Tumor heterogeneity of high-grade glioma (HGG) is recognized by four clinically relevant subtypes based on core gene signatures. However, molecular signaling in glioma stem cells (GSCs) in individual HGG subtypes is poorly characterized. Here we identified and characterized two mutually exclusive GSC subtypes with distinct dysregulated signaling pathways. Analysis of mRNA profiles distinguished proneural (PN) from mesenchymal (Mes) GSCs and revealed a pronounced correlation with the corresponding PN or Mes HGGs. Mes GSCs displayed more aggressive phenotypes in vitro and as intracranial xenografts in mice. Further, Mes GSCs were markedly resistant to radiation compared with PN GSCs. The glycolytic pathway, comprising aldehyde dehydrogenase (ALDH) family genes and in particular ALDH1A3, were enriched in Mes GSCs. Glycolytic activity and ALDH activity were significantly elevated in Mes GSCs but not in PN GSCs. Expression of ALDH1A3 was also increased in clinical HGG compared with low-grade glioma or normal brain tissue. Moreover, inhibition of ALDH1A3 attenuated the growth of Mes but not PN GSCs. Last, radiation treatment of PN GSCs up-regulated Mes-associated markers and down-regulated PN-associated markers, whereas inhibition of ALDH1A3 attenuated an irradiation-induced gain of Mes identity in PN GSCs. Taken together, our data suggest that two subtypes of GSCs, harboring distinct metabolic signaling pathways, represent intertumoral glioma heterogeneity and highlight previously unidentified roles of ALDH1A3-associated signaling that promotes aberrant proliferation of Mes HGGs and GSCs. Inhibition of ALDH1A3-mediated pathways therefore might provide a promising therapeutic approach for a subset of HGGs with the Mes signature.

The receptor for advanced glycation end products, RAGE, is a member of the immunoglobulin superfamily of cell surface molecules differentially expressed on a range of cell types. Ligation of RAGE perturbs homeostatic mechanisms and, potentially, provides a basis for cellular dysfunction in pathologic situations in which its ligands accumulate. To understand factors underlying RAGE expression, we cloned the 5′-flanking region of the RAGE gene and characterized putative regulatory motifs. Analysis of the putative promoter region revealed the presence of three potential NF-κB-like and two SP1 binding sites. Transient transfection of vascular endothelial and smooth muscle cells using chimeric 5′-deletion constructs linked to luciferase reporter revealed that the region −1543/−587 contributed importantly to both basal and stimulated expression of the RAGE gene. This region of the RAGE gene contained three putative NF-κB-like binding sites and was responsible for increased luciferase activity observed when endothelial or smooth muscle cells were stimulated with lipopolysaccharide. DNase I footprinting assays and electrophoretic mobility shift assay revealed that two of the three NF-κB-like binding sites (1 and 2) were likely functional and responsive to stimuli. Upon simultaneous mutation of NF-κB-like sites 1 and 2, both basal promoter expression and response to stimulation with LPS, as measured by relative luciferase activity, were significantly diminished. These results point to NF-κB-dependent mechanisms regulating cellular expression of RAGE and suggest a means of linking RAGE to the inflammatory response. The receptor for advanced glycation end products, RAGE, is a member of the immunoglobulin superfamily of cell surface molecules differentially expressed on a range of cell types. Ligation of RAGE perturbs homeostatic mechanisms and, potentially, provides a basis for cellular dysfunction in pathologic situations in which its ligands accumulate. To understand factors underlying RAGE expression, we cloned the 5′-flanking region of the RAGE gene and characterized putative regulatory motifs. Analysis of the putative promoter region revealed the presence of three potential NF-κB-like and two SP1 binding sites. Transient transfection of vascular endothelial and smooth muscle cells using chimeric 5′-deletion constructs linked to luciferase reporter revealed that the region −1543/−587 contributed importantly to both basal and stimulated expression of the RAGE gene. This region of the RAGE gene contained three putative NF-κB-like binding sites and was responsible for increased luciferase activity observed when endothelial or smooth muscle cells were stimulated with lipopolysaccharide. DNase I footprinting assays and electrophoretic mobility shift assay revealed that two of the three NF-κB-like binding sites (1 and 2) were likely functional and responsive to stimuli. Upon simultaneous mutation of NF-κB-like sites 1 and 2, both basal promoter expression and response to stimulation with LPS, as measured by relative luciferase activity, were significantly diminished. These results point to NF-κB-dependent mechanisms regulating cellular expression of RAGE and suggest a means of linking RAGE to the inflammatory response. RAGE 1The abbreviations used are: RAGE,receptor for advanced glycationend products; AGE, advancedglycation end product; BAEC, bovine aortic endothelial cell; EMSA, electrophoretic mobility shift assay; LPS, lipopolysaccharide; RSMC, rat vascular smooth muscle cell; PCR, polymerase chain reaction; bp, base pair(s); ANOVA, analysis of variance. (for receptor foradvanced glycation end products), a member of the immunoglobulin superfamily of cell surface molecules, was initially identified and characterized as a cellular interaction site for advanced glycation end products or AGEs, ligands formed in diverse circumstances as a consequence of irreversible glycation/oxidation of proteins or lipids (1Ruderman N. Williamson J. Brownlee M. FASEB J. 1992; 6: 2905-2914Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar, 2Baynes J. Diabetes. 