Insulin-like growth factors elicit many responses through activation of phosphoinositide 3-OH kinase (PI3K). The tuberous sclerosis complex (TSC1-2) suppresses cell growth by negatively regulating a protein kinase, p70S6K (S6K1), which generally requires PI3K signals for its activation. Here, we show that TSC1-2 is required for insulin signaling to PI3K. TSC1-2 maintains insulin signaling to PI3K by restraining the activity of S6K, which when activated inactivates insulin receptor substrate (IRS) function, via repression of IRS-1 gene expression and via direct phosphorylation of IRS-1. Our results argue that the low malignant potential of tumors arising from TSC1-2 dysfunction may be explained by the failure of TSC mutant cells to activate PI3K and its downstream effectors.

Article15 October 2003free access Redox regulation of PI 3-kinase signalling via inactivation of PTEN Nick R. Leslie Corresponding Author Nick R. Leslie Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Deborah Bennett Deborah Bennett Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Yvonne E. Lindsay Yvonne E. Lindsay Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Hazel Stewart Hazel Stewart Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Alex Gray Alex Gray Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author C.Peter Downes C.Peter Downes Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Nick R. Leslie Corresponding Author Nick R. Leslie Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Deborah Bennett Deborah Bennett Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Yvonne E. Lindsay Yvonne E. Lindsay Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Hazel Stewart Hazel Stewart Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Alex Gray Alex Gray Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author C.Peter Downes C.Peter Downes Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Author Information Nick R. Leslie 1, Deborah Bennett1, Yvonne E. Lindsay1, Hazel Stewart1, Alex Gray1 and C.Peter Downes1 1Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2003)22:5501-5510https://doi.org/10.1093/emboj/cdg513 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The tumour suppressor PTEN is a PtdIns(3,4,5)P3 phosphatase that regulates many cellular processes through direct antagonism of PI 3-kinase signalling. Here we show that oxidative stress activates PI 3-kinase-dependent signalling via the inactivation of PTEN. We use two assay systems to show that cellular PTEN phosphatase activity is inhibited by oxidative stress induced by 1 mM hydrogen peroxide. PTEN inactivation by oxidative stress also causes an increase in cellular PtdIns(3,4,5)P3 levels and activation of the downstream PtdIns(3,4,5)P3 target, PKB/Akt, that does not occur in cells lacking PTEN. We then show that endogenous oxidant production in RAW264.7 macrophages inactivates a fraction of the cellular PTEN, and that this is associated with an oxidant-dependent activation of downstream signalling. These results show that oxidants, including those produced by cells, can activate downstream signalling via the inactivation of PTEN. This demonstrates a novel mechanism of regulation of the activity of this important tumour suppressor and the signalling pathways it regulates. These results may have significant implications for the many cellular processes in which PtdIns(3,4,5)P3 and oxidants are produced concurrently. Introduction The phosphoinositide 3-kinase (PI 3-kinase) cellular signalling pathway plays a pivotal role in controlling numerous biological processes, including cellular survival, proliferation, growth and motility and is deregulated in numerous human tumour types (Cantrell, 2001; Katso et al., 2001; Vanhaesebroeck et al., 2001; Cantley, 2002). The pathway is characterized by the stimulated production of the second messenger, phosphatidylinositol (3,4,5) trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3] by Class I PI 3-kinase enzymes. PtdIns(3,4,5)P3 activates downstream signalling through proteins able specifically to recognize and to bind this lipid. The importance of deregulation of this pathway in tumour development was highlighted by the demonstration that the tumour suppressor, PTEN, is a PtdIns(3,4,5)P3 3-phosphatase, and in many cell types may mediate the principle route of metabolism of this signalling molecule (Maehama et al., 2001; Simpson and Parsons, 2001; Leslie and Downes, 2002). Thus, PTEN can inhibit entry into the cell cycle, metastasis and cell motility, promote apoptosis, and reduce cell growth and size (Furnari et al., 1998; Stambolic et al., 1998; Tamura et al., 1998; Sun et al., 1999; Backman et al., 2002; Davies et al., 2002). However, despite intensive research, a clear picture is yet to emerge of how cells