Abstract Objective To analyze the clinical and immunologic manifestations of antiphospholipid syndrome (APS) in a large cohort of patients and to define patterns of disease expression. Methods The clinical and serologic features of APS (Sapporo preliminary criteria) in 1,000 patients from 13 European countries were analyzed using a computerized database. Results The cohort consisted of 820 female patients (82.0%) and 180 male patients (18.0%) with a mean ± SD age of 42 ± 14 years at study entry. “Primary” APS was present in 53.1% of the patients; APS was associated with systemic lupus erythematosus (SLE) in 36.2%, with lupus‐like syndrome in 5.0%, and with other diseases in 5.9%. A variety of thrombotic manifestations affecting the majority of organs were recorded. A catastrophic APS occurred in 0.8% of the patients. Patients with APS associated with SLE had more episodes of arthritis and livedo reticularis, and more frequently exhibited thrombocytopenia and leukopenia. Female patients had a higher frequency of arthritis, livedo reticularis, and migraine. Male patients had a higher frequency of myocardial infarction, epilepsy, and arterial thrombosis in the lower legs and feet. In 28 patients (2.8%), disease onset occurred before age 15; these patients had more episodes of chorea and jugular vein thrombosis than the remaining patients. In 127 patients (12.7%), disease onset occurred after age 50; most of these patients were men. These patients had a higher frequency of stroke and angina pectoris, but a lower frequency of livedo reticularis, than the remaining patients. Conclusion APS may affect any organ of the body and display a broad spectrum of manifestations. An association with SLE, the patient's sex, and the patient's age at disease onset can modify the disease expression and define specific subsets of APS.

SummaryOne of the conclusions of the subcommittee meeting on Lupus Anticoagulant/Phospholipid dependent antibodies, held in Geneva on 2007, was the need to update the guidelines on Lupus Anticoagulant (LA) detection. Particular emphasis was given to several aspects discussed in this official communication. A new paragraph is dedicated to the patient selection, and aims to minimize inappropriate requests for LA testing. Modalities for blood collection and processing are fully delineated and the choice of tests is limited to dRVVT and a sensitive aPTT. Calculation of cut‐off values for each diagnostic step are clearly stated. A final paragraph reports the interpretation of the results in general and in particular situations. One of the conclusions of the subcommittee meeting on Lupus Anticoagulant/Phospholipid dependent antibodies, held in Geneva on 2007, was the need to update the guidelines on Lupus Anticoagulant (LA) detection. Particular emphasis was given to several aspects discussed in this official communication. A new paragraph is dedicated to the patient selection, and aims to minimize inappropriate requests for LA testing. Modalities for blood collection and processing are fully delineated and the choice of tests is limited to dRVVT and a sensitive aPTT. Calculation of cut‐off values for each diagnostic step are clearly stated. A final paragraph reports the interpretation of the results in general and in particular situations. These guidelines are intended to update the criteria for the detection of the presence of lupus anticoagulants (LA) that were originally proposed by Brandt et al. in 1995 [1Brandt J.T. Triplett D.A. Alving B. Scharrer I. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the ISTH.Thromb Haemost. 1995; 74: 1185-90Crossref PubMed Scopus (1311) Google Scholar]. The subcommittee on Lupus Anticoagulant/Phospholipid‐dependent Antibodies acknowledges that the present guidelines have been extremely useful during the past 13 years but that it is now appropriate to provide additional details and specifications in light of the knowledge and experience that has been accumulated since their publication. Testing for LA should be limited to patients who have a significant probability of having the antiphospholipid syndrome (APS), or who have unexplained prolonged aPTT in the course of routine laboratory testing. Appropriateness to search for LA can be graded according to clinical characteristics into low, moderate and high. Low: venous (VTE) or arterial thromboembolism in elderly patients; Moderate: accidentally found prolonged aPTT in asymptomatic subjects, recurrent spontaneous early pregnancy loss, provoked VTE in young patients; and High: unprovoked VTE and (unexplained) arterial thrombosis in young patients (< 50 years of age), thrombosis at unusual sites, late pregnancy loss, any thrombosis or pregnancy morbidity in patients with autoimmune diseases (systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, autoimmune thrombocytopenia, autoimmune hemolytic anaemia) [2Miyakis S. Lockshin M.D. Atsumi T. Branch D.W. Brey R.L. Cervera R. Derksen R.H.W.M. De Groot P.G. Koike T. Meroni P.L. Reber G. Shoenfeld Y. Tincani A. Vlachoyiannopoulos P.G. Krilis S.A. