Nitric oxide provokes vasodilation and inhibits platelet aggregation. We examined the effect of nitric oxide on superoxide anion production by three sources: activated intact neutrophils, xanthine oxidase/hypoxanthine, and the NADPH oxidase. Nitric oxide significantly inhibited the generation of superoxide anion by neutrophils exposed to either FMLP (10(-7)M) or PMA (150 ng/ml) (IC50 = 30 microM). To determine whether the effect of nitric oxide on the respiratory burst was due to simple scavenging of O2+, kinetic studies that compared effects on neutrophils and the cell-free xanthine oxidase system were performed. Nitric oxide inhibited O2+ produced by xanthine oxidase only when added simultaneously with substrate, consistent with the short half-life of NO in oxygenated solution. In contrast, the addition of nitric oxide to neutrophils 20 min before FMLP resulted in the inhibition of O2+ production, which suggests formation of a stable intermediate. The effect of nitric oxide on the cell-free NADPH oxidase superoxide-generating system was also examined: The addition of NO before arachidonate activation (t = -6 min) significantly inhibited superoxide anion production. Nitric oxide did not inhibit O2+ when added at NADPH initiation (t = 0). Treatment of the membrane but not cytosolic component of the oxidase was sufficient to inhibit O2+ generation. The data suggest that nitric oxide inhibits neutrophil O2+ production via direct effects on membrane components of the NADPH oxidase. This action must occur before the assembly of the activated complex.

Objective: Nitric oxide, a potent vasodilator released by endothelial cells, inhibits platelet aggregation and adhesion to vascular endothelial surfaces. Because endothelial cell damage is considered pivotal in the pathogenesis of preeclampsia, this study was initiated to determine whether nitric oxide production is decreased in patients with preeclampsia. Study Design: Twenty-six patients with preeclampsia (as defined by a blood pressure ≥ 140 mm Hg systolic or 90 mm Hg diastolic plus proteinuria, ≥ 300 mg per 24 hours or ≥ 2 + by dipstick, both occurring on two occasions ≥ 4 hours apart) and 26 normotensive women with singleton gestations in the third trimester were studied. Because nitric oxide is spontaneously oxidized to both nitrite and nitrate, two analytic assays were used serially. Serum nitrite levels were initially determined with the Greiss reagent and subsequently analyzed with Escherichia coli nitrate reductase. Results: With the Greiss reagent alone the mean ± SEM of serum nitrite level in 26 patients with preeclampsia was significantly decreased compared with 26 normotensive patients (3.46 ± 1.43 μmol/L vs 4.65 ± 0.85 μmol/L, p = 0.02). With the addition of the nitrate reductase enzyme of Escherichia coli the mean ± SEM of serum nitrite level in 26 preeclamptic patients was again significantly decreased compared with 26 normotensive patients (20.04 ± 1.25 μmol/L vs 27.38 ± 2.23 μmol/L, p = 0.02). One patient with the syndrome of hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelets demonstrated a concurrent decrease in serum nitrite over a 2-week period, emphasizing the relationship of nitric oxide to the pathophysiologic features of the syndrome. Conclusions: Circulating levels of nitrite are decreased in patients with preeclampsia. These data support the concept that diminished nitric oxide synthesis contributes to the pathophysiologic changes seen in preeclampsia.

Antibodies to DNA and chromatin drive autoimmunity in systemic lupus erythematosus (SLE). Null mutations and hypomorphic variants of the secreted deoxyribonuclease DNASE1L3 are linked to familial and sporadic SLE, respectively. We report that DNASE1L3-deficient mice rapidly develop autoantibodies to DNA and chromatin, followed by an SLE-like disease. Circulating DNASE1L3 is produced by dendritic cells and macrophages, and its levels inversely correlate with anti-DNA antibody response. DNASE1L3 is uniquely capable of digesting chromatin in microparticles released from apoptotic cells. Accordingly, DNASE1L3-deficient mice and human patients have elevated DNA levels in plasma, particularly in circulating microparticles. Murine and human autoantibody clones and serum antibodies from human SLE patients bind to DNASE1L3-sensitive chromatin on the surface of microparticles. Thus, extracellular microparticle-associated chromatin is a potential self-antigen normally digested by circulating DNASE1L3. The loss of this tolerance mechanism can contribute to SLE, and its restoration may represent a therapeutic opportunity in the disease.

