Deconstruction of lignocellulosic plant cell walls to fermentable sugars by thermochemical and/or biological means is impeded by several poorly understood ultrastructural and chemical barriers. A promising thermochemical pretreatment called ammonia fiber expansion (AFEX) overcomes the native recalcitrance of cell walls through subtle morphological and physicochemical changes that enhance cellulase accessibility without extracting lignin and hemicelluloses into separate liquid streams. Multi-scale visualization and characterization of Zea mays (i.e., corn stover) cell walls were carried out by laser scanning confocal fluorescence microscopy (LSCM), Raman spectroscopy, atomic force microscopy (AFM), electron microscopy (SEM, TEM), nuclear magnetic resonance (NMR), and electron spectroscopy for chemical analysis (ESCA) to elucidate the mechanism of AFEX pretreatment. AFEX first dissolves, then extracts and, as the ammonia evaporates, redeposits cell wall decomposition products (e.g., amides, arabinoxylan oligomers, lignin-based phenolics) on outer cell wall surfaces. As a result, nanoporous tunnel-like networks, as visualized by 3D-electron tomography, are formed within the cell walls. We propose that this highly porous structure greatly enhances enzyme accessibility to embedded cellulosic microfibrils. The shape, size (10 to 1000 nm), and spatial distribution of the pores depended on their location within the cell wall and the pretreatment conditions used. Exposed pore surface area per unit AFEX pretreated cell wall volume, estimated via TEM-tomogram image analysis, ranged between 0.005 and 0.05 nm2 per nm3. AFEX results in ultrastructural and physicochemical modifications within the cell wall that enhance enzymatic hydrolysis yield by 4–5 fold over that of untreated cell walls.

Lignified cell walls are widely considered to be key innovations in the evolution of terrestrial plants from aquatic ancestors some 475 million years ago [1Kendrick P. Crane P.R. The origin and early evolution of plants on land.Nature. 1997; 389: 33-39Crossref Scopus (912) Google Scholar, 2Peter G. Neale D. Molecular basis for the evolution of xylem lignification.Curr. Opin. Plant Biol. 2004; 7: 737-742Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 3Boyce C.K. Zwieniecki M.A. Cody G.D. Jacobsen C. Wirick S. Knoll A.H. Holbrook N.M. Evolution of xylem lignification and hydrogel transport regulation.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 17555-17558Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar]. Lignins, complex aromatic heteropolymers, stiffen and fortify secondary cell walls within xylem tissues, creating a dense matrix that binds cellulose microfibrils [4Wainwright S.A. Biggs W.D. Currey J.D. Gosline J.M. Mechanical Design in Organisms. Princeton University Press, Princeton, NJ1982Google Scholar] and crosslinks other wall components [5Ralph J. Bunzel M. Marita J.M. Hatfield R.D. Lu F. Kim H. Schatz P.F. Grabber J.H. Steinhart H. Peroxidase-dependent cross-linking reactions of p-hydroxycinnamates in plant cell walls.Phytochem. Rev. 2004; 3: 79-96Crossref Scopus (203) Google Scholar], thereby preventing the collapse of conductive vessels, lending biomechanical support to stems, and allowing plants to adopt an erect-growth habit in air. Although “lignin-like” compounds have been identified in primitive green algae [6Delwiche C.F. Graham L.E. Thomson N. Lignin-like compounds and sporopollenin in Coleochaete, an algal model for land plant ancestry.Science. 1989; 245: 399-401Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 7Gunnison D. Alexander M. Basis for the resistance of several algae to microbial decomposition.Appl. Microbiol. 1975; 29: 729-738PubMed Google Scholar], the presence of true lignins in nonvascular organisms, such as aquatic algae, has not been confirmed [2Peter G. Neale D. Molecular basis for the evolution of xylem lignification.Curr. Opin. Plant Biol. 2004; 7: 737-742Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 3Boyce C.K. Zwieniecki M.A. Cody G.D. Jacobsen C. Wirick S. Knoll A.H. Holbrook N.M. Evolution of xylem lignification and hydrogel transport regulation.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 17555-17558Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 8Ragan M. Fucus ‘lignin’: a reassessment.Phytochemistry. 1984; 23: 2029-2032Crossref Scopus (19) Google Scholar, 9Lewis N.G. A 20th century roller coaster ride: a short account of lignification.Curr. Opin. Plant Biol. 1999; 2: 153-162Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar]. Here, we report the discovery of secondary walls and lignin within cells of the intertidal red alga Calliarthron cheilosporioides. Until now, such developmentally specialized cell walls have been described only in vascular plants. The finding of secondary walls and lignin in red algae raises many questions about the convergent or deeply conserved evolutionary history of these traits, given that red algae and vascular plants probably diverged more than 1 billion years ago.

