Smad family members are newly identified essential intracellular signalling components of the transforming growth factor‐β (TGF‐β) superfamily. Smad2 and Smad3 are structurally highly similar and mediate TGF‐β signals. Smad4 is distantly related to Smads 2 and 3, and forms a heteromeric complex with Smad2 after TGF‐β or activin stimulation. Here we show that Smad2 and Smad3 interacted with the kinase‐deficient TGF‐β type I receptor (TβR)‐I after it was phosphorylated by TβR‐II kinase. TGF‐β1 induced phosphorylation of Smad2 and Smad3 in Mv1Lu mink lung epithelial cells. Smad4 was found to be constitutively phosphorylated in Mv1Lu cells, the phosphorylation level remaining unchanged upon TGF‐β1 stimulation. Similar results were obtained using HSC4 cells, which are also growth‐inhibited by TGF‐β. Smads 2 and 3 interacted with Smad4 after TβR activation in transfected COS cells. In addition, we observed TβR‐activation‐dependent interaction between Smad2 and Smad3. Smads 2, 3 and 4 accumulated in the nucleus upon TGF‐β1 treatment in Mv1Lu cells, and showed a synergistic effect in a transcriptional reporter assay using the TGF‐β‐inducible plasminogen activator inhibitor‐1 promoter. Dominant‐negative Smad3 inhibited the transcriptional synergistic response by Smad2 and Smad4. These data suggest that TGF‐β induces heteromeric complexes of Smads 2, 3 and 4, and their concomitant translocation to the nucleus, which is required for efficient TGF‐β signal transduction.

Smad7 is an inhibitory Smad that acts as a negative regulator of signaling by the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily proteins. Smad7 is induced by TGF-β, stably interacts with activated TGF-β type I receptor (TβR-I), and interferes with the phosphorylation of receptor-regulated Smads. Here we show that Smurf1, an E3 ubiquitin ligase for bone morphogenetic protein-specific Smads, also interacts with Smad7 and induces Smad7 ubiquitination and translocation into the cytoplasm. In addition, Smurf1 associates with TβR-I via Smad7, with subsequent enhancement of turnover of TβR-I and Smad7. These results thus reveal a novel function of Smad7, i.e. induction of degradation of TβR-I through recruitment of an E3 ligase to the receptor. Smad7 is an inhibitory Smad that acts as a negative regulator of signaling by the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily proteins. Smad7 is induced by TGF-β, stably interacts with activated TGF-β type I receptor (TβR-I), and interferes with the phosphorylation of receptor-regulated Smads. Here we show that Smurf1, an E3 ubiquitin ligase for bone morphogenetic protein-specific Smads, also interacts with Smad7 and induces Smad7 ubiquitination and translocation into the cytoplasm. In addition, Smurf1 associates with TβR-I via Smad7, with subsequent enhancement of turnover of TβR-I and Smad7. These results thus reveal a novel function of Smad7, i.e. induction of degradation of TβR-I through recruitment of an E3 ligase to the receptor. Members of the transforming growth factor-β (TGF-β) 1The abbreviations used are:TGF-βtransforming growth factor-βR-Smad(s)receptor-regulated Smad(s)Co-Smad(s)common-partner Smad(s)I-Smad(s)inhibitory Smad(s)BMP(s)bone morphogenetic protein(s)PAGEpolyacrylamide gel electrophoresisFITCfluorescein isothiocyanateRITCrhodamine isothiocyanateHAhemagglutininWTwild type superfamily initiate cellular responses (1Roberts A.B. Sporn M.B. Sporn M.B. Roberts A.B. Pepide Growth Factors and Their Receptors, Part I. Springer-Verlag, Heidelberg1990: 419-472Google Scholar) by binding to two different types of serine/threonine kinase receptors, termed type I and type II. Type I receptor is activated by type II receptor upon ligand binding and mediates specific intracellular signals (2Massagué J. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 753-791Crossref PubMed Scopus (4041) Google Scholar). Members of the TGF-β superfamily transduce intracellular signals by Smad proteins. Eight different Smad proteins have been identified in mammals and are classified into three subgroups, i.e. receptor-regulated Smads (R-Smads), common-partner Smads (Co-Smads), and inhibitory Smads (I-Smads) (3Heldin C.