Miscommunications are a leading cause of serious medical errors. Data from multicenter studies assessing programs designed to improve handoff of information about patient care are lacking.

Serious medication errors are common in hospitals and often occur during order transcription or administration of medication. To help prevent such errors, technology has been developed to verify medications by incorporating bar-code verification technology within an electronic medication-administration system (bar-code eMAR).

Sphingosine-1-phosphate (S1P), a lipid signaling molecule that regulates many cellular functions, is synthesized from sphingosine and ATP by the action of sphingosine kinase. Two such kinases have been identified, SPHK1 and SPHK2. To begin to investigate the physiological functions of sphingosine kinase and S1P signaling, we generated mice deficient in SPHK1. Sphk1 null mice were viable, fertile, and without any obvious abnormalities. Total SPHK activity in most Sphk1-/-tissues was substantially, but not completely, reduced indicating the presence of multiple sphingosine kinases. S1P levels in most tissues from the Sphk1-/- mice were not markedly decreased. In serum, however, there was a significant decrease in the S1P level. Although S1P signaling regulates lymphocyte trafficking, lymphocyte distribution was unaffected in lymphoid organs of Sphk1-/- mice. The immunosuppressant FTY720 was phosphorylated and elicited lymphopenia in the Sphk1 null mice showing that SPHK1 is not required for the functional activation of this sphingosine analogue prodrug. The results with these Sphk1 null mice reveal that some key physiologic processes that require S1P receptor signaling, such as vascular development and proper lymphocyte distribution, can occur in the absence of SPHK1. Sphingosine-1-phosphate (S1P), a lipid signaling molecule that regulates many cellular functions, is synthesized from sphingosine and ATP by the action of sphingosine kinase. Two such kinases have been identified, SPHK1 and SPHK2. To begin to investigate the physiological functions of sphingosine kinase and S1P signaling, we generated mice deficient in SPHK1. Sphk1 null mice were viable, fertile, and without any obvious abnormalities. Total SPHK activity in most Sphk1-/-tissues was substantially, but not completely, reduced indicating the presence of multiple sphingosine kinases. S1P levels in most tissues from the Sphk1-/- mice were not markedly decreased. In serum, however, there was a significant decrease in the S1P level. Although S1P signaling regulates lymphocyte trafficking, lymphocyte distribution was unaffected in lymphoid organs of Sphk1-/- mice. The immunosuppressant FTY720 was phosphorylated and elicited lymphopenia in the Sphk1 null mice showing that SPHK1 is not required for the functional activation of this sphingosine analogue prodrug. The results with these Sphk1 null mice reveal that some key physiologic processes that require S1P receptor signaling, such as vascular development and proper lymphocyte distribution, can occur in the absence of SPHK1. Sphingosine-1-phosphate (S1P) 1The abbreviations used are: S1P, sphingosine-1-phosphate; SPHK, sphingosine kinase; Sphk, mouse gene encoding sphingosine kinase; Sgpp1, mouse gene encoding sphingosine-1-phosphate phosphatase; Sgpl1, mouse gene encoding sphingosine-1-phosphate lyase; Asah1, mouse gene encoding acid ceramidase; Asah2, mouse gene encoding neutral/alkaline ceramidase; -P, phosphorylated; WT, wild-type. is a signaling molecule that influences cellular functions including proliferation, survival, migration, adhesion molecule expression, and morphogenesis (1Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1791) Google Scholar, 2Kluk M.J. Hla T. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 72-80Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar, 3Goetzl E.J. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 64: 11-20Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 4Allende M.L. Proia R.L. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 222-227Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar). S1P binds to members of the S1P receptor family (also known as EDG receptors) and, via G proteins, triggers multiple signaling pathways (5Hla T. Maciag T. J. Biol. Chem. 1990; 265: 9308-9313Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 6Lee M.J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (896) Google Scholar). S1P has also been shown to function intracellularly mediating calcium homeostasis, cell growth, and suppression of apoptosis (7Hla T. Lee M.J. Ancellin N. Liu C.H. Thangada S. Thompson B.D. Kluk M. Biochem. Pharmacol. 