1991; 40: 405-412Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar, 3Sugaya K. Gukagawa T. Inoko H. Ikemura T. Genomics. 1994; 23: 408-419Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar, 4Brownlee M. Cerami A. Vlassara H. N. Engl. J. Med. 1988; 318: 1315-1320Crossref PubMed Scopus (2407) Google Scholar, 5Schmidt A.M. Vianna M. Gerlach M. Brett J. Ryan J. Kao J. Esposito C. Hegarty H. Hurley W. Clauss M. Wang F. Pan Y.-C.E. Tsang T.C. Stern D. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14987-14997Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 6Neeper M. Schmidt A.M. Brett J. Yan S.D. Wang F. Pan Y.-C.E. Elliston K. Stern D. Shaw A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14998-15004Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). AGE formation occurs during normal aging, and to an accelerated degree in hyperglycemic conditions such as diabetes mellitus. In renal failure, enhanced glycation of β2-microglobulin occurs as a result of its markedly delayed clearance, one consequence of which, the formation of AGE-β2-microglobulin, is likely linked to the inflammatory bone and joint destruction characteristic of dialysis-related amyloidosis (7Miyata T. Inagi R. Iida Y. Sato M. Yamada N. Oda O. Maeda K. Seo H. J. Clin. Invest. 1994; 93: 521-528Crossref PubMed Scopus (352) Google Scholar, 8Miyata T. Oda O. Inagi R. Iida Y. Araki N. Yamada N. Horiuchi S. Taniguchi N. Maeda K. Kinoshita T. J. Clin. Invest. 1992; 92: 1243-1252Crossref Scopus (413) Google Scholar, 9Schmidt A.M. Yan S.D. Hori O. Stern D. Miyata T. Circulation. 1994; 90: 1251Google Scholar, 10Miyata T. Hori O. Zhang J.H. Yan S.D. Ferran L. Iida Y. Stern D. Schmidt A.M. J. Clin. Invest. 1996; 98: 1088-1094Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar). AGE formation is also favored in other settings associated with the accumulation of amyloid proteins, such as in components of intracellular neurofibrillary tangles (11Smith M. Kutty R. Richey P. Yan S.D. Stern D. Chader G. Wiggert B. Petersen R. Perry G. Am. J. Pathol. 1994; 145: 42-47PubMed Google Scholar, 12Smith M. Taneda S. Richey P. Miyata S. Yan S.D. Stern D. Monnier V. Perry G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 5710-5714Crossref PubMed Scopus (744) Google Scholar, 13Yan S.D. Chen X. Schmidt A.M. Brett J. Godman G. Scott C.W. Caputo C. Frappier T. Yen S.H. Stern D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7787-7791Crossref PubMed Scopus (541) Google Scholar), as well as in extracellular amyloid-β peptide accumulations (14Vitek M Bhattacharya J. Glendening J.M. Stopa E. Vlassara H. Bucala R. Manogue K. Cerami A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 4766-4770Crossref PubMed Scopus (766) Google Scholar) characteristic of Alzheimer's disease. We hypothesized that expression of RAGE in a range of cells, including endothelial cells, vascular smooth muscle cells, mononuclear phagocytes, and certain neurons, as identified by immunohistochemistry and in situhybridization studies (15Brett J. Schmidt A.M. Zou Y.S. Yan S.D. Weidman E. Pinsky D. Neeper M. Przysiecki C. Shaw A. Migheli A. Stern D. Am. J. Pathol. 1993; 143: 1699-1712PubMed Google Scholar, 16Ritthaler U. Deng Y. Zhang Y. Greten J. Abel M. Allenberg J. Otto G. Roth H. Bierhaus A. Ziegler R. Schmidt A.M. Waldherr R. Wahl P. Stern D. Nawroth P. Am. J. Pathol. 1995; 146: 688-694PubMed Google Scholar), places this molecule in prime position to mediate the pathogenic effects of AGEs. Analysis of RAGE in tissues has suggested that expression of the receptor and consequences of RAGE binding to its ligands are likely to be regulated at multiple levels. Immunohistochemical studies of diabetic, AGE-rich vasculature demonstrated enhanced RAGE immunoreactivity in both the endothelium and vascular smooth muscle from renal arteries obtained from patients with diabetes, compared with basal levels of staining for RAGE in the renal vasculature of age-matched control individuals (17Schmidt A.M. Yan S.D. Stern D. Nat. Med. 1995; 1: 1002-1004Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). In patients with renal failure and dialysis-related amyloidosis, enhanced staining for RAGE was noted in the macrophages that pervaded inflamed amyloid deposits containing AGE-β2-microglobulin (10Miyata T. Hori O. Zhang J.H. Yan S.D. Ferran L. Iida Y. Stern D. Schmidt A.M. J. Clin. Invest. 