Clathrin-mediated endocytosis (CME) regulates many cell physiological processes such as the internalization of growth factors and receptors, entry of pathogens, and synaptic transmission. Within the endocytic network, clathrin functions as a central organizing platform for coated pit assembly and dissociation via its terminal domain (TD). We report the design and synthesis of two compounds named pitstops that selectively block endocytic ligand association with the clathrin TD as confirmed by X-ray crystallography. Pitstop-induced inhibition of clathrin TD function acutely interferes with receptor-mediated endocytosis, entry of HIV, and synaptic vesicle recycling. Endocytosis inhibition is caused by a dramatic increase in the lifetimes of clathrin coat components, including FCHo, clathrin, and dynamin, suggesting that the clathrin TD regulates coated pit dynamics. Pitstops provide new tools to address clathrin function in cell physiology with potential applications as inhibitors of virus and pathogen entry and as modulators of cell signaling.

Dynamin GTPase activity increases when it oligomerizes either into helices in the presence of lipid templates or into rings in the presence of SH3 domain proteins. Dynasore is a dynamin inhibitor of moderate potency ( IC 50 ˜ 15 μM in vitro ). We show that dynasore binds stoichiometrically to detergents used for in vitro drug screening, drastically reducing its potency ( IC 50 = 479 μM) and research tool utility. We synthesized a focused set of dihydroxyl and trihydroxyl dynasore analogs called the Dyngo™ compounds, five of which had improved potency, reduced detergent binding and reduced cytotoxicity, conferred by changes in the position and/or number of hydroxyl substituents. The Dyngo compound 4a was the most potent compound, exhibiting a 37‐fold improvement in potency over dynasore for liposome‐stimulated helical dynamin activity. In contrast, while dynasore about equally inhibited dynamin assembled in its helical or ring states, 4a and 6a exhibited >36‐fold reduced activity against rings, suggesting that they can discriminate between helical or ring oligomerization states. 4a and 6a inhibited dynamin‐dependent endocytosis of transferrin in multiple cell types ( IC 50 of 5.7 and 5.8 μM, respectively), at least sixfold more potently than dynasore, but had no effect on dynamin‐independent endocytosis of cholera toxin. 4a also reduced synaptic vesicle endocytosis and activity‐dependent bulk endocytosis in cultured neurons and synaptosomes. Overall, 4a and 6a are improved and versatile helical dynamin and endocytosis inhibitors in terms of potency, non‐specific binding and cytotoxicity. The data further suggest that the ring oligomerization state of dynamin is not required for clathrin‐mediated endocytosis .

Twenty‐five chimera compounds of Pitstop® 1 and 2 were synthesised and screened for their ability to block the clathrin terminal domain‐amphiphysin protein‐protein interaction (NTD‐PPI using an ELISA) and clathrin mediated endocytosis (CME) in cells. Library 1 was based on Pitstop 2, but no notable clathrin PPI or in‐cell activity was observed. With the Pitstop 1, 16 analogues were produced with 1,8‐naphthalic imide core as a foundation. Analogues with methylene spaced linkers and simple amides showed a modest to good range of PPI inhibition (7.6 to 42.5 mM, naphthyl 39 and 4‐nitrophenyl 40 respectively) activity. These data reveal the importance of the naphthalene sulfonate moiety, with no des‐SO3 analogue displaying PPI inhibition. This was consistent with the observed analogue docked poses within the clathrin terminal domain Site 1 binding pocket. Further modifications targeted the naphthalene imide moiety, with the installation of 5‐Br (45a), 5‐OH (45c) and 5‐propyl ether (45d) moieties. Among them, the OH 45c and propyl ether 45d retained PPI inhibition, with propyl ether 45d being the most active with a PPI inhibition IC50 = 7.3 mM. This is 2x more potent than Pitstop® 2 and 3x more potent than Pitstop 1.