regulate the activity of PTEN. The abundance of PTEN can be regulated transcriptionally (Patel et al., 2001; Virolle et al., 2001) and through phosphorylation-dependent modulation of protein stability (Vazquez et al., 2000; Torres and Pulido, 2001). PTEN can also be recruited into protein complexes through interaction with PDZ domain-containing proteins (Wu,X. et al., 2000; Wu,Y. et al., 2000) and may be selectively recruited onto cellular membrane surfaces that display a more acidic character, such as the inner leaflet of the plasma membrane (Das et al., 2003; McConnachie et al., 2003). However, the significance of much of this data with regard to the cellular regulation of the PI 3-kinase pathway and downstream processes is currently unclear (Leslie et al., 2001; Birle et al., 2002). It has become clear that reactive oxygen species (ROS) are not simply damaging by-products of cellular metabolism, but also play important regulatory roles in many cellular processes (Finkel, 2000; Droge, 2002). For example, the stimulated production of oxidants appears to play a crucial role in the mitogenic response to many growth factors (Chen et al., 1995; Sundaresan et al., 1995; Bae et al., 1997). Recent work has indicated that members of the Protein Tyrosine Phosphatase family, which include the lipid phosphatase, PTEN, can be physiologically regulated through reversible oxidation and inactivation (Denu and Tanner, 1998; Lee et al., 1998; Meng et al., 2002). These enzymes contain a critical cysteine residue in the active site that must be in a reduced state in order to participate in catalysis (Denu and Tanner, 1998; Tonks and Neel, 2001). Consistent with this, PTEN was found to require reducing conditions for optimal activity in vitro (Maehama and Dixon, 1998; Myers et al., 1998). More recently, evidence has shown that inactivation by oxidation might represent a physiological mechanism of regulation of this class of enzymes, not only by oxidative stress, but by ROS produced in other cellular circumstances, including stimulation of cells by growth factors (Meng et al., 2002). A recent study extended these proposals to include PTEN, showing that oxidation of this enzyme in vitro by hydrogen peroxide (H2O2) caused inactivation and the formation of a disulfide bond between the active site cysteine (C124), and another nearby cysteine (C71). This study also showed that H2O2, either in vitro, or in cultured cells caused a reversible shift in the electrophoretic mobility of PTEN consistent with its oxidation (Lee et al., 2002), but did not investigate effects on downstream signalling. Here we show for the first time direct evidence for the oxidative inactivation of PTEN in cells, by both exogenous and endogenously produced oxidants. We also show that oxidants cause an increase in the levels of PtdIns(3,4,5)P3 and activate downstream signalling, and that these effects do not occur in cells lacking PTEN. Results PTEN is sensitive to oxidative inactivation in vitro PtdIns(3,4,5)P3 is believed to be metabolized largely by two distinct cellular pathways; dephosphorylation of the 3 position by PTEN, to produce PtdIns(4,5)P2, or dephosphorylation of the 5 position by members of a family of 5-phosphatases, to produce PtdIns(3,4)P2. We therefore chose to analyse the sensitivity to oxidation of human PTEN by H2O2 in vitro in comparison with human SHIP-2, a structurally unrelated PtdIns(3,4,5)P3 5-phosphatase that uses a different mechanism of catalysis (Figure 1). These studies revealed that the sensitivity of PTEN to oxidation is such that washing the enzyme in ambient conditions in buffers lacking added reducing or oxidizing agents causes substantial loss of activity, relative to the full activity recovered after washing in reducing conditions (5 mM DTT). Addition of H2O2, even at 10 μM, caused an almost complete loss of activity. In contrast, SHIP-2 still displayed strong activity in the presence of 10 mM H2O2. The apparent sensitivity of PTEN to oxidation in vitro (Figure 1A) is somewhat conflicting with data presented by Lee et al. (2002), showing that a 50% reduction in PTEN phosphatase activity was caused by ∼200 μM H2O2. Although the exact redox potential is not known in these experiments, we obtained similar results to their data when directly diluting PTEN enzyme that is stored in buffers containing reducing agents (data not shown), suggesting that the sensitivity of PTEN to oxidation may be underestimated in these latter experiments through reaction of applied oxidants with reducing agents in these storage buffers. Figure 1.PTEN, but not SHIP-2, is highly sensitive to oxidative inactivation in vitro. Recombinant PTEN (A) and SHIP-2 (B) were separately purified by affinity chromatography and immunoprecipitation respectively. Enzymes