Abstract Pantoea ananatis is a member of a Pantoea spp. complex that causes center rot of onion, which significantly affects onion yield and quality. This pathogen does not have typical virulence factors like type II or type III secretion systems but appears to require a biosynthetic gene-cluster, HiVir/PASVIL (located chromosomally), for a phosphonate secondary metabolite, and the onion-virulence regions, OVR (localized on a megaplasmid), for onion pathogenicity and virulence, respectively. We conducted a deep pan-genome-wide association study (pan-GWAS) to predict additional genes associated with pathogenicity in P. ananatis using a panel of diverse strains ( n = 81). We utilized a red-onion scale necrosis assay as an indicator of pathogenicity. Based on this assay, we differentiated pathogenic ( n = 51)- vs. non-pathogenic ( n = 30)-strains phenotypically. Pan-GWAS revealed a large core genome of 3,153 genes and a flexible accessory genome of ≤5,065 genes. Phylogenomic analysis using pan-GWAS and presence and absence variants (PAVs) distinguished red-scale necrosis inducing (pathogenic) strains from non-scale necrosis inducing (non-pathogenic) strains of P. ananatis . The pan-GWAS also predicted 42 genes, including 14 from the previously identified HiVir/PASVIL cluster associated with pathogenicity, and 28 novel genes that were not previously associated with pathogenicity in onion. Of the 28 novel genes identified, eight have annotated functions of site-specific tyrosine kinase, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, TraR/DksA family transcriptional regulator, and HTH-type transcriptional regulator. The remaining 20 genes are currently hypothetical. This is the first report of using pan-GWAS on P. ananatis for the prediction of novel genes contributing to pathogenicity in onion, which will be utilized for further functional analyses. Pan-genomic differences (using PAVs) differentiated onion pathogenic from non-pathogenic strains of P. ananatis , which has been difficult to achieve using single or multiple gene-based phylogenetic analyses. The pan-genome analysis also allowed us to evaluate the presence and absence of HiVir/PASVIL genes and 11 megaplasmid-borne OVR-A genes regarded as the ‘ alt ’ cluster that aid in P. ananatis colonization in onion bulbs. We concluded that HiVir/PASVIL genes are associated with pathogenic P. ananatis strains and the alt gene cluster alone is not responsible for pathogenicity on onion. The pan-genome also provides clear evidence of constantly evolving accessory genes in P. ananatis that may contribute to host-range expansion and niche-adaptation. Author summary Pantoea ananatis is a major bacterial pathogen that causes center rot of onion and diseases of a number of other plant species. In order to understand the genome architecture and identify genes responsible for pathogenicity in onion, a pan-genome analysis was performed. We used 81 strains of P. ananatis collected over 20 years from different regions of the state of Georgia, USA. The pan-genome study identified a core genome with a conserved set of genes and an accessory genome that displayed variation among strains. We conducted pan-GWAS (pan-genome-wide association study) using presence and absence variants (PAVs) in the genomes and associated onion-pathogenic phenotypes based on a red-onion scale necrosis assay. The study resulted in identification of genes, including a cluster of chromosomal HiVir/PASVIL genes, that are significantly associated with the onion pathogenic phenotype. In addition, we identified 28 novel genes, a majority of which ( n = 20) have hypothetical functions. We concluded and further substantiated earlier findings that a cluster of genes is responsible for pathogenicity on onion. The pan-genome analysis also allowed us to evaluate the presence and absence of HiVir/PASVIL genes and 11 megaplasmid-borne OVR-A genes regarded as the ‘ alt ’ cluster that aid in bacterial colonization of onion bulbs by P. ananatis strains. We concluded that HiVir/PASVIL genes are associated with onion-pathogenic strains, and the alt gene cluster alone is not responsible for pathogenicity on onion. This study also provides potential evidence of constantly evolving accessory genes in P. ananatis which may help in host range expansion and adaptation to diverse niches.