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS).J Thromb Haemost. 2006; 4: 295-306Crossref PubMed Scopus (5503) Google Scholar]. Generalized searches performed on blood samples obtained from asymptomatic individuals or categories of patients other than described here are highly discouraged to avoid the risk of obtaining false‐positive results that are relatively common on account of the poor specificity of the assays. Once a patient has been identified as positive for LA, it is imperative that testing be repeated on a second occasion > 12 weeks after the initial testing. It is preferable for samples to be obtained prior to, or in the absence of, anticoagulant therapy as this may interfere with the assay. Recommendations of the subcommittee are summarized in Table 1. How to determine and interpret cut‐off values is described in Table 2.Table 1Recommendations for the optimal laboratory detection of lupus anticoagulant (LA)*(A) Blood collection 1. Blood collection before the start of any anticoagulant drug or a sufficient period after its discontinuation 2. Fresh venous blood in 0.109 m sodium citrate 9:1 3. Double centrifugation 4. Quickly frozen plasma is required if LA detection is postponed 5. Frozen plasma must be thawed at 37 °C(B) Choice of the test 1. Two tests based on different principles 2. dRVVT should be the first test considered 3. The second test should be a sensitive aPTT (low phospholipids and silica as activator) 4. LA should be considered as positive if one of the two tests gives a positive result 5. For interpretation see Table 2 (screening test)(C) Mixing test 1. PNP for mixing studies should ideally be prepared in house. Adequate commercial lyophilized or frozen PNP can alternatively be used 2. A 1:1 proportion of patient : PNP shall be used, without preincubation within 30 min. 3. LA can not be conclusively determined if the TT of the test plasma is significantly prolonged 4. For interpretation see Table 2 (mixing test)(D) Confirmatory test 1. Confirmatory test(s) must be performed by increasing the concentration of PL of the screening test(s) 2. Bilayer or hexagonal (II) phase PL should be used to increase the concentration of PL. 3. For interpretation see Table 2 (confirmatory test)(E) Expression of results 1. Results should be expressed as ratio of patient‐to‐PNP for all procedures (screening, mixing and confirm)(F) Transmission of results 1. A report with an explanation of the results should be given*Further explanations and qualifications are reported in the text.PNP, pooled normal plasma; TT, thrombin time; PL, phospholipids Open table in a new tab Table 2Cut‐off values for lupus anticoagulant (LA) detection*Cut‐off valuesScreening test How should this be determined 1. Perform testing on plasmas from healthy donors 2. Take the cut‐off as the value above the 99th percentile of the distribution Interpretation 1. Results of screening tests are potentially suggestive of LA when their clotting times are longer than the local cut‐off valueMixing test How should this be determined 1. Perform testing on plasmas from healthy donors mixed with the pooled normal plasma (PNP) at 1:1 proportion. Testing should be performed without pre‐incubation within 30 min 2. Take the cut‐off as the value above the 99th percentile of the distribution 3. Alternatively, the cut‐off may be the value of the ICA defined according to the equation: ICA = [(b − c)/a] × 100, where a, b and c are the clotting times of the patient plasma, mixture and normal plasma, respectively [16Rosner E. Pauzner R. Lusky A. Modan M. Many A. Detection and quantitative evaluation of lupus circulating anticoagulant activity.Thromb Haemost. 1987; 57: 144-7Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar] Interpretation 1. Results of mixing tests are suggestive of LA when their clotting times are longer than the local cut‐off value, or when the ICA is greater than the local cut‐off valueConfirmatory test How should this be determined 1. Perform testing on plasmas from healthy donors at low (screen) and high (confirm) phospholipid concentration 2. Take the cut‐off as the value corresponding to the mean of the individual % corrections calculated as defined by the equation [(screen − confirm)/screen] × 100† Interpretation 1. Results are confirmatory of LA if the % correction is above the local cut‐off value*Testing described above must be performed with the local reagent/coagulometer combination on plasmas from at least 40 adult healthy donors less than 50 years of age. Do not use cut‐off values established elsewhere even although they refer to the same method and coagulometer.