were then washed in ambient conditions lacking additional reducing or oxidizing agents, and then assayed in the presence of either 5 mM DTT, no additional reducing or oxidizing agents, or of different concentrations of H2O2. Data in (A) show d.p.m. released labelled phosphate, and in (B) show production of labelled PtdIns(3,4)P2 determined by densitometry. Presented data points represent the mean of assays performed in duplicate and the range of these duplicates. The measured activity using boiled enzyme is presented as a negative control. Download figure Download PowerPoint Oxidative stress inactivates cellular PTEN In order to analyse the regulation of PTEN by oxidation in cells, we adapted a novel assay described by Meng et al. (2002). This assay uses lysis buffers containing iodoacetic acid (IAA) irreversibly to alkylate cysteine residues in cellular proteins and is represented diagrammatically in Figure 2A. Alkylation of the active site cysteine residue of PTP family members results in irreversible inactivation. However, oxidized cysteine residues are protected from alkylation and, since their oxidation is reversible, they can be recovered in the absence of IAA and assayed. Thus, the resultant activity data represents the proportion of the phosphatase that is oxidized (and inactive) at the moment of lysis (Meng et al., 2002). The following initial experiments supported the use of this assay (data not shown). Firstly, regardless of cellular oxidative stresses or H2O2 addition after cell lysis, in the absence of alkylating agents, if PTEN immunoprecipitates were washed and assayed in reducing conditions, the same activity was recovered as control samples, indicating that in these experiments oxidation is reversible. Secondly, if IAA was included in a reducing lysis buffer (5 mM DTT), no detectable activity was recovered, indicating alkylation. However, if IAA was included in an oxidizing lysis buffer (1 mM H2O2), and immunoprecipitated enzyme was later reduced in the absence of IAA, substantial activity was recovered, indicating that reversible oxidation can protect PTEN from alkylation. Figure 2.Cellular PTEN is inactivated by oxidative stress. (A) The indirect alkylation method used to analyse the effects of oxidative stress on PTEN activity is shown. It is described in detail in the text and Materials and methods. Iodoacetic acid is abbreviated to IAA and immunoprecipitation to IP. The method causes PTEN that is oxidized and inactive at the moment of lysis to be recovered as activity. Reduced active cellular enzyme is alkylated and this activity is lost. This method is used in panel B. (B) For indirect redox analysis of PTEN, Swiss 3T3 cells were treated for 10 min with the indicated concentrations of H2O2 before being lysed in buffer containing the alkylating agent IAA. PTEN was immunoprecipitated and IAA washed away before PTEN was assayed in reducing conditions. Control cells were also lysed in buffer lacking alkylating agent, but with 5 mM DTT reducing agent and immunoprecipitated, washed and assayed in reducing conditions. A fraction of the first sample from each condition was analysed by western blotting (WB) using a different antibody raised against PTEN. (C) Direct analysis of PTEN activity. Swiss 3T3 cells were treated with or without 1 mM H2O2 for 10 min. Cells were then lysed, and endogenous PTEN was then immunoprecipitated and assayed, all in anaerobic conditions in the absence of additional reducing or oxidizing agents. As a positive control 5 μg of alkaline phosphatase (AP) was used. A fraction of each PTEN IP sample was analysed by western blotting using a different antibody raised against PTEN. Data is presented as mean activity (d.p.m. released phosphate) from duplicate samples ± the range of these duplicates, with the exception of the PTEN IPs from (C) which are derived from triplicate samples. Download figure Download PowerPoint We applied this assay initially to analyse the oxidation of endogenous PTEN in cultured Swiss 3T3 fibroblasts exposed to oxidative stress induced by H2O2. In these experiments, very little PTEN activity was recovered from control cells in normal medium, indicating that most of the enzyme was in the reduced (active) state and was alkylated by IAA upon cell lysis. However, 1 mM H2O2 added to the medium was found to protect almost all cellular PTEN from alkylation, and allow its later recovery as active enzyme, indicating that PTEN was mostly oxidized in these cellular conditions (Figure 2B). In further analyses of the sensitivity of PTEN to exogenous H2O2, a steep response curve was evident, with a 10 min incubation in 1 mM H2O2 protecting most cellular PTEN from alkylation, whilst the protection induced by 100 μM H2O2 was barely detectable (Figure 2B). These experiments