Objective Van der Woude Syndrome (VWS) presents with combinations of lip pits (LP) and cleft lip and/or cleft palate (CL/P, CPO). VWS phenotypic heterogeneity even amongst relatives, suggests that epigenetic factors may act as modifiers. IRF6, causal for 70% of VWS cases, and TP63 interact in a regulatory loop coordinating epithelial proliferation and differentiation in palatogenesis. We hypothesize that differential DNA methylation within IRF6 and TP63 regulatory regions underlie VWS phenotypic discordance. Methods DNA methylation of CpG sites in IRF6 and TP63 promoters and in an IRF6 enhancer element was compared amongst blood or saliva DNA samples of 78 unrelated cases. Analyses were done separately for blood and saliva, within each sex and in combination, and to address cleft type (CL/P ± LP vs. CPO ± LP) and phenotypic severity (any cleft + LP vs. any cleft only). Results For cleft type, blood samples showed higher IRF6 and TP63 promoter methylation on males with CPO ± LP compared to CL/P ± LP and on individuals with CPO ± LP compared to those with CL/P ± LP, respectively. Saliva samples showed higher IRF6 enhancer methylation on individuals with CPO ± LP compared to CL/P ± LP and contrary to above, lower TP63 promoter methylation on CPO ± LP compared to CL/P ± LP. For phenotypic severity, blood samples showed no differences; however, saliva samples showed higher IRF6 promoter methylation in individuals with any cleft + LP compared to those without lip pits. Conclusion We observed differential methylation in IRF6 and TP63 regulatory regions associated with cleft type and phenotypic severity, indicating that epigenetic changes in IRF6 and TP63 can contribute to phenotypic heterogeneity in VWS.

Objective Oculoauriculovertebral spectrum (OAVS) encompasses abnormalities on derivatives from the first and second pharyngeal arches including macrostomia, hemifacial microsomia, micrognathia, preauricular tags, ocular, and vertebral anomalies. We present genetic findings on a 3-generation family affected with macrostomia, preauricular tags and ptosis following an autosomal dominant pattern. Design We generated whole-genome sequencing data for the proband, affected father, and unaffected paternal grandmother followed by Sanger sequencing on 23 family members for the top candidate gene mutations. We performed parent and sibling-based transmission disequilibrium tests (TDTs) and burden analysis via a penalized linear mixed model, for segregation and mutation burden, respectively. Next, via bioinformatic tools we predicted protein function, mutation pathogenicity, and pathway enrichment to investigate the biological relevance of mutations identified. Results Rare missense mutations in SIX1, KDR/VEGFR2, and PDGFRA showed the best segregation with the OAVS phenotypes in this family. When considering any of the 3 OAVS phenotypes as an outcome, SIX1 had the strongest associations in parent-TDTs and sib-TDTs ( P = 0.025, P = 0.052) (unadjusted P-values). Burden analysis identified SIX1 (RC = 0.87) and PDGFRA (RC = 0.98) strongly associated with OAVS severity. Using phenotype-specific outcomes, sib-TDTs identified SIX1 with uni- or bilateral ptosis ( P = 0.049) and ear tags ( P = 0.01), and PDGFRA and KDR/VEGFR2 with ear tags (both P < 0.01). Conclusion SIX1, PDGFRA, and KDR/VEGFR2 are strongly associated to OAVS phenotypes. SIX1 has been previously associated with OAVS ear malformations and is co-expressed with EYA1 during ear development. Efforts to strengthen the genotype-phenotype co-relation underlying the OAVS are key to discover etiology, family counseling, and prevention.