1999; 58: 201-207Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 8Spiegel S. Milstien S. FEBS Lett. 2000; 476: 55-57Crossref PubMed Scopus (245) Google Scholar). In mammals, vascular development and lymphocyte trafficking are dependent on S1P receptor signaling (9Liu Y. Wada R. Yamashita T. Mi Y. Deng C.X. Hobson J.P. Rosenfeldt H.M. Nava V.E. Chae S.S. Lee M.J. Liu C.H. Hla T. Spiegel S. Proia R.L. J. Clin. Investig. 2000; 106: 951-961Crossref PubMed Scopus (1009) Google Scholar, 10Allende M.L. Yamashita T. Proia R.L. Blood. 2003; 102: 3665-3667Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar, 11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar, 13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar). Sphingosine kinase (SPHK) catalyzes the synthesis of S1P via the phosphorylation of sphingosine. SPHK activity is elevated by several stimuli, including platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor, tumor necrosis factor-α, and phorbol ester, which trigger an increase in cellular S1P levels (14Olivera A. Spiegel S. Prostaglandins. 2001; 64: 123-134Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). Sphk genes have been identified in mammals (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar, 16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar, 17Nava V.E. Lacana E. Poulton S. Liu H. Sugiura M. Kono K. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. FEBS Lett. 2000; 473: 81-84Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 18Melendez A.J. Carlos-Dias E. Gosink M. Allen J.M. Takacs L. Gene (Amst.). 2000; 251: 19-26Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar), insects (19Herr D.R. Fyrst H. Creason M.B. Phan V.H. Saba J.D. Harris G.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 12685-12694Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar), plants (20Nishiura H. Tamura K. Morimoto Y. Imai H. Biochem. Soc. Trans. 2000; 28: 747-748Crossref PubMed Google Scholar), yeast (21Nagiec M.M. Skrzypek M. Nagiec E.E. Lester R.L. Dickson R.C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 19437-19442Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (145) Google Scholar), worm (22Mendel J. Heinecke K. Fyrst H. Saba J.D. J. Biol. Chem. 2003; 278: 22341-22349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (63) Google Scholar), and slime mold (23Morio T. Urushihara H. Saito T. Ugawa Y. Mizuno H. Yoshida M. Yoshino R. Mitra B.N. Pi M. Sato T. Takemoto K. Yasukawa H. Williams J. Maeda M. Takeuchi I. Ochiai H. Tanaka Y. DNA Res. 1998; 5: 335-340Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar, 24Li G. Foote C. Alexander S. Alexander H. Development. 2001; 128: 3473-3483PubMed Google Scholar). Mammals carry two known SphK genes, which in mice are encoded by Sphk1 and Sphk2. The two enzymes contain five highly conserved regions (C1–C5) and an ATP binding site within a conserved lipid kinase catalytic domain (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar, 16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar). SPHK1 has a predominantly cytoplasm localization but can be induced to localize to the inner leaflet of the plasma membrane. Interestingly in endothelial cells SPHK1 is secreted and is capable of producing S1P extracellularly (25Ancellin N. Colmont C. Su J. Li Q. Mittereder N. Chae S.S. Stefansson S. Liau G. Hla T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 6667-6675Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (256) Google Scholar). Sphk1 shows a tissue distribution and developmental expression pattern different from Sphk2, although both enzymes are widely expressed (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar, 26Fukuda Y. Kihara A. Igarashi Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 309: 155-160Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). The importance of S1P receptor signaling in lymphocyte trafficking was first illuminated by the activities of FTY720, a potent immunosuppressive agent. FTY720 is a sphingosine analogue that, when phosphorylated, functions as an agonist for four of the five S1P receptors (S1P1, S1P3, S1P4, and S1P5 but not S1P2) (13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar, 27Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1343) Google Scholar). FTY720-P causes lymphopenia through sequestration of circulating lymphocytes within lymph nodes and Peyer's patches and also blocks the exit of T-cells from thymus (13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar, 27Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1343) Google Scholar, 28Chiba K. Yanagawa Y. Masubuchi Y. Kataoka H. Kawaguchi T. Ohtsuki M. Hoshino Y. J. Immunol. 