consistently showed a small decrease in the electrophoretic mobility of PTEN from lysates treated with IAA. It seems likely that this represents alkylation of the free cysteine residues of PTEN, as PTEN contains 10 cysteines including C71 and C124, and the gradient gels used are able to detect mobility differences of several hundred Daltons. As a verification of the results from this indirect analysis of PTEN oxidative inactivation, cellular PTEN activity was immunoprecipitated and assayed under anaerobic conditions in the absence of additional reducing or oxidizing agents. This work showed that robust PTEN activity could be recovered in these conditions and that this activity was almost completely abolished by treatment of cells with 1 mM H2O2 for 10 min (Figure 2C). This result agrees closely with that found through oxidative protection from alkylation of PTEN (Figure 2B), and strongly validates the adapted method of Meng et al. (2002). The activation of the PI 3-kinase pathway by oxidative stress requires PTEN We have shown that PTEN can be inactivated by oxidative stress. In order to investigate whether this inactivation leads to an activation of downstream PI 3-kinase-dependent signalling, we chose first to analyse cellular phosphoinositide lipid levels. Therefore, we investigated the effects of oxidative stress on the levels of PtdIns(3,4,5)P3 and PtdIns(3,4)P2 in the PTEN-null glioblastoma cell line U87MG, with and without exogenous expression of wild-type PTEN (Figure 3A and C), or with expression of wild-type PTEN, or phosphatase-dead PTEN C124S (Figure 3B), using a viral delivery system. Cells were also treated with and without platelet-derived growth factor (PDGF), which is known to cause a strong activation of PI 3-kinase in these cells. These experiments showed, as would be expected, that in the absence of H2O2, wild-type PTEN expression reduced PtdIns(3,4,5)P3 levels. How ever, in all cases, the PtdIns(3,4,5)P3 levels of cells exposed to 1 mM H2O2 was similar in cells expressing wild-type PTEN compared with those lacking the enzyme activity, suggesting that H2O2 treatment oxidizes and inactivates any expressed PTEN. Most significantly however, these data also showed that in cells expressing PTEN, exposure to H2O2 led to a 3–4 fold increase in the levels of basal PtdIns(3,4,5)P3, whereas in cells lacking PTEN activity, exposure to H2O2 did not significantly change PtdIns(3,4,5)P3 levels. This strongly suggests that the principle mechanism of H2O2-induced PtdIns(3,4,5)P3 increase, is through oxidative inhibition of PTEN. In contrast, levels of PtdIns(3,4)P2 were greatly increased by oxidative stress regardless of cellular PTEN status. This suggests that other targets of oxidative stress exist that can regulate levels of this lipid, perhaps other oxidant sensitive PtdIns(3,4)P2 phosphatases. Figure 3.Oxidative stress increases cellular PtdIns(3,4,5)P3 levels only in cells expressing wild-type PTEN. Cellular levels of PtdIns(3,4,5)P3 (A and B) and PtdIns(3,4)P2 (C) were analysed in U87MG cells ± PTEN activity, stimulated with PDGF and/or H2O2. PTEN-null U87MG cells were labelled with [3H]inositol for 48 h in inositol-free culture medium. For the last 24 h of this incubation, cells were either left uninfected or infected with virus expressing wild-type GFP–PTEN (A and C), or infected with viruses expressing phosphatase-dead GFP–PTEN C124S or wild-type GFP–PTEN (B). Some cells were then stimulated as shown with 1 mM H2O2 or 50 ng/ml PDGF for 10 min before lysis. Cellular phosphoinositides were then purified, deacylated and analysed by HPLC. Data are presented as the mean of duplicate samples plus the range of these duplicates, with data for (A) and (C) being derived from the one experiment. These experiments were performed three times with similar results. The percentage of label incorporated into each lipid in unstimulated uninfected or C124S-infected cells corresponds to 1641, 1317 and 1462 d.p.m. above background in (A), (B) and (C), respectively. Download figure Download PowerPoint To further analyse the activation of downstream PI 3-kinase-dependent signalling by oxidative stress, experiments were conducted investigating the activity and phosphorylation of the PtdIns(3,4,5)P3-dependent kinase, protein kinase B (PKB, also known as Akt) in the presence and absence of PTEN. These experiments showed that as with the PtdIns(3,4,5)P3 measurements, in cells lacking PTEN, PKB activity was not increased by oxidative stress, but was increased by PDGF. When PTEN was expressed in these cells, oxidative stress was then able to cause a substantial increase in PKB activity (Figure 4). In these experiments, a small decrease in PKB serine 473 phosphorylation was seen in response to H2O2 treatment, although a similar