-H. Miyazono K. ten Dijke P. Nature. 1997; 390: 465-471Crossref PubMed Scopus (3395) Google Scholar, 4Derynck R. Zhang Y. Feng X.-H. Cell. 1998; 95: 737-740Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (960) Google Scholar, 5Attisano L. Wrana J.L. Curr. Opin. Cell Biol. 2000; 12: 235-243Crossref PubMed Scopus (481) Google Scholar). transforming growth factor-β receptor-regulated Smad(s) common-partner Smad(s) inhibitory Smad(s) bone morphogenetic protein(s) polyacrylamide gel electrophoresis fluorescein isothiocyanate rhodamine isothiocyanate hemagglutinin wild type R-Smads and Co-Smads positively regulate signaling by the TGF-β superfamily (3Heldin C.-H. Miyazono K. ten Dijke P. Nature. 1997; 390: 465-471Crossref PubMed Scopus (3395) Google Scholar, 4Derynck R. Zhang Y. Feng X.-H. Cell. 1998; 95: 737-740Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (960) Google Scholar, 5Attisano L. Wrana J.L. Curr. Opin. Cell Biol. 2000; 12: 235-243Crossref PubMed Scopus (481) Google Scholar). R-Smads directly interact with type I receptors and become activated through phosphorylation of the C-terminal SSXS motif. R-Smads then form heteromeric complexes with Co-Smads (Smad4) and translocate into the nucleus. Nuclear Smad complexes bind to transcriptional coactivators or corepressors and regulate transcription of target genes. Smad2 and Smad3 act in the TGF-β/activin pathway, whereas Smad1, Smad5, and Smad8 are thought to act as bone morphogenetic protein (BMP)-specific Smads. The third class of Smads are I-Smads, which include Smad6 and Smad7 in mammals (6Imamura T. Takase M. Nishihara A. Oeda E. Hanai J. Kawabata M. Miyazono K. Nature. 1997; 389: 622-626Crossref PubMed Scopus (883) Google Scholar, 7Hayashi H. Abdollah S. Qiu Y. Cai J. Xu Y.Y. Grinnell B.W. Richardson M.A. Topper J.N. Gimbrone Jr., M.A. Wrana J.L. Falb D. Cell. 1997; 89: 1165-1173Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1181) Google Scholar, 8Nakao A. Afrakhte M. Moren A. Nakayama T. Christian J.L. Heuchel R. Itoh S. Kawabata M. Heldin N.-E. Heldin C.-H. ten Dijke P. Nature. 1997; 389: 631-635Crossref PubMed Scopus (1591) Google Scholar). I-Smads associate with activated TGF-β superfamily type I receptors, thereby preventing phosphorylation of R-Smads. In addition, Smad6 has been demonstrated to interact with phosphorylated Smad1 to prevent complex formation between Smad1 and Smad4 (9Hata A. Lagna G. Massagué J. Hemmati-Brivanlou A. Genes Dev. 1998; 12: 186-197Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar). Smad6 was also reported to interact with Hoxc-8 and function as a transcriptional corepressor for inhibition of BMP signaling (10Bai S. Shi X. Yang X. Cao X. J. Biol. Chem. 2000; 275: 8267-8270Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (125) Google Scholar). Because expression of Smad6 and Smad7 is induced by TGF-β and BMPs, I-Smads inhibit TGF-β superfamily signaling by a negative feedback system (11Miyazono K. J. Cell Sci. 2000; 113: 1101-1109Crossref PubMed Google Scholar). Ubiquitin-dependent protein degradation plays a key role in various biological processes, including signal transduction, cell cycle progression, and transcriptional regulation (12Hershko A. Ciechanover A. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 425-479Crossref PubMed Scopus (7090) Google Scholar). In the TGF-β signaling pathways, R-Smads, e.g. Smad2 and Smad1/5, have recently been shown to be degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Smad2 activated by TGF-β is degraded by the ubiquitin-proteasome pathway after translocation into the nucleus (13Lo R.S. Massagué J. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 472-478Crossref PubMed Scopus (299) Google Scholar). Smurf1, a member of the HECT family of E3 ubiquitin ligases, ligand-independently induces the ubiquitination and degradation of BMP-specific Smads 1 and 5 through binding to a PY motif in the linker regions (14Zhu H. Kavsak P. Abdollah S. Wrana J.L. Thomsen G.H. Nature. 