Redesigning lignin, the aromatic polymer fortifying plant cell walls, to be more amenable to chemical depolymerization can lower the energy required for industrial processing. We have engineered poplar trees to introduce ester linkages into the lignin polymer backbone by augmenting the monomer pool with monolignol ferulate conjugates. Herein, we describe the isolation of a transferase gene capable of forming these conjugates and its xylem-specific introduction into poplar. Enzyme kinetics, in planta expression, lignin structural analysis, and improved cell wall digestibility after mild alkaline pretreatment demonstrate that these trees produce the monolignol ferulate conjugates, export them to the wall, and use them during lignification. Tailoring plants to use such conjugates during cell wall biosynthesis is a promising way to produce plants that are designed for deconstruction.

Abstract Tricin was recently discovered in lignin preparations from wheat (Triticum aestivum) straw and subsequently in all monocot samples examined. To provide proof that tricin is involved in lignification and establish the mechanism by which it incorporates into the lignin polymer, the 4′-O-β-coupling products of tricin with the monolignols (p-coumaryl, coniferyl, and sinapyl alcohols) were synthesized along with the trimer that would result from its 4′-O-β-coupling with sinapyl alcohol and then coniferyl alcohol. Tricin was also found to cross couple with monolignols to form tricin-(4′-O-β)-linked dimers in biomimetic oxidations using peroxidase/hydrogen peroxide or silver (I) oxide. Nuclear magnetic resonance characterization of gel permeation chromatography-fractionated acetylated maize (Zea mays) lignin revealed that the tricin moieties are found in even the highest molecular weight fractions, ether linked to lignin units, demonstrating that tricin is indeed incorporated into the lignin polymer. These findings suggest that tricin is fully compatible with lignification reactions, is an authentic lignin monomer, and, because it can only start a lignin chain, functions as a nucleation site for lignification in monocots. This initiation role helps resolve a long-standing dilemma that monocot lignin chains do not appear to be initiated by monolignol homodehydrodimerization as they are in dicots that have similar syringyl-guaiacyl compositions. The term flavonolignin is recommended for the racemic oligomers and polymers of monolignols that start from tricin (or incorporate other flavonoids) in the cell wall, in analogy with the existing term flavonolignan that is used for the low-molecular mass compounds composed of flavonoid and lignan moieties.

Numerous evolutionary innovations were required to enable freshwater green algae to colonize terrestrial habitats and thereby initiate the evolution of land plants (embryophytes). These adaptations probably included changes in cell-wall composition and architecture that were to become essential for embryophyte development and radiation. However, it is not known to what extent the polymers that are characteristic of embryophyte cell walls, including pectins, hemicelluloses, glycoproteins and lignin, evolved in response to the demands of the terrestrial environment or whether they pre-existed in their algal ancestors. Here we show that members of the advanced charophycean green algae (CGA), including the Charales, Coleochaetales and Zygnematales, but not basal CGA (Klebsormidiales and Chlorokybales), have cell walls that are comparable in several respects to the primary walls of embryophytes. Moreover, we provide both chemical and immunocytochemical evidence that selected Coleochaete species have cell walls that contain small amounts of lignin or lignin-like polymers derived from radical coupling of hydroxycinnamyl alcohols. Thus, the ability to synthesize many of the components that characterize extant embryophyte walls evolved during divergence within CGA. Our study provides new insight into the evolutionary window during which the structurally complex walls of embryophytes originated, and the significance of the advanced CGA during these events.

We demonstrate an experimental approach for upgrading lignin that has been isolated from corn stover via biomass fractionation using γ-valerolactone (GVL) as a solvent.