†The clotting time of the confirmatory test in LA positive samples is not always shortened to within the normal range of controls. To avoid false‐negative results, the Subcommittee recommends confirmatory tests to be performed in all the normal controls and to use the mean of obtained clotting times to calculate the percentage of shortening. This percentage can be used as a cut‐off value.ICA, index of circulating anticoagulant. Open table in a new tab *Further explanations and qualifications are reported in the text. PNP, pooled normal plasma; TT, thrombin time; PL, phospholipids *Testing described above must be performed with the local reagent/coagulometer combination on plasmas from at least 40 adult healthy donors less than 50 years of age. Do not use cut‐off values established elsewhere even although they refer to the same method and coagulometer. †The clotting time of the confirmatory test in LA positive samples is not always shortened to within the normal range of controls. To avoid false‐negative results, the Subcommittee recommends confirmatory tests to be performed in all the normal controls and to use the mean of obtained clotting times to calculate the percentage of shortening. This percentage can be used as a cut‐off value. ICA, index of circulating anticoagulant. Numerous variables can affect assays used for LA detection. Among them, the content and type of phospholipids (PL) in the reagent mixture, activator, plasma preparation, expression of results and cut‐off values greatly influence the results. Moreover, as the spectrum of antibodies and their epitope specificity may vary widely, reference material constitutes a major problem. As a consequence a high variability in the performance of clinical laboratories with respect to sensitivity and specificity of LA tests has recently been reported [3Tripodi A. Biasiolo A. Chantarangkul V. Pengo V. Lupus anticoagulant (LA) testing: performance of clinical laboratories assessed by a national survey using lyophilized affinity‐purified immunoglobulin with LA activity.Clin Chem. 2003; 49: 1608-14Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 4Jennings I. Kitchen S. Woods T.A. Preston F.E. Greaves M. Potentially clinically important inaccuracies in testing for the lupus anticoagulant: an analysis of results from three surveys of the UK National External Quality Assessment Scheme (NEQAS) for Blood Coagulation.Thromb Haemost. 1997; 77: 934-7Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar, 5Favaloro E.J. Bonar R. Sioufi J. Wheeler M. Low J. Aboud M. Duncan E. Smith J. Exner T. Lloyd J. Marsden K. Multilaboratory testing of thrombophilia: current and past practice in Australasia as assessed through the Royal College of Pathologists of the Australasia Quality Assurance Programs for Hematology.Semin Thromb Haemost. 2005; 31: 49-58Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 6Arnout J. Meijer P. Vermylen J. Lupus anticoagulant testing in Europe: an analysis of results from the first European Concerted Action on Thrombophilia (ECAT) survey using plasmas spiked with monoclonal antibodies against human beta2‐glycoprotein I.Thromb Haemost. 1999; 81: 929-34Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar, 7Pengo V. Biasiolo A. Gresele P. Marongiu F. Erba N. Veschi F. Ghirarduzzi A. De Candia E. Montaruli B. Testa S. Barcellona D. Tripodi A. on behalf of participating centers of Italian Federation of Thrombosis Centers (FCSA)Survey on lupus anticoagulant diagnosis by central evaluation of positive plasma samples.J Thromb Haemost. 2007; 5: 925-30Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar]. The rates of false‐positive and false‐negative detections remain relatively high. The former are of particular concern because they qualify the patients for long and unnecessary oral anticoagulant treatment [7Pengo V. Biasiolo A. Gresele P. Marongiu F. Erba N. Veschi F. Ghirarduzzi A. De Candia E. Montaruli B. Testa S. Barcellona D. Tripodi A. on behalf of participating centers of Italian Federation of Thrombosis Centers (FCSA)Survey on lupus anticoagulant diagnosis by central evaluation of positive plasma samples.J Thromb Haemost. 2007; 5: 925-30Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar]. A3: Double centrifugation of the sample should be performed to ensure that the sample is platelet poor. This can be achieved by transferring the plasma after the initial centrifugation process (2000 g, 15 min, room temperature) to a non‐activating plastic centrifuge tube using a plastic pipette, then recentrifuging the plasma for an additional 10 min at a higher speed (> 2500 g). When aliquoting to a secondary tube, take care to not include the residual platelets that may have collected at the bottom of the centrifuge tube [8Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma‐Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline – Fifth Edition. 