophagic flux, which in turn plays an essential role in maintaining left ventricular function during starvation.

Background— Silent information regulator 1 (Sirt1), a class III histone deacetylase, retards aging and protects the heart from oxidative stress. We here examined whether Sirt1 is protective against myocardial ischemia/reperfusion (I/R). Methods and Results— Protein and mRNA expression of Sirt1 is significantly reduced by I/R. Cardiac-specific Sirt1 −/− mice exhibited a significant increase (44±5% versus 15±5%; P =0.01) in the size of myocardial infarction/area at risk. In transgenic mice with cardiac-specific overexpression of Sirt1, both myocardial infarction/area at risk (15±4% versus 36±8%; P =0.004) and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling–positive nuclei (4±3% versus 10±1%; P <0.003) were significantly reduced compared with nontransgenic mice. In Langendorff-perfused hearts, the functional recovery during reperfusion was significantly greater in transgenic mice with cardiac-specific overexpression of Sirt1 than in nontransgenic mice. Sirt1 positively regulates expression of prosurvival molecules, including manganese superoxide dismutase, thioredoxin-1, and Bcl-xL, whereas it negatively regulates the proapoptotic molecules Bax and cleaved caspase-3. The level of oxidative stress after I/R, as evaluated by anti-8-hydroxydeoxyguanosine staining, was negatively regulated by Sirt1. Sirt1 stimulates the transcriptional activity of FoxO1, which in turn plays an essential role in mediating Sirt1-induced upregulation of manganese superoxide dismutase and suppression of oxidative stress in cardiac myocytes. Sirt1 plays an important role in mediating I/R-induced increases in the nuclear localization of FoxO1 in vivo. Conclusions— These results suggest that Sirt1 protects the heart from I/R injury through upregulation of antioxidants and downregulation of proapoptotic molecules through activation of FoxO and decreases in oxidative stress.

Both fusion and fission contribute to mitochondrial quality control. How unopposed fusion affects survival of cardiomyocytes and left ventricular function in the heart is poorly understood.We investigated the role of dynamin-related protein 1 (Drp1), a GTPase that mediates mitochondrial fission, in mediating mitochondrial autophagy, ventricular function, and stress resistance in the heart.Drp1 downregulation induced mitochondrial elongation, accumulation of damaged mitochondria, and increased apoptosis in cardiomyocytes at baseline. Drp1 downregulation also suppressed autophagosome formation and autophagic flux at baseline and in response to glucose deprivation in cardiomyocytes. The lack of lysosomal translocation of mitochondrially targeted Keima indicates that Drp1 downregulation suppressed mitochondrial autophagy. Mitochondrial elongation and accumulation of damaged mitochondria were also observed in tamoxifen-inducible cardiac-specific Drp1 knockout mice. After Drp1 downregulation, cardiac-specific Drp1 knockout mice developed left ventricular dysfunction, preceded by mitochondrial dysfunction, and died within 13 weeks. Autophagic flux is significantly suppressed in cardiac-specific Drp1 knockout mice. Although left ventricular function in cardiac-specific Drp1 heterozygous knockout mice was normal at 12 weeks of age, left ventricular function decreased more severely after 48 hours of fasting, and the infarct size/area at risk after ischemia/reperfusion was significantly greater in cardiac-specific Drp1 heterozygous knockout than in control mice.Disruption of Drp1 induces mitochondrial elongation, inhibits mitochondrial autophagy, and causes mitochondrial dysfunction, thereby promoting cardiac dysfunction and increased susceptibility to ischemia/reperfusion.