1998; 160: 5037-5044PubMed Google Scholar, 29Yagi H. Kamba R. Chiba K. Soga H. Yaguchi K. Nakamura M. Itoh T. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1435-1444Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar, 30Rosen H. Alfonso C. Surh C.D. McHeyzer-Williams M.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 10907-10912Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). Deletion of the S1P1 receptor on thymocytes blocks egress of mature T-cells from thymus and, thus, their presence in the periphery (11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). Similarly T-cell trafficking out of lymph nodes has been shown to depend on the presence of the S1P1 receptor on T-cells (12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). In both cases, the S1P1 receptor may function to direct migration toward high levels of S1P found in circulating fluids. Since FTY720 treatment phenocopies the physiology produced by the deletion of S1P1 in lymphocytes, FTY720 may exert its effects through the interaction with the S1P1 receptor on lymphocytes with subsequent receptor inactivation. Indeed it has been shown that FTY720 may induce receptor internalization and subsequent degradation (31Graler M.H. Goetzl E.J. FASEB J. 2004; 18: 551-553Crossref PubMed Scopus (467) Google Scholar). FTY720 can be phosphorylated by both SPHK1 and SPHK2 in vitro (32Sanchez T. Estrada-Hernandez T. Paik J.H. Wu M.T. Venkataraman K. Brinkmann V. Claffey K. Hla T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47281-47290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (356) Google Scholar, 33Paugh S.W. Payne S.G. Barbour S.E. Milstien S. Spiegel S. FEBS Lett. 2003; 554: 189-193Crossref PubMed Scopus (276) Google Scholar, 34Billich A. Bornancin F. Devay P. Mechtcheriakova D. Urtz N. Baumruker T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47408-47415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (403) Google Scholar), although the relevant in vivo kinase has not been identified. We generated mice with a null Sphk1 gene to study the physiological functions of SPHK1 and its role in S1P generation. We also utilized these mice to examine the metabolism and activity of FTY720 in vivo. Our results demonstrate that FTY720 phosphorylation was decreased in the Sphk1 null mice, although sufficient levels of FTY720-P were generated to achieve full lymphopenia. Generation of Sphk1 Null Mice—To generate the Sphk1 null mice, we cloned a genomic DNA fragment containing the Sphk1 gene from a 129/sv strain library. A 3-kb fragment containing exon 1 and exon 2 and a 7-kb fragment XhoI/NotI that included part of exon 6 together with neomycin and thymidine kinase expression cassettes were used to prepare the targeting vector. The targeting vector was introduced into TC1 embryonic stem cells by electroporation, and the resulting clones were screened by Southern blotting. Targeted embryonic stem cells lines were injected into C57BL/6 blastocysts, and the chimeric male mice that were obtained were bred to C57BL/6 females. The agouti offspring were tested for transmission of the disrupted allele by Southern blot analysis. Heterozygous matings were set up to generate homozygous mutant mice. Mice (Sphk1-/- and littermate controls Sphk1+/- and Sphk1+/+ maintained on 129/sv × C57BL6 mixed background) were genotyped by Southern blotting using the probe shown on Fig. 1 and by PCR from tail biopsies. The primer sequences for the PCR were as follows: primer 1, 5′-TGTCACCCATGAACCTGCTGTCCCTGCACA; primer 2, 5′-AGAAGGCACTGGCTCCTCCAGAGGAACAAG; primer neo, 5′-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT (94 °C for 1 min, 65 °C for 1 min, and 72 °C for 1 min). The wild-type allele yielded a DNA fragment of about 300 bp, and the targeted allele yielded a fragment of ∼350 bp. SPHK Determinations—SPHK activity was measured essentially as described previously (35Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (204) Google Scholar). Tissue homogenates (5–20 μg of protein in sphingosine kinase buffer: 50 mm Tris (pH 7.5), 10% glycerol, 1 mm β-mercaptoethanol, 1 mm EDTA, 1 mm sodium orthovanadate, 40 mm β-glycerophosphate, 15 mm NaF, 10 μg/ml leupeptin and aprotinin, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.5 mm 4-deoxypyridoxine) were incubated with 50 μm sphingosine (prepared either in mixed micelles with Triton X-100 or in bovine serum albumin complexes without Triton X-100), 10 μCi of [γ-32P]ATP (1 mm), and 10 mmMgCl2. Labeled lipids were