2008Google Scholar]. Plasma filtration is not recommended as this introduces variables (type of filter, amount of plasma to be filtered, loss of von Willebrand factor and added costs [9Favaloro E.J. Preanalytical variables in coagulation testing.Blood Coagul Fibrinolysis. 2007; 18: 86-9Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar]. Moreover, the problems of filters availability and adjunctive costs must be considered. A4: Freezing of the samples must be performed as quickly as possible after venipuncture to prevent loss of coagulation factors. Freezing the plasma in a freezer at −70 °C or below is reasonable. A5: Before analysis, frozen plasma must be thawed by total immersion of sample content in a water bath at 37 °C for 5 min to avoid formation of cryoprecipitate and then mixed thoroughly before testing. B1: The risk of false‐positive results is increased to an unacceptable level if more than two screening tests are performed. B2: There is evidence that no single test is sensitive for all LA. The recommendation is to perform two different tests that represent different assay principles. Diluted Russell Viper Venom time (dRVVT) is widely used in clinical laboratories and is believed to be specific for detecting LA in those patients at high risk of thrombosis [10Galli M. Finazzi G. Bevers E.M. Barbui T. Kaolin clotting time and dilute Russell viper venom time distinguish between prothrombindependent and beta 2‐glycoprotein I‐dependent antiphospholipid antibodies.Blood. 1995; 86: 617-23Crossref PubMed Google Scholar]. An international External Quality Assessment Programme for laboratories working in the field of thrombosis showed that dRVVT is the most robust test in detecting LA [11Urbanus R.T. Derksen R.H. De Groot P.G. Current insight into diagnostics and pathophysiology of the antiphospolipid syndrome.Blood Rev. 2008; 2: 93-105Crossref Scopus (79) Google Scholar]. B3: Any aPTT test performed with silica as an activator and low PL content is the second test of choice because of its sensitivity [3Tripodi A. Biasiolo A. Chantarangkul V. Pengo V. Lupus anticoagulant (LA) testing: performance of clinical laboratories assessed by a national survey using lyophilized affinity‐purified immunoglobulin with LA activity.Clin Chem. 2003; 49: 1608-14Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 6Arnout J. Meijer P. Vermylen J. Lupus anticoagulant testing in Europe: an analysis of results from the first European Concerted Action on Thrombophilia (ECAT) survey using plasmas spiked with monoclonal antibodies against human beta2‐glycoprotein I.Thromb Haemost. 1999; 81: 929-34Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar] for LA. Kaolin as an activator is not recommended because of its problematic behaviour in automated coagulometers. Ellagic acid as an activator is not recommended as a result of its insensitivity for LA. The Subcommittee does not recommend the following tests: dilute prothrombin time (dPT) because of variability in thromboplastin reagents; assays based on snake venoms such as Ecarin and Textarin because there are no standardized commercial assays available based on this principle; Kaolin Clotting Time (KCT) as a result of its poorer reproducibility compared with the other tests available [11Urbanus R.T. Derksen R.H. De Groot P.G. Current insight into diagnostics and pathophysiology of the antiphospolipid syndrome.Blood Rev. 2008; 2: 93-105Crossref Scopus (79) Google Scholar]. C1: The pooled normal plasma (PNP) should be prepared ‘ad hoc’ (home‐made) by double centrifugation to ensure that the PNP contains minimal residual platelets (< 107 mL−1) and to ensure approximately 100% activity for all clotting factors. The material must be stored frozen (−70 °C) in small aliquots. Commercial lyophilized or frozen normal plasmas can be used if they fulfill the above specifications or have otherwise been validated for use in LA testing. When testing for LA during pregnancy, normal range(s) of clotting times defined for normal pregnant women should be considered (aPTT is, in general, shortened as a result of high factor VIII levels during pregnancy, but also dRVVT can change for unknown reasons). No reference plasma is available. Therefore, established positive and negative plasmas should be used as controls to validate the assay. C3: The coagulation time of a mixing test could also be prolonged because of the presence of heparin or inhibitors to coagulation factors. The thrombin time (TT) performed on test plasma or the clinical history of bleeding will help to identify heparin or specific inhibitors to clotting factors, respectively. LA screening is not possible if the test plasma is unclottable or if the content of heparin in the test plasma