Here we show that Mst1, a proapoptotic kinase, impairs protein quality control mechanisms in the heart through inhibition of autophagy. Stress-induced activation of Mst1 in cardiomyocytes promoted accumulation of p62 and aggresome formation, accompanied by the disappearance of autophagosomes. Mst1 phosphorylated the Thr108 residue in the BH3 domain of Beclin1, which enhanced the interaction between Beclin1 and Bcl-2 and/or Bcl-xL, stabilized the Beclin1 homodimer, inhibited the phosphatidylinositide 3-kinase activity of the Atg14L-Beclin1-Vps34 complex and suppressed autophagy. Furthermore, Mst1-induced sequestration of Bcl-2 and Bcl-xL by Beclin1 allows Bax to become active, thereby stimulating apoptosis. Mst1 promoted cardiac dysfunction in mice subjected to myocardial infarction by inhibiting autophagy, associated with increased levels of Thr108-phosphorylated Beclin1. Moreover, dilated cardiomyopathy in humans was associated with increased levels of Thr108-phosphorylated Beclin1 and signs of autophagic suppression. These results suggest that Mst1 coordinately regulates autophagy and apoptosis by phosphorylating Beclin1 and consequently modulating a three-way interaction among Bcl-2 proteins, Beclin1 and Bax.

Background— Mitochondrial autophagy is an important mediator of mitochondrial quality control in cardiomyocytes. The occurrence of mitochondrial autophagy and its significance during cardiac hypertrophy are not well understood. Methods and Results— Mice were subjected to transverse aortic constriction (TAC) and observed at multiple time points up to 30 days. Cardiac hypertrophy developed after 5 days, the ejection fraction was reduced after 14 days, and heart failure was observed 30 days after TAC. General autophagy was upregulated between 1 and 12 hours after TAC but was downregulated below physiological levels 5 days after TAC. Mitochondrial autophagy, evaluated by electron microscopy, mitochondrial content, and Keima with mitochondrial localization signal, was transiently activated at ≈3 to 7 days post-TAC, coinciding with mitochondrial translocation of Drp1. However, it was downregulated thereafter, followed by mitochondrial dysfunction. Haploinsufficiency of Drp1 abolished mitochondrial autophagy and exacerbated the development of both mitochondrial dysfunction and heart failure after TAC. Injection of Tat-Beclin 1, a potent inducer of autophagy, but not control peptide, on day 7 after TAC, partially rescued mitochondrial autophagy and attenuated mitochondrial dysfunction and heart failure induced by overload. Haploinsufficiency of either drp1 or beclin 1 prevented the rescue by Tat-Beclin 1, suggesting that its effect is mediated in part through autophagy, including mitochondrial autophagy. Conclusions— Mitochondrial autophagy is transiently activated and then downregulated in the mouse heart in response to pressure overload. Downregulation of mitochondrial autophagy plays an important role in mediating the development of mitochondrial dysfunction and heart failure, whereas restoration of mitochondrial autophagy attenuates dysfunction in the heart during pressure overload.

Rheb is a GTP-binding protein that promotes cell survival and mediates the cellular response to energy deprivation (ED). The role of Rheb in the regulation of cell survival during ED has not been investigated in the heart.Rheb is inactivated during cardiomyocyte (CM) glucose deprivation (GD) in vitro, and during acute myocardial ischemia in vivo. Rheb inhibition causes mTORC1 inhibition, because forced activation of Rheb, through Rheb overexpression in vitro and through inducible cardiac-specific Rheb overexpression in vivo, restored mTORC1 activity. Restoration of mTORC1 activity reduced CM survival during GD and increased infarct size after ischemia, both of which were accompanied by inhibition of autophagy, whereas Rheb knockdown increased autophagy and CM survival. Rheb inhibits autophagy mostly through Atg7 depletion. Restoration of autophagy, through Atg7 reexpression and inhibition of mTORC1, increased cellular ATP content and reduced endoplasmic reticulum stress, thereby reducing CM death induced by Rheb activation. Mice with high-fat diet-induced obesity and metabolic syndrome (HFD mice) exhibited deregulated cardiac activation of Rheb and mTORC1, particularly during ischemia. HFD mice presented inhibition of cardiac autophagy and displayed increased ischemic injury. Pharmacological and genetic inhibition of mTORC1 restored autophagy and abrogated the increase in infarct size observed in HFD mice, but they failed to protect HFD mice in the presence of genetic disruption of autophagy.Inactivation of Rheb protects CMs during ED through activation of autophagy. Rheb and mTORC1 may represent therapeutic targets to reduce myocardial damage during ischemia, particularly in obese patients.