1996; 98: 1088-1094Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar). In other tissue studies, we demonstrated that RAGE expression was enhanced in developing neurons of the central nervous system. As the generation of AGEs was unlikely in that environment, we hypothesized that RAGE might interact with other ligands in that setting. We found that RAGE served as a neuronal receptor for amphoterin, mediating the neurite-outgrowth promoting effects previously attributed to amphoterin, and that both RAGE and amphoterin could be co-localized in neurons of the developing rat central nervous system (18Hori O. Brett J. Slattery T. Cao R. Zhang J. Chen J.X. Nagashima M. Lundh E.R. Vijay S. Nitecki D. Morser J. Stern D. Schmidt A.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 25752-25761Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1044) Google Scholar, 19Rauvala H. Pihlaskari R. J. Biol. Chem. 1987; 262: 16625-16635Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20Merenmies J. Pihlaskari R. Laitinen J. Wartiovaara J. Rauvala H. J. Biol. Chem. 1991; 266: 16722-16729Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). In pathologic settings in the central nervous system, we have demonstrated that amyloid-β peptide interaction with RAGE results in enhanced neural toxicity and microglial activation/migration (21Yan S.D. Chen X. Fu J. Chen M. Zhu H. Roher A. Slattery T. Nagashima M. Morser J. Migheli A. Nawroth P. Godman G. Stern D. Schmidt A.M. Nature. 1996; 382: 685-691Crossref PubMed Scopus (1848) Google Scholar). Consistent with these findings, neuronal RAGE expression is increased in affected neurons in Alzheimer's brain (21Yan S.D. Chen X. Fu J. Chen M. Zhu H. Roher A. Slattery T. Nagashima M. Morser J. Migheli A. Nawroth P. Godman G. Stern D. Schmidt A.M. Nature. 1996; 382: 685-691Crossref PubMed Scopus (1848) Google Scholar). Recent observations from our laboratory have suggested enhanced immunostaining for RAGE in vasculature affected by autoimmune/inflammatory disorders, such as systemic lupus erythematosus 2A. M. Schmidt, unpublished observations. and murine atherosclerotic plaques (22Park L. Hori O. Yan S.D. Zou Y.S. Verstuyft J. Rubin E.M. Liu J.K. Yeo H.C. Ames B.N. Andaz S. Stern D. Schmidt A.M. Circulation. 1996; 94: 200Google Scholar). These observations suggested that the expression of RAGE was subject to cell-specific regulation based on microenvironmental cues. To test this hypothesis, the promoter of RAGE was identified and its initial functional characterization undertaken. Given the diverse circumstances under which RAGE expression was apparently altered, we studied the effects of the prototypic stimulus, lipopolysaccharide (LPS), in both cultured endothelial cells (23Schmidt A.-M. Hori O. Chen J. Li J.F. Crandall J. Zhang J. Cao R. Yan S.D. Brett J. Stern D. J. Clin. Invest. 1995; 96: 1395-1403Crossref PubMed Scopus (829) Google Scholar) and vascular smooth muscle cells (24Fredman J. Pauly R. Stern D. Schmidt A.M. Monticone R. Crow M. Circulation. 1994; 90: 1567Google Scholar). Here we demonstrate that the promoter of RAGE is responsive to stimulation with LPS in both endothelial cells and vascular smooth muscle cells. Furthermore, the presence of NF-κB-like binding sites appears essential in both endothelial cells and smooth muscle cells for mediating this response. A bacteriophage library (2.0 × 106 plaque-forming units) constructed by cloning human lung genomic DNA into the BamHI sites of λDASH 11 (Stratagene, La Jolla, CA) was screened by hybridization with a synthetic oligonucleotide probe (Ps-1) corresponding to nucleotides +17 to +101 of the human RAGE cDNA sequence (6Neeper M. Schmidt A.M. Brett J. Yan S.D. Wang F. Pan Y.-C.E. Elliston K. Stern D. Shaw A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14998-15004Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The probe was 5′-end-labeled with [γ-32P]ATP using T4-polynucleotide kinase. Lifts were prepared and hybridized in QuikHyb hybridization solution according to the manufacturer's instructions (Stratagene). Positive plaques were selected and purified. Southern blot analysis revealed that one of the plaques contained a 3.5-kilobase BamHI insert, which hybridized with Ps-1 as well as another oligonucleotide probe (Ps-2) corresponding to +19 to +43 of the human RAGE cDNA (6Neeper M. Schmidt A.M. Brett J. Yan S.D. Wang F. Pan Y.-C.E. Elliston K. Stern D. Shaw A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14998-15004Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). This insert was isolated and digested with HindIII. The resulting fragments were subcloned into plasmid pBluescript II SK(+) for DNA sequencing. DNA sequencing was performed by the dideoxy chain-termination method (25Maxam A.M. Gilbert W. Methods Enzymol. 1980; 65: 499-560Crossref PubMed Scopus (9556) Google Scholar) with Sequenase (U. S. Biochemical Corp.). Vector-specific oligonucleotide T3 and T7 primers were used to obtain initial sequence information. The DNA sequence obtained for the 5′-flanking region of the RAGE gene is shown in Fig. 1. Primer extension analysis was performed as described (26Perkins N.D. Lawrence Edwards N. Duckett C.S. Agranlff A.B. Schmid R.M. Nabel G.J. EMBO J. 1993; 12: 3551-3558Crossref PubMed Scopus (407) Google Scholar) to map the transcriptional initiation site. Briefly, two synthetic oligonucleotide primers, Pe-5 corresponding to −104 to −83 of the 5′-flanking region of the RAGE gene (Fig. 1) and Pe-6 corresponding to +18 to +41 of the human RAGE cDNA (6Neeper M. Schmidt A.M. Brett J. Yan S.D. Wang F. Pan Y.