exceeds the reagent neutralization capacity. There are commercial dRVVTs and APTTs containing neutralizers able to quench heparin up to 0.8 U mL−1. Although limited experience is available on the effect of low‐molecular‐weight heparin (LMWH), screening for LA in patients treated with LMWH is possible. It should, however, be noted that the effect on LA assays may vary depending on the ratio between factor (F) Xa to FIIa activity of each LMWH preparation. The effect of direct thrombin or FXa inhibitors on LA assays is unknown. Whereas hydroxychloroquine may weakly interfere with LA testing directly affecting the formation of IgG‐ß2GPI complexes on phospholipid bilayers [12Rand J.H. Wu X.X. Quinn A.S. Chen P.P. Hathcock J.J. Taatjes D.J. Hydroxychloroquine directly reduces the binding of antiphospholipid antibody‐beta2‐glycoprotein I complexes to phospholipid bilayers.Blood. 2008; 112: 1687-95Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar], aspirin and clopidogrel do not interfere. D2: Freeze/thawed platelets are not recommended as the source of PL for the confirmatory tests because of poor batch‐to‐batch consistency. F1: LA test results should be reported with quantitative results, and an interpretative comment that indicates whether the findings are compatible with the presence/absence of LA. This is important as many clinicians may not be aware of the significance of all the complex testing procedures carried out by the laboratory. Comments such as borderline or dubious LA are highly discouraged and in these cases the comment should be limited to the following: ‘to be tested again in 1 week’. Integrated tests include screening and confirmation in a single procedure. Such tests consist of testing the plasmas under investigation twice by means of the dRVVT [13Tripodi A. Chantarangkul V. Clerici M. Mannucci P.M. Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment: performance of dilute Russell viper venom test and silica clotting time in comparison with Staclot LA.Thromb Haemost. 2002; 88: 583-6Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar] or APTT [13Tripodi A. Chantarangkul V. Clerici M. Mannucci P.M. Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment: performance of dilute Russell viper venom test and silica clotting time in comparison with Staclot LA.Thromb Haemost. 2002; 88: 583-6Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 14Triplett D.A. Barna L.K. Unger G.A. A hexagonal (II) phase phospholipids neutralization assay for lupus anticoagulant identification.Thromb Haemost. 1993; 70: 787-93Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar] performed in parallel at low (screen) and high (confirm) phospholipid concentrations. In principle, these tests do not require performance of the mixing test and the results may be interpreted according to the specific cut‐off values by calculating either the percentage correction [(screen − confirm)/screen × 100] [13Tripodi A. Chantarangkul V. Clerici M. Mannucci P.M. Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment: performance of dilute Russell viper venom test and silica clotting time in comparison with Staclot LA.Thromb Haemost. 2002; 88: 583-6Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar] or the LA ratio (screen/confirm) [15Jacobsen E.M. Barna‐Cler L. Taylor J.M. Triplett D.A. Wisloff F. The Lupus Ratio test: an interlaboratory study on the detection of Lupus anticoagulants by an APTT‐based, integrated, and semiquantitative test. Fifth International Survey of Lupus Anticoagulants ISLA 5.Thromb Haemost. 2000; 83: 704-8Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar]. Both the percentage correction and the LA ratio may benefit from normalization of results against a PNP run in parallel with the test plasmas [(screen/confirm) patient divided by (screen/confirm) PNP]. Some of the above tests are designed to measure the coagulation times on a mixture of patient and PNP [14Triplett D.A. Barna L.K. Unger G.A. A hexagonal (II) phase phospholipids neutralization assay for lupus anticoagulant identification.Thromb Haemost. 1993; 70: 787-93Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar]. Caution should be exercised in interpretation of the results of tests performed close to a thromboembolic event as patients may be treated with full doses of unfractionated heparin and/or vitamin K antagonists (VKA). Furthermore, acute‐phase reactants as FVIII may be increased during acute events. A LA result should always be considered in the context of a full laboratory aPL profile comprising anticardiolipin (aCL) and antiβ2glycoprotein I (aβ2GPI) antibodies ELISAs. The presence of medium‐high titers aCL and aβ2GPI of the same isotype (most often IgG) is in agreement with a positive LA and identifies patients at high risk for thrombosis. Less information is available for the correlations with fetal losses. Isolated LA positivity is significantly more frequent in subjects without clinical events [19Pengo V. Biasiolo A. Gresele P. Marongiu F. Erba N. Veschi F. Ghirarduzzi A. Barcellona D. Tripodi A. A comparison of lupus anticoagulant‐positive patients with clinical picture of antiphospholipid syndrome and those without.