The molecular and cellular processes that lead to renal damage and to the heterogeneity of lupus nephritis (LN) are not well understood. We applied single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to renal biopsies from patients with LN and evaluated skin biopsies as a potential source of diagnostic and prognostic markers of renal disease. Type I interferon (IFN)-response signatures in tubular cells and keratinocytes distinguished patients with LN from healthy control subjects. Moreover, a high IFN-response signature and fibrotic signature in tubular cells were each associated with failure to respond to treatment. Analysis of tubular cells from patients with proliferative, membranous and mixed LN indicated pathways relevant to inflammation and fibrosis, which offer insight into their histologic differences. In summary, we applied scRNA-seq to LN to deconstruct its heterogeneity and identify novel targets for personalized approaches to therapy.

Lupus nephritis is a leading cause of mortality among systemic lupus erythematosus (SLE) patients, and its heterogeneous nature poses a significant challenge to the development of effective diagnostics and treatments. Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) offers a potential solution to dissect the heterogeneity of the disease and enables the study of similar cell types distant from the site of renal injury to identify novel biomarkers. We applied scRNA-seq to human renal and skin biopsy tissues and demonstrated that scRNA-seq can be performed on samples obtained during routine care. Chronicity index, IgG deposition, and quantity of proteinuria correlated with a transcriptomic-based score composed of IFN-inducible genes in renal tubular cells. Furthermore, analysis of cumulative expression profiles of single cell keratinocytes dissociated from nonlesional, non-sun-exposed skin of patients with lupus nephritis also revealed upregulation of IFN-inducible genes compared with keratinocytes isolated from healthy controls. This indicates the possible use of scRNA-seq analysis of skin biopsies as a biomarker of renal disease. These data support the potential utility of scRNA-seq to provide new insights into the pathogenesis of lupus nephritis and pave the way for exploiting a readily accessible tissue to reflect injury in the kidney.

Lupus nephritis (LN) is a frequent manifestation of systemic lupus erythematosus, and fewer than half of patients achieve complete renal response with standard immunosuppressants. Identifying non-invasive, blood-based pathologic immune alterations associated with renal injury could aid therapeutic decisions. Here, we used mass cytometry immunophenotyping of peripheral blood mononuclear cells in 145 patients with biopsy-proven LN and 40 healthy controls to evaluate the heterogeneity of immune activation in patients with LN and to identify correlates of renal parameters and treatment response. Unbiased analysis identified 3 immunologically distinct groups of patients with LN that were associated with different patterns of histopathology, renal cell infiltrates, urine proteomic profiles, and treatment response at one year. Patients with enriched circulating granzyme B+ T cells at baseline showed more severe disease and increased numbers of activated CD8 T cells in the kidney, yet they had the highest likelihood of treatment response. A second group characterized primarily by a high type I interferon signature had a lower likelihood of response to therapy, while a third group appeared immunologically inactive by immunophenotyping at enrollment but with chronic renal injuries. Main immune profiles could be distilled down to 5 simple cytometric parameters that recapitulate several of the associations, highlighting the potential for blood immune profiling to translate to clinically useful non-invasive metrics to assess immune-mediated disease in LN.

