Endocytosis and lysosomal trafficking of cell surface receptors can be triggered by interaction with endogenous ligands. Therapeutic approaches such as LYTAC1,2 and KineTAC3, have taken advantage of this to target specific proteins for degradation by fusing modified native ligands to target binding proteins. While powerful, these approaches can be limited by possible competition with the endogenous ligand(s), the requirement in some cases for chemical modification that limits genetic encodability and can complicate manufacturing, and more generally, there may not be natural ligands which stimulate endocytosis through a given receptor. Here we describe general protein design approaches for designing endocytosis triggering binding proteins (EndoTags) that overcome these challenges. We present EndoTags for the IGF-2R, ASGPR, Sortillin, and Transferrin receptors, and show that fusing these tags to proteins which bind to soluble or transmembrane protein leads to lysosomal trafficking and target degradation; as these receptors have different tissue distributions, the different EndoTags could enable targeting of degradation to different tissues. The modularity and genetic encodability of EndoTags enables AND gate control for higher specificity targeted degradation, and the localized secretion of degraders from engineered cells. The tunability and modularity of our genetically encodable EndoTags should contribute to deciphering the relationship between receptor engagement and cellular trafficking, and they have considerable therapeutic potential as targeted degradation inducers, signaling activators for endocytosis-dependent pathways, and cellular uptake inducers for targeted antibody drug and RNA conjugates.

Abstract Multispectral imaging is an established method to extend the number of colours usable in fluorescence imaging beyond the typical limit of three or four, but standard approaches are poorly suited to live-cell imaging. We introduce an approach for multispectral imaging in live cells, comprising an iterative spectral unmixing algorithm and eight channel camera-based image acquisition hardware. This enables the accurate unmixing of low signal-to-noise ratio datasets, typical of live-cell imaging, captured at video rates. We use this approach on a commercial spinning disk confocal microscope and a home-built oblique plane light sheet microscope to image 1–7 spectrally distinct fluorophore species simultaneously, using both fluorescent protein fusions and small-molecule dyes. We further use de novo designed protein-binding proteins (minibinders), labelled with organic fluorophores, and use these in combination with our multispectral imaging approach to study the endosomal trafficking of cell-surface receptors at endogenous levels.

Abstract Protein phosphorylation is a reversible post-translation modification essential in cell signaling. This study addresses a long-standing question as to how the most abundant serine/threonine Protein Phosphatase 2 (PP2A) holoenzyme, PP2A/B55α, specifically recognizes substrates and presents them to the enzyme active site. Here, we show how the PP2A regulatory subunit B55α recruits p107, a pRB-related tumor suppressor and B55α substrate. Using molecular and cellular approaches, we identified a conserved region 1 (R1, residues 615-626) encompassing the strongest p107 binding site. This enabled us to identify an “HxRVxxV 619-625 ” short linear motif (SLiM) in p107 as necessary for B55α binding and dephosphorylation of the proximal pSer-615 in vitro and in cells. Numerous B55α/PP2A substrates, including TAU, contain a related SLiM C-terminal from a proximal phosphosite, “ p [ ST ]- P- x(5-10)-[ RK ]- V -x-x-[ VI ]- R ”. Mutation of conserved SLiM residues in TAU dramatically inhibits dephosphorylation by PP2A/B55α, validating its generality. A data-guided computational model details the interaction of residues from the conserved p107 SLiM, the B55α groove, and phosphosite presentation. Altogether these data provide key insights into PP2A/B55α mechanisms of substrate recruitment and active site engagement, and also facilitate identification and validation of new substrates, a key step towards understanding PP2A/B55〈 role in multiple cellular processes.

Summary Integrin α5β1 is crucial for cell attachment and migration in development and tissue regeneration, and α5β1 binding proteins could have considerable utility in regenerative medicine and next-generation therapeutics. We use computational protein design to create de novo α5β1-specific modulating miniprotein binders, called NeoNectins, that bind to and stabilize the open state of α5β1. When immobilized onto titanium surfaces and throughout 3D hydrogels, the NeoNectins outperform native fibronectin and RGD peptide in enhancing cell attachment and spreading, and NeoNectin-grafted titanium implants outperformed fibronectin and RGD-grafted implants in animal models in promoting tissue integration and bone growth. NeoNectins should be broadly applicable for tissue engineering and biomedicine. One-Sentence Summary A de novo-designed fibronectin substitute, NeoNectin, is specific for integrin α5β1 and can be incorporated into biomaterials for regenerative medicine.

The gut microbiome plays a crucial role in the development of intestinal immunity during early life, but the underlying mechanisms remain largely unknown. Here, we found oxygen consumption in neonatal rats by S. boulardii accelerated the colonization of the microbiome and the development of type 3 immunity, which protected against S. typhimurium. Microbiome maturation increased the abundance of microbiome-encoded bile salt hydrolase (BSH) genes and elevated the levels of Hyocholic acid (HCA). HCA promotes the development of γδT and type 3 innate lymphoid cell (ILC3) by sustaining the stability of Rorc mRNA via the FXR-WTAP-N6-methyl-adenosine (m6A) axis. L. reuteri, a bacterium encoding BSH, was enriched by oxygen consumption in the intestine and promoted intestinal type 3 immunity. However, inhibition of BSH blocks the L. reuteri-induced development of intestinal type 3 immunity. These results reveal the role of microbiome-derived HCA in the regulation of intestinal type 3 immunity during early life.

Abstract Clostridioides difficile is a major cause of secondary disease in hospitals. During infection, C. difficile toxin B drives disease pathology. Here we use deep learning and Rosetta-based approaches to de novo design small proteins that block the entry of TcdB into cells. These molecules have binding affinities and neutralization IC50’s in the pM range and are compelling candidates for further clinical development. By directly targeting the toxin rather than the pathogen, these molecules have the advantage of immediate cessation of disease and lower selective pressure for escape compared to conventional antibiotics. As C. difficile infects the colon, the protease and pH resistance of the designed proteins opens the door to oral delivery of engineered biologics. Significance statement C. difficile infection (CDI) is a major public health concern with over half a million cases in the United States annually resulting in 30,000 deaths. Current therapies are inadequate and frequently result in cycles of recurrent infection (rCDI). Progress has been made in the development of anti-toxin mAb therapies that can reduce the rate of rCDI, but these remain unaffordable and out of reach for many patients. Using de novo protein design, we developed small protein inhibitors targeting two independent receptor binding sites on the toxin that drives pathology during CDI. These molecules are high affinity, potently neutralizing and stable in simulated intestinal fluid, making them strong candidates for the clinical development of new CDI therapies.

Endocytosis and lysosomal trafficking of cell surface receptors can be triggered by endogenous ligands. Therapeutic approaches such as lysosome-targeting chimaeras