Abstract Conventional proteomic approaches neglect tissue heterogeneity and spatial localization information. Laser capture microdissection (LCM) can isolate specific cell populations or histological areas from heterogeneous tissue specimens while preserving spatial localization information. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) is currently a standardized method for long-term stable preservation of clinical tissue specimens. However, spatially resolved proteomics (SRP) studies of FFPE tissues by combined LCM and mass spectrometry (MS)-based proteomics face challenges, such as formalin-induced protein crosslinking limits protein extraction and digestion, protein loss during sample preparation, and the detectability of MS for trace tissues. Therefore, it is necessary to specifically develop SRP sample preparation methods and MS methods suitable for trace FFPE tissues. Here, we provide an SRP method suitable for trace FFPE tissues produced by LCM, termed LCM-Magnetic Trace Analysis (LCM-MTA), which can significantly increase the sensitivity, recovery, and integrality of SRP. The starting material has been reduced to about 15 cells, which resolution is comparable to existing spatially resolved transcriptome (SRT). We also apply our LCM-MTA into SRP studies on clinical colorectal cancer (CRC) tissues and accurately distinguish the functional differences of different cell types. In conclusion, LCM-MTA is a convenient, universal, and scalable method for SRP of trace FFPE tissues, which can be widely used in clinical and non-clinical research fields.

Metastasis is the main cause of mortality in colorectal cancer (CRC) patients. Exploring the mechanisms of metastasis is of great importance in both clinical and fundamental CRC research. CRC is a highly heterogeneous disease with variable therapeutic outcomes of treatment. In this study, we applied spatial transcriptomics (ST) to generate a tissue-wide transcriptome from two primary colorectal cancer tissues and their matched liver metastatic tissues. Spatial RNA information showed intratumoral heterogeneity (ITH) of both primary and metastatic tissues. The comparison of gene expressions across tissues revealed an apparent enrichment of cancer stem cells (CSCs) in metastatic tissues and identified FOXD1 as a novel metastatic CSC marker. Trajectory and pseudo-time analyses revealed distinct evolutionary trajectories and a dedifferentiation-differentiation process during metastasis. CellphoneDB analysis suggested a dominant interaction of CD74-MIF with tumor cells in metastatic tissues. Further analysis confirmed FOXD1 as a maker of CSCs and the predictor of patient survival, especially in metastatic diseases. Our study found ITH of primary and metastatic tissues and provides novel insights into the cellular mechanisms underlying liver metastasis of CRC and foundations for therapeutic strategies for CRC metastasis.