The rapid dissemination of carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) especially carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) poses a great threat to global public health. Ceftazidime-avibactam, a novel β-lactam/β-lactamase inhibitor combination, has been widely used due to its excellent antibacterial activity against KPC-producing K. pneumoniae. However, several resistance mechanisms have been reported since its use. Here, we conducted a series of in vitro experiments to reveal and demonstrate the dynamic evolution of ceftazidime-avibactam resistance including interspecies IncX3_NDM-5 plasmid transfer between E. cloacae and K. pneumoniae and blaKPC mutation from blaKPC-2 to blaKPC-33. Through the analysis of conjugation frequency and fitness cost, the IncX3_NDM-5 plasmid in this study showed strong transmissibility and stability in E. coli EC600 and clinical strain K. pneumoniae 5298 as recipient strain. With increasing ceftazidime-avibactam concentration, the conjugation frequency remained at 10−3-10−5, while the mutation frequency of K. pneumoniae 5298 was 10−6-10−8 at the same concentration. Further plasmid analysis (the IncX3_NDM plasmid from this study and other 658 plasmids from the NCBI database) revealed the diverse origin and genetic structure of blaNDM-5 carrying plasmids. E. coli (42.9%), China (43.9%), IncX3 (66.6%) are the most common strains, regions, and Inc types respectively. By analysing of genetic environment detected in IncX3 plasmids, the dominant structures (168/258, 65.1%) were identified: ISKox3-IS26-blaNDM-5-IS5-ISAba125-Tn3000-Tn3. In additon, several structural variations were found in the core gene structure. In conclusion, the high fitness and transmissibility of the IncX3_NDM-5 plasmids were noteworthy. More importantly, the diverse ceftazidime-avibactam resistance mechanisms including blaNDM-5 tranfer and blaKPC-2 mutation highlighted the importance of the continuous monitoring of antimicrobial susceptibility and carbapenemases subtype during ceftazidime-avibactam treatment.

Ceftazidime-avibactam resistance attributable to the blaKPC-2 gene mutation is increasingly documented in clinical settings. In this study, we characterized the mechanisms leading to the development of ceftazidime-avibactam resistance in ST11-K47 hypervirulent Klebsiella pneumoniae that harbored the blaKPC-135 gene. This strain possessed fimbriae and biofilm, demonstrating pathogenicity. Compared with the wild-type KPC-2 carbapenemase, the novel KPC-135 enzyme exhibited a deletion of Glu168 and Leu169 and a 15-amino acid tandem repeat between Val262 and Ala276. The blaKPC-135 gene was located within the Tn6296 transposon truncated by IS26 and carried on an IncFII/IncR-type plasmid. Compared to the blaKPC-2-positive cloned strain, only the MIC of ceftazidime increased against blaKPC-135-positive K. pneumoniae and wasn't inhibited by avibactam (MIC 32 μg/mL), while clavulanic acid and vaborbactam demonstrated some inhibition. Kinetic parameters revealed that KPC-135 exhibited a lower Km and kcat/Km with ceftazidime and carbapenems, and a higher (∼26-fold) 50% inhibitory concentration with avibactam compared to KPC-2. The KPC-135 enzyme exerted a detrimental effect on fitness relative to the wild-type strain. Furthermore, this strain possessed hypervirulent determinants, which included the IncHI1B/FIB plasmid with rmpA2 and expression of type 1 and 3 fimbriae. In conclusion, we reported a novel KPC variant, KPC-135, in a clinical ST11-K47 hypervirulent K. pneumoniae strain, which conferred ceftazidime-avibactam resistance, possibly through increased ceftazidime affinity and decreased avibactam susceptibility. This strain simultaneously harbored resistance and virulence genes, posing an elevated challenge in clinical treatment.