The most common cystic fibrosis mutation, ΔF508 in nucleotide binding domain 1 (NBD1), impairs cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-coupled domain folding, plasma membrane expression, function and stability. VX-809, a promising investigational corrector of ΔF508-CFTR misprocessing, has limited clinical benefit and an incompletely understood mechanism, hampering drug development. Given the effect of second-site suppressor mutations, robust ΔF508-CFTR correction most likely requires stabilization of NBD1 energetics and the interface between membrane-spanning domains (MSDs) and NBD1, which are both established primary conformational defects. Here we elucidate the molecular targets of available correctors: class I stabilizes the NBD1-MSD1 and NBD1-MSD2 interfaces, and class II targets NBD2. Only chemical chaperones, surrogates of class III correctors, stabilize human ΔF508-NBD1. Although VX-809 can correct missense mutations primarily destabilizing the NBD1-MSD1/2 interface, functional plasma membrane expression of ΔF508-CFTR also requires compounds that counteract the NBD1 and NBD2 stability defects in cystic fibrosis bronchial epithelial cells and intestinal organoids. Thus, the combination of structure-guided correctors represents an effective approach for cystic fibrosis therapy.

Based on its clinical benefits, Trikafta — the combination of folding correctors VX-661 (tezacaftor), VX-445 (elexacaftor), and the gating potentiator VX-770 (ivacaftor) — was FDA approved for treatment of patients with cystic fibrosis (CF) carrying deletion of phenylalanine at position 508 (F508del) of the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) on at least 1 allele. Neither the mechanism of action of VX-445 nor the susceptibility of rare CF folding mutants to Trikafta are known. Here, we show that, in human bronchial epithelial cells, VX-445 synergistically restores F508del-CFTR processing in combination with type I or II correctors that target the nucleotide binding domain 1 (NBD1) membrane spanning domains (MSDs) interface and NBD2, respectively, consistent with a type III corrector mechanism. This inference was supported by the VX-445 binding to and unfolding suppression of the isolated F508del-NBD1 of CFTR. The VX-661 plus VX-445 treatment restored F508del-CFTR chloride channel function in the presence of VX-770 to approximately 62% of WT CFTR in homozygous nasal epithelia. Substantial rescue of rare misprocessing mutations (S13F, R31C, G85E, E92K, V520F, M1101K, and N1303K), confined to MSD1, MSD2, NBD1, and NBD2 of CFTR, was also observed in airway epithelia, suggesting an allosteric correction mechanism and the possible application of Trikafta for patients with rare misfolding mutants of CFTR.

ABSTRACT Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in a chloride channel called the human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (hCFTR). We used cryo-EM global conformational ensemble reconstruction to characterize the mechanism by which the breakthrough drug VX445 (Elexacaftor) simultaneously corrects both protein-folding and channel-gating defects caused by CF mutations. VX445 drives hCFTR molecules harboring the gating-defective G551D mutation towards the open-channel conformation by binding to a site in the first transmembrane domain. This binding interaction reverses the usual pathway of allosteric structural communication by which ATP binding activates channel conductance, which is blocked by the G551D mutation. Our ensemble reconstructions include a 3.4 Å non-native structure demonstrating that detachment of the first nucleotide-binding domain of hCFTR is directly coupled to local unfolding of the VX445 binding site. Reversal of this unfolding transition likely contributes to its corrector activity by cooperatively stabilizing NBD1 and the transmembrane domains of hCFTR during biogenesis. Summary Cryo-EM global conformational ensemble reconstruction has been used to characterize the mechanism-of-action of a breakthrough pharmaceutical that corrects fatal protein-folding and channel-gating defects in the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).

Abstract Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has become the most powerful tool to resolve the high-resolution structures of biomacromolecules in solution. However, the air-water interface induced preferred orientation, dissociation or denaturation of biomacromolecules during cryo-vitrification is still a major limitation factor for many specimens. To solve this bottleneck, we developed a new type of cryo-EM support film using the 2D crystal of hydrophobin I (HFBI) protein. The HFBI-film utilizes its hydrophilic side to adsorb protein particles via electrostatic interactions and keep air-water interface away, allowing thin-enough ice and high-quality data collection. The particle orientation distribution can be optimized by changing the buffer pH. We, for the first time, solved the cryo-EM structure of catalase (2.28-Å) that exhibited strong preferred orientation using conventional cryo-vitrification protocol. We further proved the HFBI-film is suitable to solve the high-resolution structures of small proteins including aldolase (150 kDa, 3.34-Å) and hemoglobin (64 kDa, 3.6-Å). Our work implied that the HFBI-film will have a wide application in the future to increase the successful rate and efficiency of cryo-EM.

Abstract As a promising approach for breast cancer treatment, photothermal therapy (PTT) features high spatial selectivity, noninvasiveness, and minimal drug resistance. IR780 (a near‐infrared fluorescent dye) serves as an effective photosensitizer in PTT cancer therapy. However, the clinical application of IR780 in PTT has been hindered by its poor water solubility and unstable photostability. In this study, a genetically engineered dual‐functional fusion protein tLyP‐1‐MGF6 is successfully constructed and expressed, which presents a novel use of hydrophobin MGF6 for its amphiphilicity combined with the tumor‐penetrating peptide tLyP‐1 to create an innovative carrier for IR780. These results show this fusion protein serving as a biodegradable and biocompatible carrier, significantly improves the water solubility of IR780 when formulated into nanoparticles. These studies demonstrate that the IR780@tLyP‐1‐MGF6 nanoparticles significantly enhance tumor targeting and photothermal therapeutic efficacy in comparison with control in vitro and in vivo. These advancements highlight the potential of the unique combination hydrophobin‐based IR780 delivery system as a multifunctional nanoplatform for integrated imaging and targeted photothermal treatment of breast cancer.