Phytophthora capsici (PCap), which causes Phytophthora root rot, is the most destructive soilborne pathogen for bell pepper ( Capsicum annuum L.) production in Georgia, USA. Extensive host range, persistence of inoculum in the soil, and lack of effective chemical control methods make this disease particularly difficult to manage. Resistant cultivars offer a practical solution to manage PCap in affected bell pepper fields. However, most commercial cultivars resistant to PCap are predominantly grown in the northeastern United States. This research aimed to screen commercial bell pepper cultivars for resistance to PCap, marketable yield, fruit size distribution, and overall adaptability for production within the largest growing areas in southern Georgia. Field trials were conducted during Spring 2022 and 2023 in commercial growers’ fields with a known history of PCap infestation to evaluate PCap-resistant bell pepper cultivars across four trials conducted in the three counties (Colquitt, Echols, and Lowndes) responsible for ∼78% of bell pepper production in Georgia. Eleven cultivars were evaluated: nine that claimed PCap resistance and two widely grown PCap susceptible cultivars included for comparison. Phytophthora root rot incidence was very low in these research trials. However, there were significant differences in total yields, marketable yields, fruit size, and unmarketable yields. On the basis of marketable yields for jumbo, extra large, and large-sized fruit, we recommend the PCap-resistant cultivars PS 0994-1819, Paladin, and Mercer for fresh market bell pepper growers. Furthermore, ‘Revolution’ is recommended for processor growers due to higher jumbo-sized fruit yields and lower quality and higher pancaking for the spring season in southern Georgia, USA. Newer cultivars Tarpon and Nitro have a more desirable disease-resistance package; however, ‘Nitro’ had small-sized fruit, and ‘Tarpon’ tended to have lower total yields than current commercial standards.

Pantoea agglomerans is one of four Pantoea species for which strains have been reported in the United States to cause bacterial rot of onion bulbs. However, not all P. agglomerans strains are pathogenic to onion. We characterized onion-associated strains of P. agglomerans to elucidate the genetic and genomic signatures of onion-pathogenic P. agglomerans. We collected >300 P. agglomerans strains associated with symptomatic onion plants and bulbs from public culture collections, research laboratories, and a multi-year survey in 11 states in the USA. Genome assemblies were generated for 87 P. agglomerans strains that showed a range in onion virulence phenotypes. Combining the 87 genome assemblies with 100 high-quality, public P. agglomerans genome assemblies identified two well-represented and well-supported P. agglomerans phylogroups. Strains causing severe symptoms on onion leaves and bulbs were only identified in Phylogroup II and encoded the HiVir biosynthetic cluster for the phytotoxin pantaphos, supporting the role of HiVir as a crucial pathogenicity factor. Using a MASH-based plasmid classification system, the P. agglomerans HiVir cluster was determined to be encoded in two distinct plasmid contexts: 1) as an accessory gene cluster on a conserved P. agglomerans plasmid (pAggl), or 2) on a mosaic cluster of plasmids common among onion strains (pOnion). Analysis of closed genomes of P. agglomerans revealed that the pOnion plasmids harbored alt genes responsible for encoding tolerance to the thiosulfinate defensive chemistry in Allium spp. Additionally, many of these pOnion plasmids harbored cop gene clusters, which confer resistance to copper. However, the pOnion plasmids encoded the HiVir cluster less frequently. We demonstrated that the pOnion plasmid pCB1C, encoding HiVir and alt clusters as well as an intact conjugative type IV secretion system (T4SS), can act as a natively mobilizable pathogenicity plasmid that transforms P. agglomerans Phylogroup I strains, including environmental strains, into virulent pathogens of onion. This work indicates a central role for plasmids and plasmid ecology in mediating P. agglomerans interactions with onion plants, with potential implications for onion bacterial disease management.