extracted and resolved by TLC as described previously (35Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (204) Google Scholar, 36Zhang H. Desai N.N. Olivera A. Seki T. Brooker G. Spiegel S. J. Cell Biol. 1991; 114: 155-167Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar). Labeled S1P was quantified with a PhosphorImager. For phosphorylation of sphingosine by cultured mouse embryonic fibroblasts, the cells, prepared as described previously (37Kluk M.J. Colmont C. Wu M.T. Hla T. FEBS Lett. 2003; 533: 25-28Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), were washed with phosphate-free Dulbecco's modified Eagle's medium and subsequently incubated with this medium containing 32Pi (40 μCi/ml) for 24 h as described previously (36Zhang H. Desai N.N. Olivera A. Seki T. Brooker G. Spiegel S. J. Cell Biol. 1991; 114: 155-167Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar). The cells were then incubated with 10 μm sphingosine or vehicle (controls) for 1 h, and S1P was extracted from the cells (38Yatomi Y. Ruan F. Ohta J. Welch R.J. Hakomori S. Igarashi Y. Anal. Biochem. 1995; 230: 315-320Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar, 39van Echten-Deckert G. Zschoche A. Bar T. Schmidt R.R. Raths A. Heinemann T. Sandhoff K. J. Biol. Chem. 1997; 272: 15825-15833Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (70) Google Scholar). S1P was resolved by TLC in 1-butanol:methanol: acetic acid:water (80:20:10:20 by volume), visualized by autoradiography, and identified by RF value. Quantitative evaluation was performed using the Fujifilm Bas 1000 imager and TINA 2.09 software (Raytest, Straubenhardt, Germany). Platelet Preparation—Platelets were isolated from whole blood of Sphk1-/- and WT mice as described previously (40Krueger L.A. Barnard M.R. Frelinger A.L. II I Furman M.I. Michelson A.D. Coligan J.E. Kruisbeek A.M. Margulies D.H. Shevach E.M. Strober W. Current Protocols in Cytometry. John Wiley & Sons, Inc., New York2002: 6.10.1-16.10.17Google Scholar). Blood was collected in 110 volume of acid citrate dextrose as anticoagulant and centrifuged for 10 min at 150 × g at room temperature. The resulting platelet-rich plasma was diluted with citrate wash buffer (11 mm glucose, 128 mm NaCl, 4.3 mm NaH2PO4, 7.5 mm Na2HPO4, 4.8 mm sodium citrate, and 2.4 mm citric acid, pH 6.5) and centrifuged for 10 min at 1,200 × g at room temperature. Cells were washed with citrate wash buffer, resuspended in sphingosine kinase buffer, and homogenized. Total cell homogenates were used for the sphingosine kinase assay. mRNA Expression Measurement—For real time PCR, total RNA was purified using TRIzol (Invitrogen). Mouse Sphk1, Sphk2, Sgpp1, Sgpl1, Asah1, and Asah2 mRNAs were quantified using Assays-on-demand (Applied Biosystems, Foster City, CA) with an ABI Prism 7700 sequence detection system (Applied Biosystems). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA was detected as an internal standard. Measurement of S1P Levels—Lipids from tissue homogenates or serum were extracted with 1 ml of chloroform:25 mm HCl, methanol (1:1) plus 100 μl of 3 n NaOH. Organic phases were back-washed with 1 ml of 25 mm HCl, methanol and 1 ml of 1 m NaCl plus 100 μl of 3 n NaOH. Mass levels of S1P in the pooled aqueous phases were determined exactly as described previously (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar). Pathology and Lymphocyte Analysis—A pathologic evaluation of Sphk1-/- mice was performed by the National Institutes of Health Division of Veterinary Resources Pathology Service. This included histologic evaluation of organ systems and analysis of hematology and blood chemistries. Lymphocytes from thymus, spleen, peripheral lymph nodes (lingual, axillary, branchial, and inguinal), mesenteric lymph nodes, and Peyer's patches from 6–10-week-old mice were isolated and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences) using phycoerythrin-labeled anti-CD3ϵ and phycoerythrin-Cy5-labeled anti-B220 (BD Bioscience). Blood (25 μl) was mixed with an equal volume of phosphate-buffered saline containing 5% rat serum, 5 mm EDTA, and the following rat anti-mouse direct conjugated fluorescent antibody stains (BD Biosciences): Ly6G-fluorescein isothiocyanate, CD3-phycoerythrin, CD45-peridinin chlorophyll protein-Cy5.5, and B220-allophycocyanin. After standing for 15 min at room temperature in the dark, 0.5 ml of ACK lysing buffer (BIOSOURCE) was added containing 3.0 × 104/ml non-fluorescent, 10-μm polystyrene beads (Polysciences). Samples were vortexed and analyzed by flow cytometry within 30 min. Singlet beads were enumerated from forward-side