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007; 27: 309-10Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar] or may be false‐positive especially if identified as ‘mild in potency’, if it is found in elderly patients or if it is diagnosed for the first time [7Pengo V. Biasiolo A. Gresele P. Marongiu F. Erba N. Veschi F. Ghirarduzzi A. De Candia E. Montaruli B. Testa S. Barcellona D. Tripodi A. on behalf of participating centers of Italian Federation of Thrombosis Centers (FCSA)Survey on lupus anticoagulant diagnosis by central evaluation of positive plasma samples.J Thromb Haemost. 2007; 5: 925-30Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar]. 1The interpretation of results is difficult because of the prolonged basal clotting time. To avoid misinterpretation, it is recommended to perform laboratory procedures 1 to 2 weeks after discontinuation of treatment or when the international normalized ratio (INR) is less than 1.5. Bridging VKA discontinuation with LMWH is recommended with the last dose of LMWH administered more than 12 h before the blood is drawn for LA testing.2Alternatively, if the INR is between 1.5 and < 3.0, a 1:1 dilution of patient plasma and PNP can be considered. Note, that the interpretation of results may still be difficult and that the LA titer will be diluted 2‐fold.3Detection procedures by Textarin(Taipan)/Ecarin clotting times [17Triplett D.A. Stocker K.F. Unger G.A. Barna L.K. The Textarin/Ecarin ratio: a confirmatory test for lupus anticoagulants.Thromb Haemost. 1993; 70: 925-31Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar, 18Moore G.W. Smith M.P. Savidge G.F. The Ecarin time is an improved confirmatory test for the Taipan snake venom time in warfarinized patients with lupus anticoagulants.Blood Coagul Fibrinolysis. 2003; 14: 307-12Crossref PubMed Google Scholar] or integrated tests (i.e. % correction for APTT, SCT and dRVVT at low and high phospholipid concentration) [13Tripodi A. Chantarangkul V. Clerici M. Mannucci P.M. Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment: performance of dilute Russell viper venom test and silica clotting time in comparison with Staclot LA.Thromb Haemost. 2002; 88: 583-6Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar] are not currently recommended as they require further critical evaluation. The authors state that they have no conflict of interest. The authors would like to thank the following colleagues who helped in writing these guidelines with suggestions and comments: Katrien M.J Devreese, Ghent, Belgium; Annie Robert, Paris, France; Alicia N Blanco, Buenos Aires, Argentina; Beatriz E Grand, CABA, Argentina; Ricardo Forastiero, Buenos Aires, Argentina; Tatsuya Atsumi, Sapporo, Japan; Galit Sarig, Haifa, Israel; E Favaloro, Westmead, Australia; Veena Chantarangkul, Milano, Italy.

To assess the prevalence of the main causes of morbi-mortality in the antiphospholipid syndrome (APS) during a 10-year-follow-up period and to compare the frequency of early manifestations with those that appeared later.In 1999, we started an observational study of 1000 APS patients from 13 European countries. All had medical histories documented when entered into the study and were followed prospectively during the ensuing 10 years.53.1% of the patients had primary APS, 36.2% had APS associated with systemic lupus erythematosus and 10.7% APS associated with other diseases. Thrombotic events appeared in 166 (16.6%) patients during the first 5-year period and in 115 (14.4%) during the second 5-year period. The most common events were strokes, transient ischaemic attacks, deep vein thromboses and pulmonary embolism. 127 (15.5%) women became pregnant (188 pregnancies) and 72.9% of pregnancies succeeded in having one or more live births. The most common obstetric complication was early pregnancy loss (16.5% of the pregnancies). Intrauterine growth restriction (26.3% of the total live births) and prematurity (48.2%) were the most frequent fetal morbidities. 93 (9.3%) patients died and the most frequent causes of death were severe thrombosis (36.5%) and infections (26.9%). Nine (0.9%) cases of catastrophic APS occurred and 5 (55.6%) of them died. The survival probability at 10 years was 90.7%.Patients with APS still develop significant morbidity and mortality despite current treatment. It is imperative to increase the efforts in determining optimal prognostic markers and therapeutic measures to prevent these complications.