effect was not clearly evident in PKB kinase activity and its significance is unclear. These data indicate that oxidative stress is able to activate PKB only in cells expressing PTEN and therefore that this activation is mediated at least in part through oxidative inactivation of this phosphatase. Figure 4.Oxidative stress activates cellular PKB only in cells expressing PTEN. PTEN-null U87MG cells growing at low cell density were either left uninfected or infected with viruses encoding wild-type GFP–PTEN for 24 h. Cells were then stimulated with 1 mM H2O2 or 50 ng/ml PDGF for 10 min before cell lysis and determination of the activity (A) and phosphorylation (B) of PKB/Akt. (A) After lysis, cellular PKB was immunoprecipitated and assayed in vitro. Data is presented as the mean + SD d.p.m. of labelled phosphate incorporated into peptide substrate from triplicate samples. (B) After lysis, the phosphorylation of PKB was analysed by western blotting using antibodies specific for total PKB and for phosphoserine-473 PKB. These experiments were performed three times with similar results. Download figure Download PowerPoint These data show by two distinct approaches, that cellular PTEN is inactivated by oxidative stress. Additionally, analysis of PtdIns(3,4,5)P3 levels and downstream signalling are consistent with the oxidative inactivation of PTEN and indicate that oxidative stress increases PtdIns(3,4,5)P3 levels and activates downstream signalling only in cells that express PTEN. This indicates that oxidative stress is able to regulate PI 3-kinase-dependent signalling through inactivation of PTEN. Physiological redox regulation of PTEN in macrophages It has become clear that H2O2 and other ROS are produced endogenously in many cell types in diverse processes (Finkel, 2000; Droge, 2002). It has also been proposed that ROS are active cellular signalling molecules (Finkel, 1998, 2000). In order to investigate the possibility that PTEN is inactivated by the endogenous production of ROS, we performed an analysis in the murine macrophage cell line, RAW264.7, in which the stimulated production of H2O2 and other ROS by the phagocytic NADPH oxidase complex has been well studied (Ahmed et al., 1997; Brune et al., 1997; Han et al., 2001; Pfeiffer et al., 2001). Significantly, it is known that the phagocytic NADPH oxidase complex can be activated by PtdIns(3,4,5)P3-dependent signals (Babior, 1999; Welch et al., 2002). This potential co-localization of the substrate of PTEN with an oxidant producing complex suggests a possible model for the localized inhibition of PTEN protecting a functionally significant pool of PtdIns(3,4,5)P3. In RAW macrophages, the acute stimulation of oxidant production by lipopolysaccharide (LPS) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) has been described (Ahmed et al., 1997; Brune et al., 1997; Pfeiffer et al., 2001). It has also been shown that LPS treatment leads to the activation of the PtdIns(3,4,5)P3-regulated kinase PKB/Akt (Salh et al., 1998; Monick et al., 2001). Using the oxidant-sensitive fluorophore dichlorofluorescin diacetate, we were able to verify that LPS or PMA, but not insulin, rapidly induced the production of cellular oxidants in RAW264.7 macrophages (data not shown). Therefore, we investigated the oxidation of PTEN in RAW macrophages using the method described above and in Figure 2A. These experiments established that combined stimulation with LPS and PMA for 10 or 30 min induced a significant increase in the fraction of endogenous cellular PTEN protected from experimental alkylation. This was the case in cells both with and without 24 h priming with interferon γ (Figure 5A and B). The reliance of this effect upon cellular oxidant production was investigated using the cell permeant antioxidant N-acetyl cysteine (NAC, 10 mM) and a frequently used inhibitor of NADPH oxidase, diphenyleneiodonium chloride (DPI, 10 μM). Both NAC and DPI interfered with the protection of PTEN from alkylation, again indicating that this reflects oxidation (Figure 5D). Since stimulation did not affect the recovered activity of PTEN in reducing conditions (Figure 5C), these data indicate that these stimuli caused the oxidation and inactivation of a fraction of cellular PTEN that correlated with increased downstream signalling, indicated by phosphorylation of PKB (Figure 5E). The data correspond to an increase in the oxidized inactive fraction of cellular PTEN from ∼5% in unstimulated cells to ∼16% in cells stimulated for 10 min. We also found that stimulation with LPS or PMA alone appeared to result in a rise in the oxidized fraction of cellular PTEN, although this increase was not always statistically significant (LPS, 0 out of 2 experiments significant, PMA 1 out of 2) (data not shown). H2O2 (1 