scatter plots, and quantitative cell populations were determined by their cell:bead ratio. Total lymphocytes were gated and scored as CD45+Ly6G-. T- and B-cell subsets, CD3+ and B220+, respectively, were determined from within the lymphocytegated population. FTY720 Treatment—Mice (Sphk1-/- and their Sphk1+/+ littermates) were dosed intravenously with FTY720 at 0.3 mg/kg or 3 mg/kg or with an equivalent volume of vehicle, 2% (w/v) hydroxypropyl-β- cyclodextrin. Blood was collected by direct cardiac puncture upon CO2 euthanasia. Groups of six mice were evaluated by liquid chromatography-mass spectrometry for plasma levels of FTY720, FTY720-P, and S1P at 4 h postdose. Flow cytometry analysis was performed on blood samples from subgroups of three. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry—Plasma levels of FTY720, FTY720-P, and S1P were determined by high performance liquid chromatography with detection by electrospray tandem mass spectroscopy (LCQ-DECA, ThermoFinnigan). Solid phase extraction of samples (plasma diluted 1:20 in 0.5% formic acid, 10% tetrahydrofuran, 5% butanol, and internal standard 0.05 μg/ml C17-S1P, Avanti Polar Lipids) was accomplished by column switching. 100 μl was injected onto a clean-up column (hand packed pellicular phenyl (Alltech), 2.0 × 23 mm) equilibrated with 0.5% formic acid. After 2 min of 0.6 ml/min flow, the clean-up column was switched in-line with the analytical column (Luna phenylhexyl, 4.0 × 50 mm (Phenomenex)), and the compounds were eluted with an acetonitrile gradient. Generation of Sphk1 Knock-out Mice—The mouse Sphk1 gene is composed of six exons and five introns (Fig. 1A). To knock out Sphk1 expression in mice, a gene-targeting vector was prepared in which the region containing exons 3, 4, and 5 and the 5′-end of exon 6 was replaced by a neomycin-resistant gene cassette (Fig. 1A). These deleted exons correspond to the putative lipid kinase catalytic domain, which includes the conserved domains C1, C2, C3, and part of C4 and a putative nucleotide binding motif (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar, 41Pitson S.M. Moretti P.A. Zebol J.R. Zareie R. Derian C.K. Darrow A.L. Qi J. D'Andrea R.J. Bagley C.J. Vadas M.A. Wattenberg B.W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49545-49553Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). Sphk1 gene-targeted embryonic stem cells were isolated and used to produce chimeric male mice, which passed on the targeted allele to their offspring. By intercrossing heterozygous mutant mice, viable homozygous Sphk1 mutant mice were obtained in the expected Mendelian ratio indicating an absence of embryonic lethality. The correct targeting of the Sphk1 locus was confirmed by Southern blotting (Fig. 1B). SacI digestion of genomic DNA and hybridization with a probe external to the region contained within the targeting vector yielded a 7-kb band corresponding to the WT allele and the predicted 5.5-kb band corresponding to the targeted allele. The homozygous Sphk1 mutant mice were fertile and lived longer than 1 year. A histologic evaluation of major organs from the Sphk1 mutant mice indicated that no abnormal pathology was present. To determine whether Sphk1 expression was abolished by the targeting procedure, we performed Northern blotting using RNA from kidney, the original tissue source for the purification of SPHK1 enzyme (35Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (204) Google Scholar). An Sphk1 transcript was detected in samples from WT and heterozygote mice but not from homozygous mutant mice (Fig. 1C). To verify this result, we also performed reverse transcription-PCR using kidney RNA. No Sphk1 transcript was detected in the Sphk1-/- sample (Fig. 1D). Quantitative real time PCR was performed to measure Sphk1 and Sphk2 mRNA expression in brain and kidney from the Sphk1-/- mice (Fig. 2A). Sphk1 mRNA was undetectable in the tissues. These results confirmed that the targeting of Sphk1 resulted in a null allele. Sphk2 mRNA levels were not altered in the Sphk1-/- mice relative to WT levels (Fig. 2A). Also we measured mRNA expression of other genes that could be involved in the S1P biosynthetic pathway (1Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1791) Google Scholar). mRNA levels for Sgpp1, Sgpl1, Asah1, and Asah2 were not affected in the Sphk1 null brain and kidney (Fig. 2A). Sphingosine Kinase and S1P Levels in Tissues—We next determined SPHK activity and the levels of S1P in tissues from WT and Sphk1 null mice. Enzyme assays were performed in the presence (Fig. 2B) and absence (Fig. 2C) of Triton X-100 since this