A functioning gene drive system could fundamentally change our strategies for the control of vector-borne diseases by facilitating rapid dissemination of transgenes that prevent pathogen transmission or reduce vector capacity. CRISPR/Cas9 gene drive promises such a mechanism, which works by converting cells that are heterozygous for the drive construct into homozygotes, thereby enabling super-Mendelian inheritance. Although CRISPR gene drive activity has already been demonstrated, a key obstacle for current systems is their propensity to generate resistance alleles, which cannot be converted to drive alleles. In this study, we developed two CRISPR gene drive constructs based on the nanos and vasa promoters that allowed us to illuminate the different mechanisms by which resistance alleles are formed in the model organism Drosophila melanogaster. We observed resistance allele formation at high rates both prior to fertilization in the germline and post-fertilization in the embryo due to maternally deposited Cas9. Assessment of drive activity in genetically diverse backgrounds further revealed substantial differences in conversion efficiency and resistance rates. Our results demonstrate that the evolution of resistance will likely impose a severe limitation to the effectiveness of current CRISPR gene drive approaches, especially when applied to diverse natural populations.

ABSTRACT CRISPR-based gene drives have sparked both enthusiasm and deep concerns due to their potential for genetically altering entire species. This raises the question about our ability to prevent the unintended spread of such drives from the laboratory into a natural population. Here, we experimentally demonstrate the suitability of synthetic target sites and split drives as flexible safeguarding strategies for gene drive experiments.

Estimating fitness differences between allelic variants is a central goal of experimental evolution. Current methods for inferring selection from allele frequency time series typically assume that evolutionary dynamics at the locus of interest can be described by a fixed selection coefficient. However, fitness is an aggregate of several components including mating success, fecundity, and viability, and distinguishing between these components could be critical in many scenarios. Here we develop a flexible maximum likelihood framework that can disentangle different components of fitness and estimate them individually in males and females from genotype frequency data. As a proof-of-principle, we apply our method to experimentally-evolved cage populations of Drosophila melanogaster, in which we tracked the relative frequencies of a loss-of-function and wild-type allele of yellow. This X-linked gene produces a recessive yellow phenotype when disrupted and is involved in male courtship ability. We find that the fitness costs of the yellow phenotype take the form of substantially reduced mating preference of wild-type females for yellow males, together with a modest reduction in the viability of yellow males and females. Our framework should be generally applicable to situations where it is important to quantify fitness components of specific genetic variants, including quantitative characterization of the population dynamics of CRISPR gene drives.

Engineered gene drives have been suggested as a mechanism for rapidly spreading genetic alterations through a population. One promising type of drive is the CRISPR homing drive, which has recently been demonstrated in several organisms. However, such drives face a major obstacle in the form of resistance against the drive that typically evolves rapidly. In addition, homing-type drives are generally self-sustaining, meaning that a drive would likely spread to all individuals of a species even when introduced at low frequency in a single location. Here, we develop a new form of CRISPR gene drive, the Toxin-Antidote Recessive Embryo (TARE) drive, which successfully limits resistance by targeting a recessive lethal gene while providing a recoded sequence to rescue only drive-carrying individuals. Our computational modeling shows that such a drive will have threshold-dependent dynamics, spreading only when introduced above a frequency threshold that depends on the fitness cost of the drive. We demonstrate such a drive in Drosophila with 88-95% transmission to the progeny of female drive heterozygotes. This drive was able to spread through a large cage population in just six generations following introduction at 24% frequency without any apparent evolution of resistance. Our results suggest that TARE drives constitute promising candidates for the development of effective, regionally confined population modification drives.

CRISPR homing gene drives potentially have the capacity for large-scale population modification or suppression. However, resistance alleles formed by the drives can prevent them from successfully spreading. Such alleles have been found to form at high rates in most studies, including those in both insects and mammals. One possible solution to this issue is the use of multiple guide RNAs (gRNAs), thus allowing cleavage by the drive even if resistance sequences are present at some of the gRNA target sequences. Here, we develop a high-fidelity model incorporating several factors affecting the performance of drives with multiple gRNAs, including timing of cleavage, reduction in homology-directed repair efficiency due to imperfect homology around the cleavage site, Cas9 activity saturation, variance in the activity level of individual gRNAs, and formation of resistance alleles due to incomplete homology-directed repair. We parameterize the model using data from homing drive experiments designed to investigate these factors and then use it to analyze several types of homing gene drives. We find that each type of drive has an optimal number of gRNAs, usually between two and eight, dependent on drive type and performance parameters. Our model indicates that utilization of multiple gRNAs is insufficient for construction of successful gene drives, but that it provides a critical boost to drive efficiency when combined with other strategies for population modification or suppression.

A functioning gene drive system could fundamentally change our strategies for the control of vector-borne diseases by facilitating rapid dissemination of transgenes that prevent pathogen transmission or reduce vector capacity. CRISPR/Cas9 gene drive promises such a mechanism, which works by converting cells that are heterozygous for the drive construct into homozygotes, thereby enabling super-Mendelian inheritance. Though CRISPR gene drive activity has already been demonstrated, a key obstacle for current systems is their propensity to generate resistance alleles. In this study, we developed two CRISPR gene drive constructs based on the nanos and vasa promoters that allowed us to illuminate the different mechanisms by which resistance alleles are formed in the model organism Drosophila melanogaster. We observed resistance allele formation at high rates both prior to fertilization in the germline and post-fertilization in the embryo due to maternally deposited Cas9. Assessment of drive activity in genetically diverse backgrounds further revealed substantial differences in conversion efficiency and resistance rates. Our results demonstrate that the evolution of resistance will likely impose a severe limitation to the effectiveness of current CRISPR gene drive approaches, especially when applied to diverse natural populations.

Dual occurrence of distinct genetic diseases is exceptionally rare, complicating both diagnosis and management when the conditions share overlapping symptoms.