Burkholderia gladioli pv. alliicola, B.cepacia, and B. orbicola are common bacterial pathogens of onion. Onions produce organosulfur thiosulfinate defensive compounds after cellular decompartmentalization. Using whole genome sequencing and in silico analysis, we identified putative thiosulfinate tolerance gene (TTG) clusters in multiple onion-associated Burkholderia species similar to those characterized in other Allium-associated bacterial endophytes and pathogens. Sequence analysis revealed the presence of three Burkholderia TTG cluster types with both Type A and Type B being broadly distributed in B. gladioli, B. cepacia, and B. orbicola in both the chromosome and plasmids. Based on isolate natural variation and generation of isogenic strains, we determined the in vitro and in vivo contribution of TTG clusters in B. gladioli, B. cepacia, and B. orbicola. The Burkholderia TTG clusters contributed to enhanced allicin tolerance and improved growth in filtered onion extract by all three species. TTG clusters also made clear contributions to B gladioli foliar necrosis symptoms and bacterial populations. Surprisingly, the TTG cluster did not contribute to bacterial populations in onion bulb scales by these three species. Based on our findings, we hypothesize onion-associated Burkholderia may evade or inhibit the production of thiosulfinates in onion bulb tissues.

Abstract Onion center rot is caused by at least four species of Pantoea ( P. ananatis, P. agglomerans, P. allii, and P. stewartii subsp. indologenes ). Critical onion pathogenicity determinants for P. ananatis were recently described but whether those determinants are common among other onion-pathogenic Pantoea species remains unknown. In this work, we report onion pathogenicity determinants in P. stewartii subsp. indologenes and P. allii . We identified two distinct secondary metabolite biosynthetic gene clusters in different strains of onion pathogenic P. stewartii subsp. indologenes . One cluster is similar to the previously described HiVir phosphonate biosynthetic cluster of P. ananatis and another is a novel putative phosphonate biosynthetic gene cluster, which we name “Halophos”. The Halophos gene cluster was also identified in P. allii strains. Both clusters are predicted to be phosphonate biosynthetic clusters based on the presence of a characteristic phosphenolpyruvate phosphomutase ( pepM ) gene. The deletion of pepM gene from either the P. stewartii subsp. indologenes HiVir or Halophos clusters caused loss of necrosis on onion leaves and red onion scales, and resulted in significantly lower bacterial populations compared to the corresponding wildtype and complemented strains. Seven ( halB - halH ) out of eleven genes ( halA - halK ) in the Halophos gene cluster are required for onion necrosis phenotypes. The onion non-pathogenic strain PNA15-2 gained the capacity to cause foliar necrosis on onion via exogenous expression of a minimal seven gene Halophos cluster ( halB -halH) . Furthermore, cell-free culture filtrates of PNA14-12 expressing the intact Halophos-gene cluster caused necrosis on onion leaves consistent with the presence of a secreted toxin. Together, these observations indicated that pepM genes in both phosphonate biosynthetic gene clusters (HiVir and Halophos) are important for Pantoea spp. onion pathogenicity and the biosynthetic product of the Halophos cluster causes necrosis on onion leaf tissue. Overall, this is the first report of onion pathogenicity determinants in P. stewartii subsp. indologenes and P. allii . Author summary Onion center rot is caused by multiple Pantoea species including P. stewartii subsp. indologenes and P. allii . We identified two distinct secondary metabolite biosynthetic clusters associated with onion pathogenic strains, the validated HiVir phosphonate cluster and a putative phosphonate biosynthetic cluster that we named as Halophos based on the associated “halo” phenotype on the red onion scales. We found that pepM genes from each cluster (HiVir and Halophos) are required for onion infection by P. stewartii subsp. indologenes and P. allii but not for millet infection by P. stewartii subsp. indologenes . Conversely, the T3SS was important for millet infection by P. stewartii subsp. indologenes but not onion infection. Induction of the intact Halophos cluster was associated with the accumulation of a necrosis-inducing factor in culture, which suggests it might be a secreted phytotoxin. Seven of the eleven Halophos cluster genes are required for onion necrosis phenotypes and expression of this minimal cluster conferred a limited onion necrosis phenotype to an onion-non-pathogenic Pantoea strain. We provide evidence of a Halophos biosynthetic gene cluster to be associated with onion pathogenicity in strains of P. stewartii subsp. indologenes and P. allii .