detergent has been reported to stimulate SPHK1 activity and to inhibit SPHK2 activity (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar). In both assays, total SPHK activity was substantially decreased relative to WT in most Sphk1 null tissues (Fig. 2, A and B), although the differences were greater when the assay was performed in the presence of Triton X-100. Lymphoid tissue, in particular, showed a large diminution in activity with a >90% reduction of SPHK activity in spleen (Fig. 2, B and C). Interestingly SPHK activity in platelets from Sphk1 null mice was not statistically different from that of WT mice (Fig. 2, B and C). In contrast, S1P levels in most Sphk1 null tissues were similar or slightly decreased when compared with WT (Fig. 2D). An exception was serum, which normally contains relatively high levels of S1P (42Yatomi Y. Igarashi Y. Yang L. Hisano N. Qi R. Asazuma N. Satoh K. Ozaki Y. Kume S. J. Biochem. (Tokyo). 1997; 121: 969-973Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar). Here a substantial reduction of greater than 50% was observed in the Sphk1 null mice compared with WT (Fig. 2D, inset). Mouse embryonic fibroblasts from Sphk1 null mice contained less than 10% of the SPHK activity detected in WT fibroblasts (Fig. 3A). The capacity of the fibroblasts to synthesize S1P was determined after incubation with sphingosine and 32Pi. Although both WT and Sphk1 null fibroblasts phosphorylated sphingosine to form S1P, the amount of product was about 70% lower in cells from Sphk1 null mice (Fig. 3B). FTY720 Is Phosphorylated and Causes Lymphopenia in Sphk1 Null Mice—Signaling through the S1P1 receptor is required for the exit of lymphocytes from thymus and lymph nodes (11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). We analyzed the total number of lymphocytes and percentages of T- and B-cells in thymus and secondary lymph organs to determine whether lymphocyte distribution was affected in Sphk1 null mice. No significant differences were observed in cellularity or in T-cell or B-cell percentages in thymus, spleen, peripheral and mesenteric lymph nodes, Peyer's patches (Table I), or blood (Fig. 4, A and B) from Sphk1 null mice compared with control WT.Table IComparison of absolute lymphocyte numbers and percentages of T- and B-cells between Sphk1 +/+ and Sphk1 -/- mice The total number of cells was determined by counting isolated cells using a Coulter counter. The percentages of T- and B-lymphocytes were calculated by flow cytometry using phycoerythrin-conjugated CD3ϵ and fluorescein isothiocyanate-conjugated B220 antibodies, respectively. Values represent means ± S.D., n = 4 for total cell numbers and thymus and spleen determinations, n = 3 for peripheral lymph node and n = 2 for mesenteric lymph node and Peyer's patch determinations. PLN, peripheral lymph nodes; MLN, mesenteric lymph nodes; PP, Peyer's patches.TissueTotal cells (×106)Percentage of T-lymphocytesPercentage of B-lymphocytesSphk1 +/+Sphk1 -/-Sphk1 +/+Sphk1 -/-Sphk1 +/+Sphk1 -/-%%Thymus21 ± 724 ± 389 ± 788 ± 6Spleen25 ± 627 ± 643 ± 944 ± 343 ± 1144 ± 6PLN6 ± 25 ± 167 ± 1660 ± 831 ± 532 ± 4MLN4 ± 12 ± 163 ± 365 ± 228 ± 325 ± 6PP3 ± 13 ± 1 Open table in a new tab Intravenous administration of FTY720 was equally effective in reducing blood lymphocytes in both Sphk1 null and WT mice even at the lower dose used (Fig. 4, A and B). At 3 mg/kg FYT720, total lymphocyte numbers were reduced an average of 64% (p < 0.05) with T-cells lowered by 85% (p < 0.01) and B-cells lowered by 53% (p < 0.05). When 0.3 mg/kg FTY720 was used, the total lymphocyte numbers decreased about 78% (p < 0.01), the T-cell numbers decreased 92% (p < 0.01), and B-cell numbers decreased 77% (p < 0.01). Phosphorylation of FTY720 is required for altering lymphocyte trafficking (13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar, 27Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1343) Google Scholar), and liquid chromatography-mass spectrometry analysis revealed the presence of phosphorylated FTY720 (FTY720-P) (Fig. 4, C and D) in the two groups at both doses analyzed. FTY720-P levels in Sphk1 null mice treated with 3 mg/kg and 0.3 mg/kg FYT720 were 41% (p < 0.05) and 24% (p < 0.12) lower, respectively, than in WT. In both cases, absolute levels of FTY720-P were sufficient to have achieved full lymphopenia (Fig. 4). Plasma S1P was reduced 65% (p < 0.001) in Sphk1 null mice. At the doses used in this study, FTY720 appeared not to alter circulating plasma S1P levels in WT (Fig. 4, C and D). The lower S1P levels in plasma relative to serum (Fig. 2D, inset) are consistent with S1P release by platelets during blood clotting (42Yatomi Y. Igarashi Y. Yang L. Hisano N. Qi R. Asazuma N. Satoh K. Ozaki Y. Kume S. J. Biochem. (Tokyo). 