Abstract The defence mechanisms against endo-lysosomal homeostasis stress remain incompletely understood. Here, we identify Ubr1 as a protein quality control (QC) ubiquitin ligase that counteracts proteostasis stress by enhancing cargo selective autophagy for lysosomal degradation. Astrocyte regulatory cluster membrane protein MLC1 mutations increased intracellular Ca 2+ and caused endosomal compartment stress by fusion and enlargement. Endosomal protein QC pathway using ubiquitin QC ligases CHIP and Ubr1 with ESCRT-machinery was able to target only a fraction of MLC1-mutants for lysosomal degradation. As a consequence of the endosomal stress, we found an alternative QC route dependent on Ubr1, SQSTM1/p62 and arginylation to bypass MLC1-mutants to endosomal autophagy (endo-phagy). Significantly, this unfolded a general biological endo-lysosomal QC pathway for arginylated Ubr1-SQSTM1/p62 autophagy targets during Ca 2+ -assault. Conversely, the loss of Ubr1 with the absence of arginylation elicited endosomal compartment stress. These findings underscore the critical housekeeping role of Ubr1-dependent endo-phagy/autophagy in constitutive and provoked endo-lysosomal proteostasis stress, and link Ubr1 to Ca 2+ -homeostasis and proteins implicated in various diseases including cancers and brain disorders.

The folding/misfolding and pharmacological rescue of multidomain ATP-binding cassette (ABC) C-subfamily transporters, essential for organismal health, remain incompletely understood. The ABCC transporters core consists of two nucleotide binding domains (NBD1,2) and transmembrane domains (TMD1,2). Using molecular dynamic simulations, biochemical and hydrogen deuterium exchange approaches, we show that the mutational uncoupling or stabilization of NBD1-TMD1/2 interfaces can compromise or facilitate the CFTR(ABCC7)-, MRP1(ABCC1)-, and ABCC6-transporters posttranslational coupled domain-folding in the endoplasmic reticulum. Allosteric or orthosteric binding of VX-809 and/or VX-445 folding correctors to TMD1/2 can rescue kinetically trapped CFTR post-translational folding intermediates of cystic fibrosis (CF) mutants of NBD1 or TMD1 by global rewiring inter-domain allosteric-networks. We propose that dynamic allosteric domain-domain communications not only regulate ABCC-transporters function but are indispensable to tune the folding landscape of their post-translational intermediates. These allosteric networks can be compromised by CF-mutations, and reinstated by correctors, offering a framework for mechanistic understanding of ABCC-transporters (mis)folding.

Apical polarity of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is essential for solute and water transport in secretory epithelia and can be impaired in human diseases. Maintenance of apical polarity in the face of CFTR non-polarized delivery and compromised apical retention of mutant CFTRs lacking PDZ-domain protein (NHERF1) interaction, remains enigmatic. Here we show that basolateral CFTR delivery originates from biosynthetic (~35%) and endocytic (~65%) recycling missorting. Basolateral channels are retrieved via basolateral-to-apical transcytosis, enhancing CFTR apical expression by two-fold and suppressing its degradation. CFTR transcytosis is microtubule-dependent but independent of Myo5B-, Rab11- and NHERF1 binding to its C-terminal DTRL motif in airway epithelia. Increased basolateral delivery due to compromised apical recycling and accelerated internalization upon impaired NHERF1-CFTR association is largely counterbalanced by CFTR efficient basolateral internalization and apical transcytosis. Thus, transcytosis represents a previously unrecognized but indispensable mechanism for maintaining CFTR apical polarity by attenuating its constitutive and mutation-induced basolateral missorting.

Bacterial cellulose (BC) has been found extensive applications in diverse domains for its exceptional attributes. However, the lack of antibacterial properties hampers its utilization in food and biomedical sectors. Leucocin, a bacteriocin belonging to class IIa, is synthesized by Leuconostoc that demonstrates potent efficacy against the foodborne pathogen, Listeria monocytogenes. In the current study, co-culturing strategy involving Kosakonia oryzendophytica FY-07 and Leuconostoc carnosum 4010 was used to confer anti-listerial activity to BC, which resulted in the generation of leucocin-containing BC (BC-L). The physical characteristics of BC-L, as determined by X-ray diffraction (XRD), Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), and thermogravimetric analysis (TGA), were similar to the physical characteristics of BC. Notably, the experimental results of disc diffusion and growth curve indicated that the BC-L film exhibited a potent inhibitory effect against L. monocytogenes. Scanning electron microscopy (SEM) showed that BC-L exerts its bactericidal activity by forming pores on the bacterial cell wall. Despite the BC-L antibacterial mechanism, which involves pore formation, the mammalian cell viability remained unaffected by the BC-L film. The measurement results of zeta potential indicated that the properties of BC changed after being loaded with leucocin. Based on these findings, the anti-listerial BC-L generated through this co-culture system holds promise as a novel effective antimicrobial agent for applications in meat product preservation and packaging.