Apolipoprotein L1 (APOL1) gene risk variants (RV) associate with renal and cardiovascular disease particularly in SLE. We hypothesized that in RV-carrying human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cytokine-induced APOL1 expression compromises mitochondrial respiration, lysosome integrity, and autophagic flux. HUVEC cultures of each APOL1 genotype were generated. APOL1 was expressed using IFN?; HUVEC mitochondrial function , lysosome integrity, and autophagic flux were measured. IFN? increased APOL1 expression across all genotypes 20-fold (p=0.001). Compared to the homozygous G0 (ancestral) allele (0RV), high risk (2RV) HUVECs showed both depressed baseline and maximum mitochondrial oxygen consumption (p<0.01), and impaired mitochondrial networking on MitoTracker assays. These cells also demonstrated a contracted lysosome compartment (p<0.001), and an accumulation of autophagosomes suggesting a defect in autophagic flux. Treatment of 0RV HUVECs with a non-selective lysosome inhibitor, hydroxychloroquine, produced autophagosome accumulations similar to the 2RV cells, thus implicating lysosome dysfunction in blocking autophagy. Compared to 0RV and 2RV HUVECs, 1 RV cells demonstrated an intermediate autophagy defect which was exacerbated by IFN?. Our findings implicate dysfunction of mitochondrial respiration, lysosome, and autophagy in APOL1 RV-mediated endothelial cytotoxicity. IFN? amplified this phenotype even in variant heterozygous cells–a potential underpin of the APOL1/inflammation interaction. This is the first description of APOL1 pathobiology in variant heterozygous cell cultures.

 We present a detailed analysis of myeloid cell populations found in the kidneys of lupus nephritis (LN) patients, based on the single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data collected as part of the Accelerating Medicines Partnership (AMP) in RA/SLE consortium. Overall, 23,819 cells isolated from 156 LN patients and 30 healthy donors passed QC. Clustering of these cells (figure 1A) identified populations of CD14 and CD16 monocytes, two subsets of tissue-resident macrophages and several types of dendritic cells (DCs). In addition, we found several transcriptionally-distinct subsets of differentiated macrophages, that were missing from healthy donors (figure 1B- C). The ratio between the frequency of these macrophage subsets and that of infiltrating monocytes positively correlated with the Activity Index (AI) (figure 1D). To infer the origins of the observed disease-specific macrophages, we compared them to several published scRNA-seq datasets of blood and kidney samples, and performed in addition trajectory analysis. Our results suggested that these subsets likely originate from both infiltrating monocytes and tissue-resident macrophages (figure 2A). Furthermore, our analysis indicated that the differentiation into disease-specific macrophages mostly takes place within the kidney. To identify putative extracellular signals driving the differentiation of infiltrating CD16 monocytes into disease-related activation states, we performed in vitro experiments in which CD16 monocytes were stimulated with a wide array of cytokines and molecules suggested to play role in SLE pathology, such as immune complexes (ICs) and various types of cellular debris. We measured transcriptional changes associated with each in vitro condition, and utilized the generated data to identify enriched signatures in the AMP scRNA-seq data, using gene set enrichment analysis (GSEA). This analysis suggested that apoptotic cells likely promote differentiation of CD16 monocytes into a phagocytic state (cluster 11; figure 2B). In contrast, ICs containing TLR7 ligands, as well as IFNγ, were found to be plausible drivers of differentiation into an activation state that was characterized by high production of several proinflammatory cytokines and chemokines ('high producers' – clusters 12 and 13; figure 2C-D). Of note, our analysis suggested that through chemokine production, these 'high producers' may play a central role in recruiting and retaining the phagocytic macrophage subsets. The frequency of a single population of disease-specific macrophages positively correlated with both the AI and the Chronicity Index (CI; figure 3A-B). This population (cluster 17) was characterized by the upregulation of a set of genes associated with lipid metabolism. While previous studies have reported the presence of a similar macrophage subset in other tissues, this has not yet been demonstrated in kidneys. Furthermore, our analysis identified subclusters within this population, associated with different specific pathways, that were separately correlated with the AI and CI. In particular, we found a proinflammatory signature in these cells that was negatively correlated with the AI and positively correlated with the CI (figure 3C-D). A systemic differential expression analysis showed that several myeloid subsets modulated their gene expression in a manner correlated with the AI, compared to healthy donors; a particular clear response was observed in CD16 monocytes (cluster 2), in both proliferative/mixed and pure membranous LN (figure 4A-B). GSEA suggested that these changes were driven, at least in part, by type I and type II IFN, IL-6 and TNFβ. A conjoint analysis of changes in subset frequencies and of the differentially expressed (DE) genes in these populations and in glomerular endothelial cells pointed to the concurrent upregulation of molecules that may promote fibrosis, and in particular fibronectin in CD16 monocytes and integrins capable of binding it in glomerular endothelial cells (figure 4D-F); furthermore, several of the phagocytic macrophages derived from CD16 monocytes upregulated a set of genes regulating the extracellular matrix (figure 4G). Of note, these observations were found in LN patients that had a 0 glomerular CI (defined as the sum of glomerular subscores of the CI), suggesting that these molecular events precede fibrosis and may promote it. An increase in glomerular CI was associated with significant changes in gene expression, in particular in cDC2 and pDCs (clusters 4 & 15), as well as 2 specific populations of phagocytic macrophages (clusters 14 and 15; figure 4C); these changes included a decrease in the interferon response. We verified the reproducibility of these signatures in an independent set of LN patients. Taken together, our results shed light on the mechanisms of kidney inflammation in LN, and provide a detailed view of the different subsets and activation states of myeloid cells found in LN kidneys and the putative relations between them, as well as the extracellular signals giving rise to these states.