Abstract Pantoea ananatis is an unusual bacterial pathogen that lacks typical virulence determinants yet causes extensive necrosis in onion foliage and bulb tissues. The onion necrosis phenotype is dependent on the expression of a phosphonate toxin, pantaphos that is catalyzed by putative enzymes encoded by the HiVir gene cluster. The genetic contributions of individual hvr genes in HiVir-mediated onion necrosis remain largely unknown except for the first gene hvrA (phosphoenolpyruvate mutase, pepM ) whose deletion resulted in the loss of onion pathogenicity. In this study, using gene deletion mutation and complementation, we report that of the ten remaining genes, hvrB - hvrF are also strictly required for the HiVir-mediated onion necrosis and in planta bacterial growth whereas hvrG - hvrJ partially contributed to these phenotypes. As the HiVir gene cluster is a common genetic feature shared among the onion-pathogenic P. ananatis strains, and as it could serve as a useful diagnostic marker of onion pathogenicity, we sought to understand the genetic basis of HiVir positive yet phenotypically deviant (non-pathogenic) strains. We identified and genetically characterized inactivating single nucleotide polymorphisms (SNPs) in essential hvr genes of six phenotypically deviant P. ananatis strains. Finally, inoculation of the cell-free spent medium of P tac -driven HiVir strain caused P. ananatis -characteristic red onion scale necrosis (RSN) as well as cell death symptoms in tobacco. The co-inoculation of the spent medium with essential hvr mutant strains restored strains’ in planta populations to the wild-type level, suggesting that necrosis is important for proliferation of P. ananatis in onion tissue.

Abstract Pantoea ananatis is a gram-negative bacterium and the primary causal agent of center rot of onions in Georgia. Previous genomic studies identified two virulence gene clusters, HiVir and alt , associated with center rot. The HiVir gene cluster is required to induce necrosis on onion tissues via synthesis of a predicted small molecule toxin. The alt gene cluster aids in tolerance to thiosulfinates generated during onion tissue damage. Whole genome sequencing of other Pantoea species suggest that these gene clusters are present outside of P. ananatis . To assess the distribution of these gene clusters, two PCR primer sets were designed to detect the presence of HiVir and alt . Two hundred fifty-two strains of Pantoea spp. were phenotyped using the red onion scale necrosis (RSN) assay and were assayed using PCR for the presence of these virulence genes. A diverse panel of strains from three distinct culture collections comprised of 24 Pantoea species, 41 isolation sources, and 23 countries, collected from 1946-2019, were tested. There is a significant association between the alt PCR assay and Pantoea strains recovered from symptomatic onion ( P <0.001). There is also a significant association of a positive HiVir PCR and RSN assay among P. ananatis strains but not among Pantoea spp., congeners. This may indicate a divergent HiVir cluster or different pathogenicity and virulence mechanisms. Last, we describe natural alt positive [RSN + /HiVir + / alt + ] P. ananatis strains, which cause extensive bulb necrosis in a neck-to-bulb infection assay compared to alt negative [RSN + /HiVir + / alt - ] P. ananatis strains. A combination of assays that include PCR of virulence genes [HiVir and alt ] and an RSN assay can potentially aid in identification of onion-bulb-rotting pathogenic P. ananatis strains.

