Ultrafast isomerization of retinal is the primary step in photoresponsive biological functions including vision in humans and ion transport across bacterial membranes. We used an x-ray laser to study the subpicosecond structural dynamics of retinal isomerization in the light-driven proton pump bacteriorhodopsin. A series of structural snapshots with near-atomic spatial resolution and temporal resolution in the femtosecond regime show how the excited all-trans retinal samples conformational states within the protein binding pocket before passing through a twisted geometry and emerging in the 13-cis conformation. Our findings suggest ultrafast collective motions of aspartic acid residues and functional water molecules in the proximity of the retinal Schiff base as a key facet of this stereoselective and efficient photochemical reaction.

Abstract Historically, room-temperature structure determination was succeeded by cryo-crystallography to mitigate radiation damage. Here, we demonstrate that serial millisecond crystallography at a synchrotron beamline equipped with high-viscosity injector and high frame-rate detector allows typical crystallographic experiments to be performed at room-temperature. Using a crystal scanning approach, we determine the high-resolution structure of the radiation sensitive molybdenum storage protein, demonstrate soaking of the drug colchicine into tubulin and native sulfur phasing of the human G protein-coupled adenosine receptor. Serial crystallographic data for molecular replacement already converges in 1,000–10,000 diffraction patterns, which we collected in 3 to maximally 82 minutes. Compared with serial data we collected at a free-electron laser, the synchrotron data are of slightly lower resolution, however fewer diffraction patterns are needed for de novo phasing. Overall, the data we collected by room-temperature serial crystallography are of comparable quality to cryo-crystallographic data and can be routinely collected at synchrotrons.

Abstract Vision is initiated by the rhodopsin family of light-sensitive G protein-coupled receptors (GPCRs). A photon is absorbed by the 11- cis retinal chromophore of rhodopsin which isomerises within 200 femtoseconds to the all- trans conformation, thereby initiating the cellular signal transduction processes that ultimately lead to vision. However, the intramolecular mechanism by which the photoactivated retinal induces the activation events inside rhodopsin remains elusive. In this work, we use ultrafast time-resolved crystallography at room temperature to determine how an isomerised twisted all-trans retinal stores the photon energy required to initiate protein conformational changes associated with the formation of the G protein-binding signalling state. The distorted retinal at 1 ps time-delay of photoactivation has pulled away from half of its numerous interactions with its binding pocket, and the excess of the photon energy is released through an anisotropic protein breathing motion in the direction of the extracellular space. Strikingly, the very early structural motions in the protein side chains of rhodopsin appear in regions involved in later stages of the conserved Class A GPCR activation mechanism. Our work sheds light on the earliest stages of vision in vertebrates and points to fundamental aspects of the molecular mechanisms of agonist-mediated GPCR activation.

Abstract The binding and release of ligands from their protein targets is central to fundamental biological processes as well as to drug discovery. Photopharmacology introduces chemical triggers that allow the changing of ligand affinities and thus biological activity by light. Insight into the molecular mechanisms of photopharmacology is largely missing because the relevant transitions during the light-triggered reaction cannot be resolved by conventional structural biology. Using time-resolved serial crystallography at a synchrotron and X-ray free-electron laser, we captured the release of the anti-cancer compound azo-combretastatin A4 and the resulting conformational changes in tubulin. Nine structural snapshots from 1 ns to 100 ms complemented by simulations show how cis -to- trans isomerization of the azobenzene bond leads to a switch in ligand affinity, opening of an exit channel, and collapse of the binding pocket upon ligand release. The resulting global backbone rearrangements are related to the action mechanism of microtubule-destabilizing drugs.

Conformational dynamics are essential for proteins to function. Here we describe how we adapted time-resolved serial crystallography developed at X-ray lasers to visualize protein motions using synchrotrons. We recorded the structural changes upon proton pumping in bacteriorhodopsin over 200 ms in time. The snapshot from the first 5 ms after photoactivation shows structural changes associated with proton release at comparable quality to previous X-ray laser experiments. From 10-15 ms onwards we observe large additional structural rearrangements up to 9 Å on the cytoplasmic side. Rotation of Leu93 and Phe219 opens a hydrophobic barrier leading to the formation of a water chain connecting the intracellular Asp96 with the retinal Schiff base. The formation of this proton wire recharges the membrane pump with a proton for the next cycle.

Abstract Time-resolved serial crystallography at X-ray Free Electron Lasers offers the opportunity to observe ultrafast photochemical reactions at the atomic level. The technique has yielded exciting molecular insights into various biological processes including light sensing and photochemical energy conversion. However, to achieve sufficient levels of activation within an optically dense crystal, high laser power densities are often used, which has led to an ongoing debate to which extent photodamage may compromise interpretation of the results. Here we compare time-resolved serial crystallographic data of the bacteriorhodopsin K-intermediate collected at laser power densities ranging from 0.04 to 2493 GW/cm 2 and follow energy dissipation of the absorbed photons logarithmically from picoseconds to milliseconds. Although the effects of high laser power densities on the overall structure are small, in the upper excitation range we observe significant changes in retinal conformation and increased heating of the functionally critical counterion cluster. We compare light-activation within crystals to that in solution and discuss the impact of the observed changes on bacteriorhodopsin biology.

Serine β-lactamases inactivate β-lactam antibiotics in a two-step mechanism comprising acylation and deacylation. For the deacylation step, a water molecule is activated by a conserved glutamate residue to release the adduct from the enzyme. The third-generation cephalosporin ceftazidime is a poor substrate for the class A β-lactamase BlaC from Mycobacterium tuberculosis but it can be hydrolyzed faster when the active site pocket is enlarged, as was reported for mutant BlaC P167S. The conformational change in the Ω-loop of the P167S mutant displaces the conserved glutamate (Glu166), suggesting it is not required for deacylation of the ceftazidime adduct. Here, we report the characterization of wild type BlaC and BlaC E166A at various pH values. The presence of Glu166 strongly enhances activity against nitrocefin but not ceftazidime, indicating it is indeed not required for deacylation of the adduct of the latter substrate. At high pH wild type BlaC was found to exist in two states, one of which converts ceftazidime much faster, resembling the open state previously reported for the BlaC mutant P167S. The pH-dependent switch between the closed and open states is caused by the loss at high pH of a low-barrier hydrogen bond, a proton shared between Asp172 and Asp179. These results illustrate how readily shifts in substrate specificity can occur as a consequence of subtle changes in protein structure.