-C.E. Elliston K. Stern D. Shaw A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14998-15004Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), were end-labeled with [γ-32P]ATP and annealed to 5 μg of the human lung poly(A)+ RNA (CLONTECH, Palo Alto, CA) at 58 °C for 20 min. After cooling to room temperature for 10 min, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Madison, WI) was added to extend primers at 42 °C for 30 min. Dideoxy sequencing of the RAGE genomic clone using the same primers as above (Pe-5 and Pe-6) was carried out as DNA sequence ladders. The extension products alongside the DNA sequence ladders were analyzed on a denatured polyacrylamide gel (8%) and exposed to autoradiographic film overnight. Bovine aortic endothelial cells (BAECs, Ref. 5Schmidt A.M. Vianna M. Gerlach M. Brett J. Ryan J. Kao J. Esposito C. Hegarty H. Hurley W. Clauss M. Wang F. Pan Y.-C.E. Tsang T.C. Stern D. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14987-14997Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and rat vascular smooth cells (RSMCs, generously provided by Dr. Abraham Rothman), were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium or M199 (Life Technologies, Inc.), respectively, containing fetal bovine serum (10%, Life Technologies, Inc.) and penicillin (100 units/ml) and streptomycin (100 μg/ml), in humidified incubators containing CO2 (5%). Prior to studies of basal/stimulated function of the RAGE promoter, BAECs or RSMCs were washed with phosphate-buffered saline and placed in medium as above, except that serum was omitted for 8 h prior to exposure to the indicated stimuli. Both BAECs (utilized at passage 1–3 for experiments) and RSMCs were treated with LPS (10 ng/ml, Difco). After 8 h at 37 °C, cell monolayers were washed twice with cold phosphate-buffered saline and scraped into cold phosphate-buffered saline (1.0 ml) and nuclear extracts were prepared as described (27Schrieber E. Matthias P. Muller M. Schaffner W. Nucleic Acids Res. 1989; 17: 6419Crossref PubMed Scopus (4013) Google Scholar). Briefly, the cell suspension was centrifuged for 5 min at 3,500 rpm at 4 °C. The cell pellet was then resuspended in 0.4 ml of cold buffer A (0.010 m (pH 7.9) HEPES, 0.010 m KCl, 0.0001m EDTA, 0.001 m dithiothreitol, and 0.5 mm phenylmethylsulfonyl fluoride) and incubated on ice for 15 min, and then Nonidet P-40 (10%, 0.025 ml) was added. After vortexing for 15 s, cell lysates were centrifuged for 30 min at 13,000 rpm at 4 °C, the supernatant was removed, and the nuclear pellet was washed once with buffer A as above (1 ml), and resuspended in 0.1 ml of ice-cold buffer B (0.020 m (pH 7.9) HEPES, 0.4m NaCl, 0.001 m EDTA, 0.001 mdithiothreitol, and 0.001 m phenylmethylsulfonyl fluoride PMSF) for 15 min at 4 °C with constant agitation. The nuclear lysate was then centrifuged at 13,000 rpm for 10 min at 4 °C, and the nuclear extract collected. The concentration of nuclear protein was determined at A 280 using an Ultra-Spec spectrophotometer (Pharmacia Biotech Inc.). DNase I footprinting assay was employed to determine the binding capabilities of the three putative NF-κB-like binding sites in the 5′-flanking region of the human RAGE gene as revealed by computer analysis (Genetics Computer Group; Ref.28Devereux J. Haeberli P. Smithies O. Nucleic Acids Res. 1984; 12: 387-395Crossref PubMed Scopus (12575) Google Scholar). Three probes were amplified from the 5′-flanking region of the human RAGE gene by PCR with [γ-32P]ATP-labeled sense primer and unlabeled antisense primer. The first probe, containing NF-κB-like binding site 1, spanned the region from −1581 to −738 of the 5′-flanking region. The second probe, containing NF-κB-like binding site 2, spanned the region from −721 to −399 of the 5′-flanking region. The third probe, containing NF-κB-like binding site 3, spanned the region from −587 to −399 of the 5′-flanking region. DNase I footprinting assay was performed according to previously published methods (29Beg A.A. Finco T.S. Nanterment P.V. Baldwin A.S. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 3301-3310Crossref PubMed Google Scholar). For each DNase I nicking reaction, 30–50 ng of the 5′-end-labeled DNA fragments were diluted to ≈0.7 nm in a final volume of buffer (0.1 ml) containing 0.02m Tris-HCl (pH 7.4), 0.002 m MgCl2, 0.001 m CaCl2, 0.0001 m EDTA, 0.040m KCl, 100 μg/ml bovine serum albumin, and 20 μg/ml salmon sperm DNA, and preincubated with 2–10 gel shift units of purified human NF-κB p50 (Promega) for 10 min on ice. DNase I (30 ng/ml) was added. After incubation for another 1 min at room temperature, reactions were terminated by the addition of stop reagent (0.05 ml) containing 0.1 m EDTA (pH 8.0), 0.8% SDS, 1.6m ammonium acetate, and 300 μg/ml salmon sperm DNA. After extraction with phenol:chloroform (1:1), nucleic acids were ethanol-precipitated, dried, and dissolved in 0.003 ml of formamide (96%, v/v) containing tracking dyes. Samples were then loaded onto a polyacrylamide gel (8%) containing urea (7 m) and electrophoresed. Dideoxy sequencing of the 5′-flanking region of the