Background

 The G1 and G2 risk variants (RVs) in Apolipoprotein L1 (APOL1) associate with chronic kidney disease (CKD) and may contribute to poorer outcomes for African American (AA) patients with lupus nephritis (LN). While the pathogenetic mechanism for APOL1 related CKD remains unknown, most studies focus on glomerular injury. This study leveraged the multi- center LN AMP to evaluate APOL1 RV associated clinical phenotypes and identify whether these genetic variants influence the transcriptomic landscape in kidney cells. 

Methods

 LN patients were consecutively enrolled in AMP at the time of a clinically indicated renal biopsy and followed for one year. Dissociated biopsies were passed through a droplet- based single-cell RNA sequencing (scRNAseq) pipeline that included quality control of sequenced libraries. Genotypes for APOL1 RVs were identified by sanger sequencing for all AA patients enrolled with available DNA. 

Results

 In total, 104 AA patients were genotyped; 47 (45.2%) carried zero APOL1 RVs, 45 (43.3%) one RV, and 12 (11.5%) two RVs. RVs did not associate with baseline anti-dsDNA or complement levels, biopsy class/activity/chronicity, GFR or proteinuria (figure 1A-G). While there was a trend toward decreased GFR at one year by gene variant dosage, there was no association with changes in proteinuria (figure 1F-H). ScRNAseq yielded 88383 high quality cells in patients with zero RVs (n=30), 72288 one RV (n=28), and 28694 two RVs (n=11) spanning nine parenchymal cluster types (figure 2A). Independent of genotype, APOL1 expression was highest in podocyte, endothelial and ascending thin limb (ATL) cells (figure 2B). Median APOL1 expression was significantly higher in cells with one or two RVs in the ATL cluster but this association was not seen in podocytes or endothelial cells (figure 2C). Single cell pathway analysis revealed that the ATL cluster demonstrated greater pathway level variation between cells with two RVs vs zero than any other cluster, with the most distinguishing related to interferon signaling (increased), antigen presentation (increased), and mitochondrial function (decreased) (figure 2D). The ATL damage associated gene, lipocalin-2 (LCN2), was expressed at significantly higher levels in cells carrying two RVs (figure 2E). Likewise, the proportion of ATL cells double positive for APOL1 and LCN2 was higher in patients with two RVs (figure 2F). While it did not reach significance, the percentage of ATL cells expressing APOL1 more strongly correlated with eGFR and tubular atrophy on biopsy histology among patients with two RVs compared to those carrying zero or one RV (figure 3A-F). 

Conclusions

 APOL1 RVs associated with decreased GFR but not proteinuria suggesting that current clinical indicators of LN severity may not appropriately prognosticate patients carrying APOL1 RVs and that the use of routine genotyping in the clinical setting may better risk stratify AA patients with LN. The scRNAseq data revealed that ATL cells likely express APOL1 and that this may be relevant to progressive kidney dysfunction over time. This highlights the potential for a previously unrecognized extraglomerular injury in AA SLE patients carrying APOL1 RVs providing a novel future direction for understanding APOL1 toxicity and translation to clinical trials.