The endothelium expresses a large repertoire of genes under apparent transcriptional control of biomechanical forces, many of which are neither cell-type nor flow specific. We set out to identify genes that are uniquely flow responsive in human vascular endothelial cells. Transcriptional profiling using commercial DNA microarrays identified 12 of 18 000 genes that were modulated at least 5-fold after 24 hours of steady laminar flow (25 dyne/cm2). After a 7-day exposure to unidirectional pulsatile flow (19 ± 12 dyne/cm2), only 3 of 12 remained elevated at least 5-fold. A custom microarray of ∼300 vascular cell–related gene fragments was constructed, and expression analysis revealed that many flow-induced genes are also induced by at least one of the following agents: tumor necrosis factor–α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), transforming growth factor-β, vascular endothelial growth factor, or thrombin, indicating a more general role in adaptive or stress responses. Most flow-induced genes were also induced by TNF-α but not IL-1β, suggesting the involvement of reactive oxygen species. A limited panel of genes that are unique for flow-exposed cultures was identified, including lung Krüppel-like factor (LKLF/KLF2) and cytochrome P450 1B1 (CYP1B1). In marked contrast, both these genes were substantially repressed by TNF-α. LKLF but not CYP1B1 mRNA was detected exclusively in the vascular endothelium of healthy human aorta by in situ hybridization and appeared to be flow regulated. To date LKLF is the first endothelial transcription factor that is uniquely induced by flow and might therefore be at the molecular basis of the physiological healthy, flow-exposed state of the endothelial cell.

Cirrhosis of the liver is frequently accompanied by complex alterations in the hemostatic system, resulting in a bleeding tendency. Although many hemostatic changes in liver disease promote bleeding, compensatory mechanisms also are found, including high levels of the platelet adhesive protein von Willebrand Factor (VWF). However, conflicting reports on the functional properties of VWF in cirrhosis have appeared in literature. We have measured a panel of VWF parameters in plasma from patients with cirrhosis of varying severity and causes. Furthermore, we assessed the contribution of VWF to platelet adhesion, by measuring the ability of plasma from patients with cirrhosis to support adhesion of normal or patient platelets under flow conditions. VWF antigen levels were strongly increased in patients with cirrhosis. In contrast, the relative collagen binding activity, as well as the relative ristocetin cofactor activity, was significantly lower in patients as compared with controls, indicating loss of function. Accordingly, patients had a reduced fraction of high-molecular-weight VWF multimers. Both strongly elevated and reduced activity and antigen levels of the VWF cleaving protease ADAMTS13 were found in individual patients. Adhesion of either normal or patient platelets to a collagen surface was substantially increased when these platelets were resuspended in plasma of patients with cirrhosis, as compared with control plasma. In conclusion, highly elevated levels of VWF in patients with cirrhosis contribute to the induction of primary hemostasis despite reduced functional properties of the molecule. This phenomenon might compensate for defects in platelet number and function in patients with cirrhosis. (HEPATOLOGY 2006;44:53–61.)

Transient interactions of platelet-receptor glycoprotein Ibα (GpIbα) and the plasma protein von Willebrand factor (VWF) reduce platelet velocity at sites of vascular damage and play a role in haemostasis and thrombosis. Here we present structures of the GpIbα amino-terminal domain and its complex with the VWF domain A1. In the complex, GpIbα wraps around one side of A1, providing two contact areas bridged by an area of solvated charge interaction. The structures explain the effects of gain-of-function mutations related to bleeding disorders and provide a model for shear-induced activation. These detailed insights into the initial interactions in platelet adhesion are relevant to the development of antithrombotic drugs.

Abstract Despite many studies on the pathophysiology of antiphospholipid antibodies (aPL), the mechanism by which aPL causes thrombosis has not been established. We have tried to elucidate the paradox between the prolongation of the clotting time of phospholipid-dependent coagulation tests in vitro and the occurrence of thrombosis in vivo. The effect on endothelial cell-mediated prothrombinase activity of 30 IgG fractions, of which 22 prolong the aPTT of normal plasma, was investigated. Only 4 of 22 fractions (18%) inhibited prothrombinase activity when tested on this more physiologic phospholipid surface, indicating that in most patients with aPL the prolongation of clotting tests is predominantly as in vitro phenomenon. It was recently reported that in detection methods for aPL, two plasma proteins, beta 2-glycoprotein I and prothrombin, enhance the binding of aPL to phospholipids. We have studied the specificity of the 4 IgG fractions that inhibit the prothrombinase activity and found that they were directed against a combination of phospholipids and prothrombin. However, the involvement of prothrombin in binding of aPL leading to impaired thrombin generation could still result in both a bleeding and a thrombotic tendency. Therefore, we proposed a new thrombogenic mechanism for aPL in which aPL bind to complexes of phospholipids and coagulation proteins, thereby interfering in different coagulation reactions. We tested this new hypothesis by investigating the effect of IgG from the same 30 patients on the activated protein C (APC)-mediated factor Va inactivation in the absence and presence of protein S. Three IgGs that inhibited APC-mediated factor Va inactivation independent of protein S and 4 additional IgGs that inhibited in the presence of protein S were found. Furthermore, we could specifically adsorb the inhibitory IgG with cardiolipin vesicles to which APC with or without protein S was bound. In conclusion, these results suggest that subpopulations of aPL exist that are directed to complexes of phospholipids and different plasma proteins. The identity of the plasma proteins involved in the binding of aPL might determine which pathogenic mechanism causes thrombosis.