RAGE gene using the same sense primers as above was carried out as DNA sequence ladders. Based on the results of DNase I footprinting assays indicating that only NF-κB sites 1 and 2 were likely to be functional, two NF-κB-like binding site oligonucleotide probes were created by annealing the oligonucleotides 5′-CTCGGAGGGAGTTTCTGCTA-3′ and 5′-TAGCAGAAACTCCCTCCGAG-3′ for NF-κB site 1 and 5′-AGAGTGGGGAACCCCTCCCA-3′ and 5′-TGGGAGGGGTTCCCCACTCT-3′ for NF-κB site 2 and end-labeled with [γ-32P]ATP. Approximately 150 pg of the labeled probes was incubated with 20 μg of nuclear extracts at room temperature for 30 min. For competition assays, nuclear extracts were first incubated with 100-fold excess of the unlabeled oligonucleotides for 15 min at room temperature and then incubated with the end-labeled oligonucleotides for 30 min under the same condition as above. To test if sequences from the NF-κB binding site 1 and 2 competed with consensus probe, nuclear extracts obtained from HeLa cells (Promega; Ref. 30Kristie T.M. LeBowitz J.H. Sharp P.A. EMBO J. 1989; 8: 4229-4238Crossref PubMed Scopus (196) Google Scholar) were preincubated with the indicated concentration of the RAGE promoter-specific unlabeled oligonucleotides for 15 min at room temperature, and then incubated with the end-labeled consensus NF-κB probe for 30 min as above. For supershift assays, antibody to p50, p65 or c-Rel (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) was preincubated with nuclear extract from stimulated BAECs or RSMCs using the same conditions as described above, prior to the addition of the labeled binding site oligonucleotides. Samples were then loaded onto polyacrylamide gels and run with buffer containing 0.09 m Tris borate (pH 8.3) and 0.0025 m EDTA at 10 V/cm for 4 h. The constructs utilized for transfection experiments were created by cloning into the pGL3-Basic vector (Promega) different fragments of DNA from the 5′-flanking region of the human RAGE gene, either by using compatible restriction sites or by amplifying the specific regions with PCR. The PCR primers used in this study were designed according to the sequence of the 5′-flanking region of the RAGE gene (Fig. 1), and all inserts derived from PCR amplification and cloned into the pGL3-Basic vector were sequenced on both strands. Cells were isolated and grown/maintained as described above. Transfection of BAECs and RSMCs was performed with LipofectAMINE (Life Technologies, Inc.) according to the manufacturer's recommendations. Briefly, 2 × 105cells were plated into the wells of six-well tissue culture plates (Corning, Corning, NY) 1 day prior to transfection. The DNA mixture was composed of test plasmid (2 μg) and pSV β-galactosidase (0.5 μg), which served as an internal control to normalize activities of luciferase. Cells were exposed to the mixture of LipofectAMINE and plasmid for 5 h. Following removal of the transfection reagent, fresh medium was added and the incubation continued for 48 h. Prior to studies of basal/stimulated function of the RAGE promoter, BAECs or RSMCs were washed with phosphate-buffered saline and placed in medium as above, except that serum was omitted for 8 h prior to exposure to stimuli. Where indicated, stimulus (LPS) was added to the medium 8 h prior to harvesting. Luciferase activity was determined using standard reagents (Promega) and measured in a luminometer (Wallac, Gaithersburg, MD) as directed, and results standardized for β-galactosidase activity. Acid phenol-guanidinium thiocyanate procedure (31Chirgwin J. Przbyla A. MacDonald R. Rutter W. Biochemistry. 1979; 18: 5294-5299Crossref PubMed Scopus (18696) Google Scholar) was used to isolate total RNA from BAECs or RSMCs in the presence or absence of stimulation with LPS for 8 or 16 h as indicated (after serum deprivation as above). The concentration of total RNA was determined by adsorption atA 260/280 and total RNA (20 μg/lane) was subjected to electrophoresis. After electrophoretic separation on a formaldehyde gel (0.7%), the RNA was transferred to a Gene Screen hybridization filter (DuPont NEN) and linked by a UV cross-linker (Stratagene). The filter was then hybridized with the full-length human RAGE cDNA probe or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase cDNA probe labeled with [γ-32P]dCTP using the Random Primer Labeling System (Stratagene). After washing twice at room temperature (15 min/wash) with SSC (2 ×) containing SDS (0.1%) and once for 30 min at 60 °C with SSC (0.1 ×) containing SDS (0.1%), the filter was subjected to autoradiography overnight at −80 °C. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase message was used as control to normalize to counts in the RAGE message by densitometry. Mutation constructs were generated by PCR. The resulting PCR fragments were then subcloned into the pGL3-Basic vector and subjected to sequence analysis prior to transfection studies. pGL-B contains the wild-type construct, −1543 to +49. pGL-C, pGL-D, and pGL-G each contain the region −1543 to +49, but with the mutation(s) indicated below. To determine if differences between luciferase activity between the various constructs utilized in these studies were statistically significant, analysis of variance (ANOVA) was used. Primer extension analysis was used to map the transcription start site. To identify multiple potential start sites, two primers were designed, Pe-5 corresponding to −104 to −83 of the 5′-flanking region of the human RAGE gene and Pe-6 corresponding to +18 to +41 of the human RAGE cDNA. An extended product of 41 nucleotides was obtained by using primer Pe-6 (Fig. 2), but no extended product was found by using primer Pe-5 (data not shown). These results indicated that the human RAGE gene has only one major transcription start site, a thymidine residue, designated as “+1.” The translation start site is indicated by a bold arrow above the “A” of the ATG codon (Fig. 1). Computer analysis (Genetics Computer Group; Ref. 28Devereux J. Haeberli P. Smithies O. Nucleic Acids Res. 1984; 12: 387-395Crossref PubMed Scopus (12575) Google Scholar) was employed to match potential transcription factor binding sites in the RAGE promoter by comparison of the genomic DNA sequence upstream of the identified transcription start site with known transcription factor binding consensus sequences. The search revealed three putative NF-κB-like consensus sequences (GDRRADYCCC) at −1518 to −1510 (referred to as 1), −671 to −663 (referred to as 2) and −467 to 458 (referred to as 3). Other general consensus sequences such as SP1, AP-2, γ-IRE, and NF-IL6 were also identified (Fig. 1). However, further examination of the sequence failed to identify classic TATA and CAAT boxes at the appropriate positions. To determine the functional capacity of the putative NF-κB-like binding sites located within the RAGE promoter, DNase I footprinting analysis was performed. Using purified human NF-κB p50, protection of only the first two NF-κB-like binding sites (sites 1 and 2) was observed (Fig. 3). The first NF-κB-like binding site spanned nucleotide coordinates −1518/−1510 (NF-κB site 1), and the second spanned nucleotide coordinates −671/−663 (NF-κB site 2) (Fig. 1). In contrast, addition of purified p50 failed to protect the third NF-κB-like site, which spanned nucleotide coordinates −467/−458, even by increasing the amount of NF-κB p50 (total amount of 10 gel shift units; data not shown). Consistent with these observations, the sequences of nucleotides comprising footprints at sites 1 and 2 were 95% and 50% identical to NF-κB consensus sequences, respectively. Despite the fact that nucleotides comprising NF-κB site 3 demonstrated 50% identity with NF-κB consensus sequences, the lack of a footprint at this site indicates that other factors impact on its potential functional capacity, or that this site was not a functional site for transcription factor NF-κB. To assess which portions of the promoter were involved in regulation of basal expression of RAGE, a series of chimeric 5′-deletion promoter-luciferase reporter constructs was developed (Fig.4 A). As indicated, pGL-B consisted of 1543 bp upstream of the transcription start site and pGL-E contained 738 bp upstream of the transcriptional start site. pGL-B-R, used as negative control, contained the same insert as pGL-B but in the opposite orientation. These 5′-flanking sequences of the human RAGE gene were cloned upstream of the luciferase gene in the pGL3-Basic vector (Fig. 4 A). The resulting plasmids were then transfected into BAECs or RSMCs. 48 h after transfection, cell lysates were prepared and tested in the luciferase assay. pGL-3 control vector (Promega), a luciferase expression vector containing a SV40 promoter and enhancer, served as positive control. Efficiency of transfection was assessed by monitoring simultaneous transfection with another plasmid containing the β-galactosidase gene. (Thus, data are reported as normalized luciferase activity based on measurement of β-galactosidase.) Although the construct pGL-B demonstrated weaker basal promoter function than the construct pGL-E in both BAECs and RSMCs (p < 0.05 in both cases), transfection with pGL-B or pGL-E resulted in significant increases of luciferase activity in both cell types compared with the construct pGL-B-R (p < 0.001). These results indicated that both −1543/+49 and −738/+49 constructs contained motifs that contributed to basal expression in BAECs and RSMCs, although the latter construct seemed to have a greater promoter activity than the former under the present conditions. To identify regions essential for basal promoter activity, we prepared three additional chimeric 5′-deletion promoter-reporter gene constructs, pGL-21 (containing 587 bp upstream of the transcriptional start site), pGL-22 (containing 202 bp upstream of the transcriptional start site), and pGL-23 (containing 55 bp upstream of the transcriptional start site) (Fig. 4 A). These constructs were then transfected into BAECs and RSMCs. Transfection of either pGL-21 or pGL-23 resulted in luciferase expression, although relative luciferase activity was significantly less than that observed with pGL-B or pGL-E. Furthermore, pGL-22 demonstrated strikingly diminished basal promoter activity compared with pGL-B and pGL-E in both cell types (Fig.4 B). These data indicated that the region 55 bp upstream of the start site contained motifs demonstrating promoter activity for RAGE, and that enhancement motifs for basal expression of the RAGE gene may exist within the −1543/−587 region. In contrast, negative regulatory elements are likely contained within the −202/−55 region. 5′-Deletion constructs as above were used to transfect BAECs (Fig. 5 A) or RSMCs (Fig.5 B) alone or in the presence of LPS. In both cell types, LPS stimulation significantly increased luciferase expression of the constructs pGL-B (∼4.1-fold for BAECs and ∼6.0-fold for RSMCs compared with basal conditions; p < 0.01 in both cases) and pGL-E (∼3.7-fold for BAECs and ∼3.8-fold for RSMCs compared with basal conditions; p < 0.01 in both cases). Unlike basal expression, no signi