1999; 400: 687-693Crossref PubMed Scopus (706) Google Scholar). Here we demonstrate a novel function of Smurf1 in receptor degradation in TGF-β superfamily signaling. Inhibitory Smad7 associates with Smurf1 in the nucleus and is exported to the cytoplasm. Smad7 thus recruits Smurf1 to TβR-I, resulting in the degradation and rapid turnover of the TβR-I protein. COS7 cells or 293T cells were transiently transfected using FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals). Immunoprecipitation and immunoblotting were performed as described (15Ebisawa T. Tada K. Kitajima I. Tojo K. Sampath T.K. Kawabata M. Miyazono K. Imamura T. J. Cell Sci. 1999; 112: 3519-3527Crossref PubMed Google Scholar). For inhibition of proteasomal degradation, cells were incubated with 50 μm MG132 (Peptide Institute) or 10 μm lactacystin (Calbiochem) for 4 h. Each experiment has been repeated at least three times with essentially similar results. Recombinant TGF-β1 (R & D Systems) was iodinated using the chloramine T method. Cross-linking was performed on ice to avoid degradation of the receptors and other proteins. Subsequent immunoprecipitation and analysis by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were performed as described (15Ebisawa T. Tada K. Kitajima I. Tojo K. Sampath T.K. Kawabata M. Miyazono K. Imamura T. J. Cell Sci. 1999; 112: 3519-3527Crossref PubMed Google Scholar). Immunohistochemical staining of 6Myc-Smad7 in transfected COS7 cells was performed using mouse anti-Myc antibody followed by incubation with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled goat anti-mouse IgG as described (15Ebisawa T. Tada K. Kitajima I. Tojo K. Sampath T.K. Kawabata M. Miyazono K. Imamura T. J. Cell Sci. 1999; 112: 3519-3527Crossref PubMed Google Scholar). For double staining of Smad7 and Smurf1, immunohistochemical staining of FLAG-Smad7 and 6Myc-Smurf1 was performed using mouse anti-FLAG or rabbit anti-Myc antibody followed by incubation with FITC-labeled goat anti-mouse IgG or rhodamine isothiocyanate (RITC)-labeled goat anti-rabbit IgG, respectively. Nuclei of the cells were stained by 4,6-diamidino-2-phenylindole. Intracellular localization was determined by confocal laser scanning microscopy. Cells were labeled for 10 min at 37 °C with 50 mCi/ml [35S]methionine and cysteine (Amersham Pharmacia Biotech) in methionine- and cysteine-free Dulbecco's modified Eagle's medium and chased as described (13Lo R.S. Massagué J. Nat. Cell Biol. 1999; 1: 472-478Crossref PubMed Scopus (299) Google Scholar). Cells were then lysed and subjected to immunoprecipitation. R mutant mink lung epithelial cells were transiently transfected with an appropriate combination of a p3TP-lux promoter-reporter construct, expression plasmids, and pcDNA3. Total amounts of transfected DNAs were the same in each experiment, and values were normalized using Renilla luciferase activity. Smurf1 has been identified as an E3 ubiquitin ligase for BMP-specific Smads (14Zhu H. Kavsak P. Abdollah S. Wrana J.L. Thomsen G.H. Nature. 1999; 400: 687-693Crossref PubMed Scopus (706) Google Scholar). Smurf1 has two WW domains that facilitate protein-protein interactions by binding to the PPXY sequence (PY motif) on partner proteins. Of eight different Smads, not only R-Smads including Smad1 and Smad5 but also I-Smads have a PY motif in their linker regions (Fig. 1A). We therefore examined whether Smurf1 binds to I-Smads. We first analyzed the interaction of Smurf1 with different Smads in transfected COS7 cells. A Smurf1 mutant, Smurf1(C710A), which has a mutation in the HECT domain and fails to recruit ligase activity, was used for this study. Of Smads 1 through 8, Smad6 and Smad7 strongly interacted with Smurf1(C710A) (Fig. 1B). Smurf1(C710A) interacted with Smad1 and Smad5 less efficiently than with Smad6 and Smad7. In contrast, it bound to Smad3 only weakly and failed to bind to Smads 2 and 4. Because Smad8 lacks the PY motif, Smurf1(C710A) did not bind to Smad8 either (Fig. 1B). The mode of interaction between Smad7 and Smurf1 was further studied. In COS7 cells, weak interaction of wild-type Smad7 (Smad7(WT)) with wild-type Smurf1 (Smurf1(WT)) was detected, and it was slightly facilitated in the presence of the constitutively active TGF-β type I receptor, TβR-I(TD) (Fig. 1C). Moreover, the interaction between Smurf1(WT) and Smad7 was enhanced by the proteasome inhibitor lactacystin. In contrast, a Smad7 deletion mutant that lacks the PY motif (amino acids 207–211) in the linker region (Smad7ΔPY) did not bind to Smurf1. Smad7 interacts with TβR-I activated by TβR-II, thereby competing with Smad2 and Smad3 for inhibition of TGF-β signaling. We therefore examined in an affinity cross-linking assay whether Smad7 acts as an adapter molecule that links TβR-I to the ubiquitin-proteasome pathway. Although Smurf1 alone did not efficiently bind to TβR-I in transfected COS7 cells, Smad7 dramatically enhanced the interaction between Smurf1 and the TβR-I·TβR-II complex (Fig. 1D, lanes 4 and5). Moreover, Smurf1 failed to interact with the receptor complex in the presence of Smad7ΔPY (Fig. 1D, lane 6). These results indicate that Smurf1 is recruited to TβR-I through Smad7. We next examined the effect of Smurf1 on the subcellular localization of Smad7. In the absence of Smurf1, both Smad7(WT) and Smad7ΔPY were predominantly located in the nucleus, although weak staining in the cytoplasm was also detected (Fig.2A). When transfected alone, Smurf1 was detected in the cytoplasm (data not shown). In the presence of Smurf1, Smad7(WT) was mainly observed in the cytoplasm. The cytoplasmic staining of Smad7 was further enhanced by the presence of proteasomal inhibitor MG132 or lactacystin (Fig. 2B). Smad7ΔPY failed to accumulate in the cytoplasm even in the presence of Smurf1, although there is a little leakage of Smad7ΔPY out of the nucleus (Fig. 2A); these results strongly suggest that interaction of Smurf1 with Smad7 is required for the cytoplasmic localization of Smad7. Consistent with this, Smurf1 and Smad7 colocalized in the cytoplasm (Fig. 2B). Interestingly, similar findings were obtained using Smurf1(C710A), suggesting that recruitment of ligase activity is not required for cytoplasmic translocation of the Smad7·Smurf1 complex (Fig. 2B). An E3 ubiquitin ligase, MDM2, has been reported to promote ubiquitin-dependent degradation and nuclear export of p53 (16Boyd S.D. Tsai K.Y. Jacks T. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 563-568Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar, 17Geyer R.K., Yu, Z.K. Maki C.G. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 569-573Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar). In this case, a mutation within the MDM2 RING-finger domain that cannot induce p53 ubiquitination also lacks the ability to promote the p53 nuclear export. Thus, both Smurf1 and MDM2 promote not only ubiquitin-dependent degradation but also nuclear export of the substrates, although the mechanisms of nuclear export appear to differ between them. Itoh et al. (18Itoh S. Landstrom M. Hermansson A. Itoh F. Heldin C.-H. Heldin N.-E. ten Dijke P. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29195-29201Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (218) Google Scholar) reported that Smad7 is predominantly located in the nucleus and that it is exported to the cytoplasm after ligand stimulation. It is possible that Smurf1 functions as a carrier protein for Smad7 for nuclear export, although it is currently not known whether ligand stimulation triggers the nuclear export of Smad7 by Smurf1. To determine whether Smurf1 acts as an E3 ubiquitin ligase for Smad7, ubiquitination of Smad7 by Smurf1 was investigated in vivo.Smad7 was transfected into COS7 cells, together with Smurf1 and HA-tagged ubiquitin. Smurf1 efficiently induced the ubiquitination of Smad7 (Fig. 3A). Notably, Smad7 ubiquitination occurred more efficiently than that of Smad1 or Smad4. Polyubiquitination of Smad7 was not observed when Smad7ΔPY or Smurf1(C710A) was used (Fig. 3B). We also tested the effect of Smad7 on TβR-I ubiquitination by Smurf1 in 293T cells. Although Smurf1 alone ubiquitinated TβR-I weakly, Smad7 enhanced the receptor