Center rot of onion caused by Pantoea species can lead to substantial yield losses in the field and during storage. Growers rely on copper-based products or their combination with ethylenebisdithiocarbamate fungicides to manage center rot. Biocontrol agents (BCAs) are occasionally used alone or in combination with copper. The optimum intervals for alternate application of copper and BCAs have not been established and the efficacy of tank-mixing copper with BCAs over their solo applications remains largely understudied. We evaluated the ability of Bacillus subtilis QST 713 (Serenade ASO) or Bacillus mycoides isolate J (LifeGard WG) applied alternately or as tank mixes with copper (Nordox 75 WG) to manage center rot in onion leaves and bulbs. Alternating the application of BCAs with copper at longer intervals (10- or 15-d) could achieve a similar level of center rot control as their alternate treatment at shorter intervals (5-d). Under low disease pressure, two to three applications could be eliminated from the spray program without compromising disease suppression. We also found that B. subtilis QST 713 and B. mycoides isolate J strains from respective products were copper-sensitive at concentrations >250 ppm. Our concurrent study on the tank mix of BCAs with copper showed that standalone copper treatment had a similar level of disease control as their tank mix application. Frequent applications of copper may control disease relatively better than treatments lacking copper products but the integration of BCA with copper in spray programs may largely depend upon their compatibility and modes of action of the BCA products.

Onion ( Allium. cepa L ), garlic ( A. sativum L.), and other members of the Allium genus produce volatile antimicrobial thiosulfinates upon cellular damage. Allicin has been known since the 1950s as the primary antimicrobial thiosulfinate compound and odorant produced by garlic. However, the roles of endogenous thiosulfinate production in host-bacterial pathogen interactions have not been described. The bacterial onion pathogen Pantoea ananatis , which lacks both the virulence Type III and Type II Secretion Systems, induces necrotic symptoms and extensive cell death in onion tissues dependent on a proposed secondary metabolite synthesis chromosomal gene cluster. We found strong correlation between the genetic requirements for P. ananatis to colonize necrotized onion tissue and its capacity for tolerance to the thiosulfinate allicin based on the presence of an eleven gene, plasmid-borne, virulence cluster of sulfur/redox genes. We have designated them " alt " genes for allicin tolerance. We show that allicin and onion thiosulfinates restrict bacterial growth with similar kinetics. The alt gene cluster is sufficient to confer allicin tolerance and protects the glutathione pool during allicin treatment. Independent alt genes make partial phenotypic contributions indicating that they function as a collective cohort to manage thiol stress. Our work implicates endogenous onion thiosulfinates produced during cellular damage as mediators of interactions with bacteria. The P. ananatis -onion pathosystem can be modeled as a chemical arms race of pathogen attack, host chemical counter-attack, and pathogen resistance.

Slippery skin of onion caused by Burkholderia gladioli pv. alliicola (Bga) is a common bacterial disease reported from onion growing regions around the world. Despite the increasing attention in recent years, our understanding of the virulence mechanisms of this pathogen remains limited. In this study, we characterized the predicted genetic determinants of virulence in Bga strain 20GA0385 using reverse genetics approach. Using the closely related rice pathogen, B. glumae as a reference, comparative genomics analysis was performed to identify Bga candidate virulence factors and regulators. Marked and unmarked deletion mutants were generated using allelic exchange and the mutants were functionally validated using in vitro and in vivo assays. The role of mutants in pathogenic phenotypes was analyzed using onion foliar/seedling necrosis assays, the Red Scale Necrosis (RSN) assay and in planta bacterial population counts. The phytotoxin toxoflavin was a major contributor to foliar necrosis and bacterial populations whereas the type II and type III secretion system (T2SS/T3SS) were dispensable for foliar symptoms. In onion scale tissue, the T2SS single mutant gspC and its double and triple mutant derivatives all contributed to scale lesion area. Neither the lipocyclopeptide icosalide, toxoflavin, nor T3SS were required for scale symptoms. Our results suggest the quorum sensing tofIMR system in Bga regulates, toxoflavin, T2SS, and T3SS, contributing to onion symptom production. We show different virulence factors contribute to onion tissue-specific virulence patterns in Bga and that decreases in scale symptoms often do not result in decreased Bga populations in onion tissue.