Energy stress, such as ischemia, induces mitochondrial damage and death in the heart. Degradation of damaged mitochondria by mitophagy is essential for the maintenance of healthy mitochondria and survival. Here, we show that mitophagy during myocardial ischemia was mediated predominantly through autophagy characterized by Rab9-associated autophagosomes, rather than the well-characterized form of autophagy that is dependent on the autophagy-related 7 (Atg) conjugation system and LC3. This form of mitophagy played an essential role in protecting the heart against ischemia and was mediated by a protein complex consisting of unc-51 like kinase 1 (Ulk1), Rab9, receptor-interacting serine/thronine protein kinase 1 (Rip1), and dynamin-related protein 1 (Drp1). This complex allowed the recruitment of trans-Golgi membranes associated with Rab9 to damaged mitochondria through S179 phosphorylation of Rab9 by Ulk1 and S616 phosphorylation of Drp1 by Rip1. Knockin of Rab9 (S179A) abolished mitophagy and exacerbated the injury in response to myocardial ischemia, without affecting conventional autophagy. Mitophagy mediated through the Ulk1/Rab9/Rip1/Drp1 pathway protected the heart against ischemia by maintaining healthy mitochondria.

SUMMARY Regenerative medicine relies on basic research to find safe and useful outcomes that are only practical when cost-effective. The human eyeball requires the retinal pigment epithelium (RPE) for support and maintenance that interfaces the neural retina and the choroid at large. Nearly 200 million people suffer from age-related macular degeneration (AMD), a blinding multifactor genetic disease among other retinal pathologies related to RPE degradation. Recently, autologous pluripotent stem cell-derived RPE cells were prohibitively expensive due to time, therefore we developed a new simplified cell reprogramming system. We stably induced RPE-like cells (iRPE) from human fibroblasts by conditional overexpression of broad plasticity and lineage-specific pioneering transcription factors. iRPE cells showed features of modern RPE benchmarks and significant in-vivo integration in transplanted chimeric hosts. Herein, we detail the iRPE system with comprehensive modern single-cell RNA (scRNA) sequencing profiling to interpret and characterize its best cells. We anticipate that our system may enable robust retinal cell induction for regenerative medicine research and affordable autologous human RPE tissue for cell therapy.

Takayasu arteritis is a large-vessel vasculitis that affects the aorta and its primary branches. Myocarditis is a rare life-threatening complication and potential diagnostic pitfall in patients with Takayasu arteritis.

Abstract The molecular mechanisms by which FoxO transcription factors mediate diametrically opposite cellular responses, namely death and survival, remain unknown. Here we show that Mst1 phosphorylates FoxO1 Ser209/Ser215/Ser218/Thr228/Ser232/Ser243, thereby inhibiting FoxO1-mediated transcription of proapoptotic genes. On the other hand, Mst1 increases FoxO1-C/EBP-β interaction and activates C/EBP-β by phosphorylating it at Thr299, thereby promoting transcription of prosurvival genes. Myocardial ischemia/reperfusion injury is larger in cardiac-specific FoxO1 knockout mice than in control mice. However, the concurrent presence of a C/EBP-β T299E phospho-mimetic mutation reduces infarct size in cardiac-specific FoxO1 knockout mice. The C/EBP-β phospho-mimetic mutant exhibits greater binding to the promoter of prosurvival genes than wild type C/EBP-β. In conclusion, phosphorylation of FoxO1 by Mst1 inhibits binding of FoxO1 to pro-apoptotic gene promoters but enhances its binding to C/EBP-β, phosphorylation of C/EBP-β, and transcription of prosurvival genes, which stimulate protective mechanisms in the heart.