1997; 121: 969-973Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 43English D. Welch Z. Kovala A.T. Harvey K. Volpert O.V. Brindley D.N. Garcia J.G. FASEB J. 2000; 14: 2255-2265Crossref PubMed Scopus (266) Google Scholar). This is the first report of a knock-out for a sphingosine kinase gene in mammals. Mice null for the Sphk1 gene are viable and are, thus, distinct from S1P1 receptor null mice, which die in utero due to a block in vascular system development (9Liu Y. Wada R. Yamashita T. Mi Y. Deng C.X. Hobson J.P. Rosenfeldt H.M. Nava V.E. Chae S.S. Lee M.J. Liu C.H. Hla T. Spiegel S. Proia R.L. J. Clin. Investig. 2000; 106: 951-961Crossref PubMed Scopus (1009) Google Scholar). The strikingly different phenotype between these two knock-out mice indicates that S1P signaling was not abolished in Sphk1 null mice. Indeed, with the deletion of the Sphk1 gene, SPHK catalytic activity was substantially but not completely reduced in most tissues. The remaining SPHK activity in Sphk1 null tissues was likely to be contributed, at least in part, by SPHK2, which has been found to be widely distributed among mouse tissues (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar, 26Fukuda Y. Kihara A. Igarashi Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 309: 155-160Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). Additional SPHKs are possible, but others have not been identified. Although our results indicate that the Sphk1 gene contributes the major SPHK activity in most of the tissues analyzed, levels of the product, S1P, were not substantially reduced in the corresponding Sphk1 null tissues. This may reflect compensatory mechanisms to maintain critical cellular S1P levels and likely explains the lack of a severe phenotype. In addition to SPHK2 and possibly other kinases, autotaxin (lysophospho-lipase D) may also be a source of extracellular S1P generation via hydrolysis of sphingosylphosphorylcholine (44Umezu-Goto M. Kishi Y. Taira A. Hama K. Dohmae N. Takio K. Yamori T. Mills G.B. Inoue K. Aoki J. Arai H. J. Cell Biol. 2002; 158: 227-233Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar, 45Clair T. Aoki J. Koh E. Bandle R.W. Nam S.W. Ptaszynska M.M. Mills G.B. Schiffmann E. Liotta L.A. Stracke M.L. Cancer Res. 2003; 63: 5446-5453PubMed Google Scholar). Also changes in the activities of S1P lyase, S1P phosphatase, or ceramidases might contribute to the maintenance of the S1P levels in Sphk1 null mice. However, no changes in mRNA expression of these genes, Sgpp1, Sgpl1, Asah1, and Asah2, were detected after Sphk1 deletion. Serum and plasma levels of S1P in the Sphk1 null mice were reduced to less than 50% of WT, indicating that SPHK1 has an important but not an exclusive role in regulating serum levels of S1P. Even with this reduction in the Sphk1 null mice, the absolute S1P levels in serum and plasma were in the micromolar range, although the actual amount of S1P that is bioavailable is not known. Our determinations of plasma and serum S1P concentrations in mouse are higher than the reported human levels (42Yatomi Y. Igarashi Y. Yang L. Hisano N. Qi R. Asazuma N. Satoh K. Ozaki Y. Kume S. J. Biochem. (Tokyo). 1997; 121: 969-973Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 46Yatomi Y. Ozaki Y. Ohmori T. Igarashi Y. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 64: 107-122Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar). The lymphocyte S1P1 receptor controls egress of mature thymocytes from the thymus and of lymphocytes from lymph nodes (11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). Circulating levels of S1P, which could act on the S1P1 receptor as a migratory signal, may be key to these trafficking events. We did not find alterations in cellularity of lymphoid organs or in distribution of T- and B-cells between lymphoid compartments. These results indicate that if circulating levels of S1P are critical for lymphocyte trafficking, the lowered levels in serum and plasma in the Sphk1 null mice are sufficient to maintain this process. Previous in vitro studies have demonstrated that the sphingosine analogue FTY720 can be a substrate for both SPHK1 and SPHK2 (32Sanchez T. Estrada-Hernandez T. Paik J.H. Wu M.T. Venkataraman K. Brinkmann V. Claffey K. Hla T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47281-47290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (356) Google Scholar, 33Paugh S.W. Payne S.G. Barbour S.E. Milstien S. Spiegel S. FEBS Lett. 2003; 