ubiquitination by Smurf1 (Fig. 3C). To investigate whether Smurf1 regulates degradation of Smad7 and TβR-I, we analyzed turnover of these proteins by pulse-chase experiments. Smurf1(WT), but not Smurf1(C710A), enhanced the degradation of Smad7 (Fig. 4, A and B), suggesting that Smurf1-induced Smad7 degradation is dependent on the HECT catalytic activity and through the proteasome. Smurf1(WT), but not Smurf1(C710A), was also rapidly degraded (Fig. 4B). Moreover, Smad7 and Smurf1 induced the degradation of TβR-I (Fig.4C). Our results thus demonstrate that Smad7 accelerates turnover of the TβR-I protein by recruitment of an E3 ubiquitin ligase, Smurf1. To examine the effect of Smurf1 on the inhibitory activity of Smad7, we first compared the effect of Smad7ΔPY with that of Smad7(WT) using a TGF-β-responsible promoter-reporter construct, p3TP-lux (Fig.4D). Smad7ΔPY suppressed activation of the reporter gene in a dose-dependent manner, but its inhibitory effect was less potent than that of Smad7(WT), suggesting that the interaction of Smad7 with Smurf-like molecules is important for efficient inhibition of TGF-β signaling by Smad7. Next, we tested the effect of Smurf1 on the inhibitory activity of Smad7 using p3TP-lux (Fig. 4E). Smurf1(WT), but not Smurf1(C710A), enhanced the inhibitory activity of Smad7. These data indicate that E3 ligase activity of Smurf1 is crucial for its effect on the inhibitory activity of Smad7. I-Smads have been shown to regulate TGF-β superfamily signaling through multiple mechanisms, e.g. competition with R-Smads for type I receptor interaction, inhibition of complex formation between R-Smads and Co-Smads, and transcriptional repression by interaction with transcription factors, such as Hoxc-8 (6Imamura T. Takase M. Nishihara A. Oeda E. Hanai J. Kawabata M. Miyazono K. Nature. 1997; 389: 622-626Crossref PubMed Scopus (883) Google Scholar, 7Hayashi H. Abdollah S. Qiu Y. Cai J. Xu Y.Y. Grinnell B.W. Richardson M.A. Topper J.N. Gimbrone Jr., M.A. Wrana J.L. Falb D. Cell. 1997; 89: 1165-1173Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1181) Google Scholar, 8Nakao A. Afrakhte M. Moren A. Nakayama T. Christian J.L. Heuchel R. Itoh S. Kawabata M. Heldin N.-E. Heldin C.-H. ten Dijke P. Nature. 1997; 389: 631-635Crossref PubMed Scopus (1591) Google Scholar, 9Hata A. Lagna G. Massagué J. Hemmati-Brivanlou A. Genes Dev. 1998; 12: 186-197Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar, 10Bai S. Shi X. Yang X. Cao X. J. Biol. Chem. 2000; 275: 8267-8270Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (125) Google Scholar). Our present findings revealed a novel mechanism for the inhibitory activity of Smad7. Although degradation of receptor complexes by Smurf1 may not be absolutely required for the action of I-Smads, it may play an important role in the negative regulation of TGF-β superfamily signaling by I-Smads. The present findings also suggest that E3 ligases of the Smurf family regulate TGF-β superfamily signaling through dual mechanisms. (i) By interaction with and degradation of R-Smads, Smurf1 negatively regulates BMP signaling. (ii) Smurf1 also interacts with Smad7 and inhibits TGF-β signaling by receptor degradation. Recently, another Smurf, Smurf2, has been suggested to exhibit similar dual specificities. Lin et al.(19Lin X. Liang M. Feng X.-H. J. Biol. Chem. 2000; 275: 36818-36822Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (416) Google Scholar) reported that Smurf2 interacts with Smad2, as well as other R-Smads, and induces the degradation of Smad2. Moreover, Kavsaket al. (20Kavsak P. Rasmussen R.K. Causing C.G. Bonni S. Zhu H. Thomsen G.H. Wrana J.L. Mol. Cell. 2000; 6: 1365-1375Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1132) Google Scholar) reported that Smurf2 binds to TGF-β receptor complex via Smad7 and causes degradation of receptors and Smad7. It will be important to determine in the future whether there are some functional differences between Smurf1 and Smurf2in vivo, especially in the interaction with I-Smads or receptors. We thank G. H. Thomsen for Smurf1 cDNA.