mM) was also found to lead to the oxidation of most cellular PTEN, and substantially to activate PKB in RAW macrophages (data not shown and Figure 6). We also assessed the oxidation of PTEN directly using a method previously used to analyse the p53 protein (Wu and Momand, 1998; Seo et al., 2002) that relies upon an initial cysteine-directed alkylation of proteins in a cell lysate, subsequent reduction, and second treatment with a biotinlyated alkylating agent. This allows the analysis of cysteine residues that were protected in an oxidized form in the initial lysate. This method also showed that in the RAW264.7 macrophages, H2O2 treatment and to a lesser extent stimulation with LPS and PMA lead to a substantial detection of oxidized PTEN (Figure 5F). Figure 5.Inactivation of cellular PTEN by stimulation of RAW264.7 macrophages. RAW264.7 macrophages were either grown in normal medium (A), or primed with 100 ng/ml interferon γ for 24 h (B), before some cells were stimulated with 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA for the indicated times. Cellular PTEN was then immunoprecipitated in the presence of the alkylating agent IAA (as Figure 2A and B), and the fraction of cellular PTEN protected from alkylation by oxidation was determined. Data in (A) are presented as the mean of five samples ± the SEM. This experiment was performed three times with similar results. Data in (B) are presented as the mean of six samples ± SEM. This experiment was performed on three occasions with similar results. In (A) and (B), the mean fully reduced control PTEN activity were 3362 and 5515 d.p.m. respectively. (C) RAW264.7 macrophages were also stimulated for 10 min with 100 ng/ml LPS alone or 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA, and subsequently cells were lysed and PTEN immunoprecipitated and assayed all in reducing conditions in the absence of alkylating agents. (D) The oxidant dependence of the protection of PTEN from alkylation in stimulated macrophages (as panel A) was investigated. The stimulated production of ROS in RAW macrophages was antagonized by a 5 min pre-treatment with either 10 μM DPI or 10 mM NAC before stimulation with 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA for 10 min. Cells were then lysed and the protection of PTEN from alkylation was investigated as above (Figures 2 and 5A and B). Data are presented as the mean of three samples ± SEM. (E) PKB phosphorylation in lysates used for the investigation of the oxidation of cellular PTEN (see panels A and B) was analysed in duplicate samples by Western blotting using antibodies specific for phosphoserine-473 PKB and total PKB. The presence of the alkylating agent IAA in the lysis buffer did not appear to interfere with this analysis. (F) The oxidation of PTEN was analysed using a biotinlyated alkylating agent as described in Materials and methods. RAW264.7 macrophages were treated with or without either 1 mM H2O2 or with 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA. Cells were lysed in the presence of alkylating agent and proteins sequentially reduced and alkyated with a second biotinylated alkylating agent. PTEN was then immunoprecipitated and analysed either by western blotting with different antibodies against the protein, or with streptavidin–HRP. Download figure Download PowerPoint Figure 6.Stimulation of RAW264.7 macrophages induces an oxidant-dependent activation of PKB. RAW264.7 macrophages were left untreated (−) or pre-treated for 5 min with 10 mM NAC (N) or DPI (D). Cells were then left untreated (control) or stimulated with 100 ng/ml LPS, 1 μM PMA, 10 μM insulin or 1 mM H2O2, each for 10 min. Cells were lysed and the activity state of cellular PKB was analysed using an in vitro kinase assay of immunoprecipitated PKB (A), or PKB phosphorylation analysed using western blotting with antibodies specific for phosphoserine-473 PKB, total PKB and PTEN (B). Data in (A) are presented as the mean activity ± SEM from a minimum of three samples. These experiments were performed three times with similar results. Download figure Download PowerPoint Experiments measuring PtdIns(3,4,5)P3 levels in RAW macrophages proved unsuccessful, as levels of this lipid appeared to be unusually low (<0.001% of that of phosphatidylinositol in pilot experiments, N.Leslie and S.Safrany unpublished data). Therefore, PKB activation was analysed in these cells, and the reliance of this activation upon oxidant production investigated using NAC and DPI, as described above. Pilot experiments showed that in comparison with other cell types RAW cells express PKBγ and low levels of PKBα that can be activated by cellular stimulation with a number of stimuli including LPS, PMA, interferon γ, H2O2 and insulin, the latter possibly acting through an IGF1 receptor. While stimulation with LPS, PMA or insulin all increased cellular PKB activity several fold, the activation by LPS and PMA was significantly inhibited by either NAC or DPI, indicating a requirement for cellular oxidant production in the activation of PKB by these stimuli (Figure 6). In contrast, the activation of PKB by insulin was not significantly affected. These data suggest that LPS and PMA both activate PKB by an oxidant-dependent mechanism, but insulin does so by an oxidant-independent pathway. The extent of the oxidant-independent activation of PKB might be expected to indicate the relative importance of stim