Abstract Background Agonist-induced platelet activation, with the integrin αIIbβ3 conformational change, is required for fibrinogen binding. This is considered reversible under specific conditions, allowing a second phase of platelet aggregation. The signaling pathways that differentiate between a permanent or transient activation state of platelets are poorly elucidated. Objective To explore platelet signaling mechanisms induced by the collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) or by protease-activated receptors (PAR) for thrombin that regulate time-dependent αIIbβ3 activation. Methods Platelets were activated with collagen-related peptide (CRP, stimulating GPVI), thrombin receptor-activating peptides, or thrombin (stimulating PAR1 and/or 4). Integrin αIIbβ3 activation and P-selectin expression was assessed by two-color flow cytometry. Signaling pathway inhibitors were applied before or after agonist addition. Reversibility of platelet spreading was studied by microscopy. Results Platelet pretreatment with pharmacological inhibitors decreased GPVI- and PAR-induced integrin αIIbβ3 activation and P-selectin expression in the target order of protein kinase C (PKC) > glycogen synthase kinase 3 > β-arrestin > phosphatidylinositol-3-kinase. Posttreatment revealed secondary αIIbβ3 inactivation (not P-selectin expression), in the same order, but this reversibility was confined to CRP and PAR1 agonist. Combined inhibition of conventional and novel PKC isoforms was most effective for integrin closure. Pre- and posttreatment with ticagrelor, blocking the P2Y12 adenosine diphosphate (ADP) receptor, enhanced αIIbβ3 inactivation. Spreading assays showed that PKC or P2Y12 inhibition provoked a partial conversion from filopodia to a more discoid platelet shape. Conclusion PKC and autocrine ADP signaling contribute to persistent integrin αIIbβ3 activation in the order of PAR1/GPVI > PAR4 stimulation and hence to stabilized platelet aggregation. These findings are relevant for optimization of effective antiplatelet treatment.

Lifelong vitamin K antagonist (VKA) therapy is recommended as a standard of care in antiphospholipid syndrome (APS) patients with thrombosis. Concerns have been raised about the validity of international normalised ratio (INR) measurements in lupus anticoagulant (LA)-positive APS patients, because LA may interfere with phospholipid-dependent coagulation tests and could elevate INR measurements. Here, we aimed to determine the interference of antigen-specific monoclonal and isolated patient antibodies with LA activity on INR measurements. Pooled normal plasma (PNP) and control plasma from patients on VKA (without LA) were incubated with monoclonal and isolated patient IgG anti-prothrombin (aPT) and anti-β2-glycoprotein I (aβ2GPI) antibodies that express LA activity. INR was determined before and after addition using three laboratory assays (Owren STA®-Hepato Prest®, Quick STA®-NeoPTimal®, and Quick STA®-Neoplastine® R) and one point-of-care test (POCT) device (Coaguchek Pro II). aPT and aβ2GPI antibodies with LA activity interfered with recombinant human thromboplastin reagents (Quick STA®-Neoplastine® R and Coaguchek Pro II), particularly when added to plasma of VKA-treated controls. This affect was most evident on POCT INR measurements, while the recombinant Quick reagent exhibited a lesser degree of interference. In contrast, tissue-derived thromboplastin reagents (Owren STA®-Hepato Prest® and Quick STA®-NeoPTimal®) remained largely unaffected by these antibodies, both in PNP and VKA anticoagulated control plasma. Among these reagents, the Owren INR reagent exhibited the lowest sensitivity to the influence of LA antibodies. This observed difference in sensitivity is independent of the plasma dilution factor nor the presence of factor V or fibrinogen in Owren reagent. INR reagents that utilise recombinant human thromboplastin are more sensitive to the presence of monoclonal and patient-derived antibodies with LA activity. Consequently, APS patients positive for LA should be monitored using tissue-derived thromboplastin reagents, given its reduced susceptibility to interference by LA-causing antibodies.