Cholangiocarcinoma (CCA) presents significant diagnostic challenges, resulting in late patient diagnosis and poor survival rates. Primary sclerosing cholangitis (PSC) patients pose a particularly difficult clinical dilemma because they harbor chronic biliary strictures that are difficult to distinguish from CCA. MicroRNAs (miRs) have recently emerged as a valuable class of diagnostic markers; however, thus far, neither extracellular vesicles (EVs) nor miRs within EVs have been investigated in human bile. We aimed to comprehensively characterize human biliary EVs, including their miR content. We have established the presence of extracellular vesicles in human bile. In addition, we have demonstrated that human biliary EVs contain abundant miR species, which are stable and therefore amenable to the development of disease marker panels. Furthermore, we have characterized the protein content, size, numbers, and size distribution of human biliary EVs. Utilizing multivariate organization of combinatorial alterations (MOCA), we defined a novel biliary vesicle miR-based panel for CCA diagnosis that demonstrated a sensitivity of 67% and specificity of 96%. Importantly, our control group contained 13 PSC patients, 16 with biliary obstruction of varying etiologies (including benign biliary stricture, papillary stenosis, choledocholithiasis, extrinsic compression from pancreatic cysts, and cholangitis), and 3 with bile leak syndromes. Clinically, these types of patients present with a biliary obstructive clinical picture that could be confused with CCA.These findings establish the importance of using extracellular vesicles, rather than whole bile, for developing miR-based disease markers in bile. Finally, we report on the development of a novel bile-based CCA diagnostic panel that is stable, reproducible, and has potential clinical utility.

Abstract Our previous studies revealed a novel link between gemcitabine (GEM) chemotherapy and elevated glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 2 (GFPT2) expression in pancreatic cancer (PaCa) cells. GFPT2 is a rate-limiting enzyme in the hexosamine biosynthesis pathway (HBP). HBP can enhance metastatic potential by regulating epithelial-mesenchymal transition (EMT). The aim of this study was to further evaluate the effect of chemotherapy-induced GFPT2 expression on metastatic potential. GFPT2 expression was evaluated in a mouse xenograft model following GEM exposure and in clinical specimens of patients after chemotherapy using immunohistochemical analysis. The roles of GFPT2 in HBP activation, downstream pathways, and cellular functions in PaCa cells with regulated GFPT2 expression were investigated. GEM exposure increased GFPT2 expression in tumors resected from a mouse xenograft model and in patients treated with neoadjuvant chemotherapy (NAC). GFPT2 expression was correlated with post-operative liver metastasis after NAC. Its expression activated the HBP, promoting migration and invasion. Treatment with HBP inhibitors reversed these effects. Additionally, GFPT2 upregulated ZEB1 and vimentin expression and downregulated E-cadherin expression. GEM induction upregulated GFPT2 expression. Elevated GFPT2 levels promoted invasion by activating the HBP, suggesting the potential role of this mechanism in promoting chemotherapy-induced metastasis.

Peritoneal washing cytology (CY) in patients with pancreatic cancer is mainly used for staging; however, it may also be used to evaluate the intraperitoneal status to predict a more accurate prognosis. Here, we investigated the potential of deep learning of CY specimen images for predicting the 1-year prognosis of pancreatic cancer in CY-positive patients. CY specimens from 88 patients with prognostic information were retrospectively analyzed. CY specimens scanned by the whole slide imaging device were segmented and subjected to deep learning with a Vision Transformer (ViT) and a Convolutional Neural Network (CNN). The results indicated that ViT and CNN predicted the 1-year prognosis from scanned images with accuracies of 0.8056 and 0.8009 in the area under the curve of the receiver operating characteristic curves, respectively. Patients predicted to survive 1 year or more by ViT showed significantly longer survivals by Kaplan–Meier analyses. The cell nuclei found to have a negative prognostic impact by ViT appeared to be neutrophils. Our results indicate that AI-mediated analysis of CY specimens can successfully predict the 1-year prognosis of patients with pancreatic cancer positive for CY. Intraperitoneal neutrophils may be a novel prognostic marker and therapeutic target for CY-positive patients with pancreatic cancer.