554: 189-193Crossref PubMed Scopus (276) Google Scholar, 34Billich A. Bornancin F. Devay P. Mechtcheriakova D. Urtz N. Baumruker T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47408-47415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (403) Google Scholar). Although some studies had indicated that SPHK2 was more efficient than SPHK1 in catalyzing FTY720 phosphorylation, the enzyme responsible for the in vivo modification of FTY720 was not known. Factors such as accessibility of the substrate to cellular compartments and tissue distribution of the enzymes could influence FTY720 phosphorylation. In the Sphk1 null mice, administered FTY720 was converted to FTY720-P about 25–40% less efficiently than in WT mice, depending of the dose used. The reduction of FTY720-P production in Sphk1 null mice may indicate that SPHK1 normally acts on FTY720 in vivo or may be due to an adaptive shift in equilibrium of competing substrate pools in Sphk1 null mice. However, sufficient levels of FTY720-P were reached in the Sphk1 null mice to generate lymphopenia. These results demonstrate that SPHK1 is dispensable for the functional expression of an immunosuppressive response to FTY720. Although we cannot rule out possible contributions by other unknown kinase activities, these results are consistent with the conclusion that SPHK2 is sufficient for FTY720 functional activation in vivo. In summary, we have reported the first genetic deletion of Sphk1 in mice. Although S1P receptor signaling is essential for lymphocyte trafficking and development of the vascular system in mice, there was no evidence that Sphk1 null mice have major abnormalities in these processes. Severe disruption of physiologic S1P signaling is likely to require substantially reducing circulating and tissue levels of S1P by the simultaneous deletion of multiple Sphk genes. Finally the Sphk1 null mice will be valuable for exploring the role of SPHK1 in vascular function, cancer, autoimmunity, and infertility (47Hla T. Semin. Cell Dev. Biol. 2004; 15: 513-520Crossref PubMed Scopus (353) Google Scholar). We thank Andrea Raths for excellent technical assistance.

METHODS:Between 2019 and 2020, EEG recordings from two institutions that had been recorded with a ninechannel bipolar montage, and included seizure patterns, were collected.The EEG records were classifi ed into those before 37 weeks postmenstrual age (preterm EEGs) and those from 37 weeks onward (term EEGs).EEG records without seizure patterns were also collected.Using the Nihon Kohden seizure-detection program (model QL-162A), these recordings were retrospectively re-analyzed to assess the seizure-detection capability.Experienced investigators evaluated all EEGs for the presence or absence of a seizure pattern.The performance of the program at detecting seizures was investigated. RESULTS:Of the 48 term EEGs, 26 contained 496 seizure episodes.Of the 68 preterm EEGs, 17 included 276 seizure episodes.The average gestational age at recording was 39.6 weeks for the term EEGs and 33.9 weeks for the preterm EEGs.Among the term recordings, hypoxic-ischemic encephalopathy was identifi ed in 16 of the 26 cases, and 3 had neonatal-onset epilepsy.In comparison, 10 of the 17 preterm infants were diagnosed with hypoxic-ischemic encephalopathy.The seizuredetection program accurately identifi ed seizures in 25 of the 26 term infants with seizures, for a sensitivity of 0.96 and specifi city of 0.41.At the individual seizure level, the sensitivity averaged 0.48, with a false-positive rate of 0.33 (/hour).For preterm infants, 14 of 17 were correctly identifi ed with a sensitivity of 0.82 and specifi city of 0.49.The seizure detection sensitivity was 0.33 and the falsepositive rate was 0.33 (/hour).Notable characteristics of undetected seizures in preterm infants included rhythmic delta activity and brief seizure episodes.Events often misclassifi ed as seizures encompassed delta activity specifi c to preterm infants and various artifacts. CONCLUSION:Compared to term infants, the seizuredetection sensitivity was lower in preterm infants.There is a need to develop an artifi cial intelligence algorithm specifi cally trained on the unique background EEG patterns and seizure waveforms of preterm infants.

Background: International guidelines are increasingly advocating for sentinel lymph node (SLN) omission in early breast cancer patients over 70 years. Studies examining such omission in patients with more aggressive phenotypes [lobular subtype/grade 3/lymphovascular invasion (LVI)] are lacking. The aim was to assess the rate of nodal positivity in these subgroups.