The activin receptor-like kinase 1 (ALK1) is a type I receptor for transforming growth factor-β (TGF-β) family proteins. Expression of ALK1 in blood vessels and mutations of the ALK1 gene in human type II hereditary hemorrhagic telangiectasia patients suggest that ALK1 may have an important role during vascular development. To define the function of ALK1 during development, we inactivated the ALK1 gene in mice by gene targeting. The ALK1 homozygous embryos die at midgestation, exhibiting severe vascular abnormalities characterized by excessive fusion of capillary plexes into cavernous vessels and hyperdilation of large vessels. These vascular defects are associated with enhanced expression of angiogenic factors and proteases and are characterized by deficient differentiation and recruitment of vascular smooth muscle cells. The blood vessel defects in ALK1-deficient mice are reminiscent of mice lacking TGF-β1, TGF-β type II receptor (TβR-II), or endoglin, suggesting that ALK1 may mediate TGF-β1 signal in endothelial cells. Consistent with this hypothesis, we demonstrate that ALK1 in endothelial cells binds to TGF-β1 and TβR-II. Furthermore, the ALK1 signaling pathway can inhibit TGF-β1-dependent transcriptional activation mediated by the known TGF-β1 type I receptor, ALK5. Taken together, our results suggest that the balance between the ALK1 and ALK5 signaling pathways in endothelial cells plays a crucial role in determining vascular endothelial properties during angiogenesis.

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are members of the transforming growth factor beta superfamily. Several members of this family have been shown to transduce their signals through binding to type I and type II serine-(threonine) kinase receptors. Here we report the cDNA cloning and characterization of a human type II receptor for BMPs (BMPR-II), which is distantly related to DAF-4, a BMP type II receptor from Caenorhabditis elegans. In transfected COS-1 cells, osteogenic protein (OP)-1/BMP-7, and less efficiently BMP-4, bound to BMPR-II. BMPR-II bound ligands only weakly alone, but the binding was facilitated by the presence of previously identified type I receptors for BMPs. Binding of OP-1/BMP-7 to BMPR-II was also observed in nontransfected cell lines. Moreover, a transcriptional activation signal was transduced by BMPR-II in the presence of type I receptors after stimulation by OP-1/BMP-7.

Smads are signal transducers for members of the transforming growth factor-beta (TGF-beta) superfamily. Upon ligand stimulation, receptor-regulated Smads (R-Smads) are phosphorylated by serine/threonine kinase receptors, form complexes with common-partner Smad, and translocate into the nucleus, where they regulate the transcription of target genes together with other transcription factors. Polyomavirus enhancer binding protein 2/core binding factor (PEBP2/CBF) is a transcription factor complex composed of alpha and beta subunits. The alpha subunits of PEBP2/CBF, which contain the highly conserved Runt domain, play essential roles in hematopoiesis and osteogenesis. Here we show that three mammalian alpha subunits of PEBP2/CBF form complexes with R-Smads that act in TGF-beta/activin pathways as well as those acting in bone morphogenetic protein (BMP) pathways. Among them, PEBP2alphaC/CBFA3/AML2 forms a complex with Smad3 and stimulates transcription of the germline Ig Calpha promoter in a cooperative manner, for which binding of both factors to their specific binding sites is essential. PEBP2 may thus be a nuclear target of TGF-beta/BMP signaling.

The biological effects of type I serine/threonine kinase receptors and Smad proteins were examined using an adenovirus-based vector system. Constitutively active forms of bone morphogenetic protein (BMP) type I receptors (BMPR-IA and BMPR-IB; BMPR-I group) and those of activin receptor–like kinase (ALK)-1 and ALK-2 (ALK-1 group) induced alkaline phosphatase activity in C2C12 cells. Receptor-regulated Smads (R-Smads) that act in the BMP pathways, such as Smad1 and Smad5, also induced the alkaline phosphatase activity in C2C12 cells. BMP-6 dramatically enhanced alkaline phosphatase activity induced by Smad1 or Smad5, probably because of the nuclear translocation of R-Smads triggered by the ligand. Inhibitory Smads, i.e., Smad6 and Smad7, repressed the alkaline phosphatase activity induced by BMP-6 or the type I receptors. Chondrogenic differentiation of ATDC5 cells was induced by the receptors of the BMPR-I group but not by those of the ALK-1 group. However, kinase-inactive forms of the receptors of the ALK-1 and BMPR-I groups blocked chondrogenic differentiation. Although R-Smads failed to induce cartilage nodule formation, inhibitory Smads blocked it. Osteoblast differentiation induced by BMPs is thus mediated mainly via the Smad-signaling pathway, whereas chondrogenic differentiation may be transmitted by Smad-dependent and independent pathways.