Genomic landscapes of 92 adult and 111 pediatric patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) were investigated using next-generation sequencing and copy number alteration analysis. Recurrent gene mutations and fusions were tested in an additional 87 adult and 93 pediatric patients. Among the 29 newly identified in-frame gene fusions, those involving MEF2D and ZNF384 were clinically relevant and were demonstrated to perturb B-cell differentiation, with EP300-ZNF384 inducing leukemia in mice. Eight gene expression subgroups associated with characteristic genetic abnormalities were identified, including leukemia with MEF2D and ZNF384 fusions in two distinct clusters. In subgroup G4 which was characterized by ERG deletion, DUX4-IGH fusion was detected in most cases. This comprehensive dataset allowed us to compare the features of molecular pathogenesis between adult and pediatric B-ALL and to identify signatures possibly related to the inferior outcome of adults to that of children. We found that, besides the known discrepancies in frequencies of prognostic markers, adult patients had more cooperative mutations and greater enrichment for alterations of epigenetic modifiers and genes linked to B-cell development, suggesting difference in the target cells of transformation between adult and pediatric patients and may explain in part the disparity in their responses to treatment.

Significance In BCP ALL, molecular classification is used for risk stratification and influences treatment strategies. We reanalyzed the transcriptomic landscape of 1,223 BCP ALLs and identified 14 subgroups based on their transcriptional profiles. Eight of these (G1 to G8) are previously well-known subgroups, harboring specific genetic abnormalities. The sample size allowed the identification of six previously undescribed subgroups, consisting of cases harboring PAX5 or CRLF2 fusions (G9), PAX5 (p.P80R) mutations (G10), IKZF1 (p.N159Y) mutations (G11), either ZEB2 (p.H1038R) mutations or IGH–CEBPE fusions (G12), HLF rearrangements (G13), or NUTM rearrangements (G14). In addition, this study allowed us to determine the prognostic impact of several recently defined subgroups. This study suggests that RNA sequencing should be a valuable tool in the routine diagnostic workup for ALL.

ARTD1 (PARP1) is a key enzyme involved in DNA repair through the synthesis of poly(ADP-ribose) (PAR) in response to strand breaks, and it plays an important role in cell death following excessive DNA damage. ARTD1-induced cell death is associated with NAD(+) depletion and ATP loss; however, the molecular mechanism of ARTD1-mediated energy collapse remains elusive. Using real-time metabolic measurements, we compared the effects of ARTD1 activation and direct NAD(+) depletion. We found that ARTD1-mediated PAR synthesis, but not direct NAD(+) depletion, resulted in a block to glycolysis and ATP loss. We then established a proteomics-based PAR interactome after DNA damage and identified hexokinase 1 (HK1) as a PAR binding protein. HK1 activity is suppressed following nuclear ARTD1 activation and binding by PAR. These findings help explain how prolonged activation of ARTD1 triggers energy collapse and cell death, revealing insight into the importance of nucleus-to-mitochondria communication via ARTD1 activation.

Objective: To explore the clinical efficacy of acupotomy combined with ultrasound therapy for calcific tendinitis under musculoskeletal ultrasound guidance. Methods: A total of 72 patients with calcific tendinitis were randomly divided into two groups. The control group received acupotomy treatment under ultrasound guidance, while the observation group underwent acupotomy combined with ultrasound under ultrasound guidance. Visual analog scale (VAS) scores, joint function scores, and calcific lesion reduction rates were compared between the observation group and the control group before and after treatment, as well as at various follow-up points. Results: Compared with the control group, the observation group had lower VAS scores after treatment and at four weeks post-treatment, and higher joint function scores after treatment and at four weeks, three months, and six months post-treatment (all P < 0.05). Additionally, the observation group showed greater changes in calcific lesion reduction rates after treatment and at four weeks post-treatment compared to the control group (P < 0.05). Conclusion: Acupotomy combined with ultrasound therapy under ultrasound guidance can alleviate pain and improve joint function in patients with calcific tendinitis.

Abstract Prostate cancer (PCa) is the most prevalent type of cancer and the second leading cause of mortality in males, with a marked increase in incidence observed across the globe. In the present study, whole-transcriptome analysis was conducted to identify differentially expressed circular RNAs (DE-circRNAs). The coding abilities of the DE-circRNAs were analyses, and it was found that hsa_circ_0085121 (circRNF19A) not only exhibited overexpression in PCa cells and tumor samples, but also encoded a 490 amino acid polypeptide designated circRNF19A-490aa. The knockdown of circRNF19A was observed to notably inhibit the proliferation, invasion, migration and docetaxel resistance of PCa cells. In contrast, mutation of the IRES significantly impaired the tumor-promoting function of circRNF19A, indicating that circRNF19A-490aa is the primary form that regulates the malignant behaviors of PCa cells. Mechanistically, circRNF19A-490aa was demonstrated to interact with HSP90AA1, thereby enhancing AR activity and facilitating the activation of the Akt/mTOR and PLK1 pathways. Furthermore, circRNF19A-490aa was observed to interact with HNRNPF, facilitating the recruitment of HNRNPF to the splicing site of AR-V7 and enhancing its alternative splicing. Finally, the androgen receptor (AR) was observed to bind to the promoter region of the RNF19A gene, subsequently regulating the expression of circRNF19A and circRNF19A-490aa. These data indicate that circRNF19A plays a pivotal role in AR activation and AR-V7 generation by encoding a novel protein, circRNF19A-490aa, and targeting circRNF19A may prove an effective strategy for impeding the progression of CRPC.

Abstract Background Immunotherapies targeting immune checkpoints have gained increasing attention in cancer treatment, emphasizing the need for predictive biomarkers. Circular RNAs (circRNAs) have emerged as critical regulators of tumor immunity, particularly in the PD- 1/PD-L1 pathway, and have shown potential in predicting the efficacy of immunotherapies. However, the precise roles of circRNAs in cancer immunotherapy remain incompletely understood. While existing databases focus on either circRNA profiles or immunotherapy cohorts, there is currently no platform that enables the exploration of the intricate interplay between circRNAs and anti-tumor immunotherapy. Therefore, the development of a comprehensive resource that integrates circRNA profiles, immunotherapy response data, and clinical benefits is crucial for advancing our understanding of circRNA-mediated tumor-immune interactions and developing effective immunotherapy biomarkers. Methods To address these gaps, we constructed the Cancer CircRNA Immunome Atlas (TCCIA), the first database that combines circRNA profiles, immunotherapy response data, and clinical outcomes across multi-cancer types. The construction of TCCIA involved applying standardized preprocessing to the raw sequencing FASTQ files, characterizing circRNA profiles using CIRCexplorer2, analyzing tumor immunophenotypes through IOBR, and compiling immunotherapy response data from diverse cohorts treated with immune-checkpoint blockades (ICBs). Results TCCIA encompasses over 3,700 clinical samples obtained from 18 cohorts treated with ICBs, including PD-1/PD-L1 and CTLA-4 inhibitors, along with other treatment modalities. The database provides researchers and clinicians with a cloud-based platform that enables interactive exploration of circRNA data in the context of ICB. The platform offers a range of analytical tools, including visualization of circRNA abundance and correlation, association analysis between circRNAs and clinical variables, assessment of the tumor immune microenvironment, exploration of tumor molecular signatures, evaluation of treatment response or prognosis, and identification of altered circRNAs in immunotherapy-sensitive and resistant tumors. To illustrate the utility of TCCIA, we performed a re-analysis on a melanoma cohort with TCCIA, and found that an isoform of circTMTC3, TMTC3:+:chr12:88148287:88176319, played a significant role in predicting unfavorable survival outcomes and treatment nonresponse. Conclusions TCCIA represents a significant advancement over existing resources, providing a comprehensive platform to investigate the role of circRNAs in immune oncology. What is already known on this topic Prior knowledge indicated that circRNAs are involved in tumor immunity and have potential as predictive biomarkers for immunotherapy efficacy. However, there lacked a comprehensive database that integrated circRNA profiles and immunotherapy response data, necessitating this study. What this study adds This study introduces TCCIA, a database that combines circRNA profiles, immunotherapy response data, and clinical outcomes. It provides a diverse collection of clinical samples and an interactive platform, enabling in-depth exploration of circRNAs in the context of checkpoint-blockade immunotherapy. How this study might affect research, practice or policy The findings of this study offer valuable insights into the roles of circRNAs in tumor-immune interactions and provide a resource for researchers and clinicians in the field of immune-oncology. TCCIA has the potential to guide personalized immunotherapeutic strategies and contribute to future research, clinical practice, and policy decisions in checkpoint-blockade immunotherapy and biomarker development.