Mutations in the phosphatase and tensin homolog (PTEN) gene leading to PTEN protein deletion and subsequent activation of the PI3K/Akt signaling pathway are common in cancer. Here we show that PTEN inactivation in human T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cells is not always synonymous with PTEN gene lesions and diminished protein expression. Samples taken from patients with T-ALL at the time of diagnosis very frequently showed constitutive hyperactivation of the PI3K/Akt pathway. In contrast to immortalized cell lines, most primary T-ALL cells did not harbor PTEN gene alterations, displayed normal PTEN mRNA levels, and expressed higher PTEN protein levels than normal T cell precursors. However, PTEN overexpression was associated with decreased PTEN lipid phosphatase activity, resulting from casein kinase 2 (CK2) overexpression and hyperactivation. In addition, T-ALL cells had constitutively high levels of ROS, which can also downmodulate PTEN activity. Accordingly, both CK2 inhibitors and ROS scavengers restored PTEN activity and impaired PI3K/Akt signaling in T-ALL cells. Strikingly, inhibition of PI3K and/or CK2 promoted T-ALL cell death without affecting normal T cell precursors. Overall, our data indicate that T-ALL cells inactivate PTEN mostly in a nondeletional, posttranslational manner. Pharmacological manipulation of these mechanisms may open new avenues for T-ALL treatment.

Different bioprinting techniques have been used to produce cell-laden alginate hydrogel structures, however these approaches have been limited to 2D or simple three-dimension (3D) structures. In this study, a new extrusion based bioprinting technique was developed to produce more complex alginate hydrogel structures. This was achieved by dividing the alginate hydrogel cross-linking process into three stages: primary calcium ion cross-linking for printability of the gel, secondary calcium cross-linking for rigidity of the alginate hydrogel immediately after printing and tertiary barium ion cross-linking for long-term stability of the alginate hydrogel in culture medium. Simple 3D structures including tubes were first printed to ensure the feasibility of the bioprinting technique and then complex 3D structures such as branched vascular structures were successfully printed. The static stiffness of the alginate hydrogel after printing was 20.18 ± 1.62 KPa which was rigid enough to sustain the integrity of the complex 3D alginate hydrogel structure during the printing. The addition of 60 mM barium chloride was found to significantly extend the stability of the cross-linked alginate hydrogel from 3 d to beyond 11 d without compromising the cellular viability. The results based on cell bioprinting suggested that viability of U87-MG cells was 93 ± 0.9% immediately after bioprinting and cell viability maintained above 88% ± 4.3% in the alginate hydrogel over the period of 11 d.

Article16 April 2009Open Access Prdx1 inhibits tumorigenesis via regulating PTEN/AKT activity Juxiang Cao Juxiang Cao Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Jennifer Schulte Jennifer Schulte Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Alexander Knight Alexander Knight Whitworth University, Spokane, WA, USA Search for more papers by this author Nicholas R Leslie Nicholas R Leslie Division of Molecular Physiology, College of Life Sciences, University of Dundee, Wellcome Trust Biocentre, Dundee, UK Search for more papers by this author Agnieszka Zagozdzon Agnieszka Zagozdzon Department of Pathology, Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Roderick Bronson Roderick Bronson Department of Pathology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Yefim Manevich Yefim Manevich Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Craig Beeson Craig Beeson Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Carola A Neumann Corresponding Author Carola A Neumann Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Juxiang Cao Juxiang Cao Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Jennifer Schulte Jennifer Schulte Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Alexander Knight Alexander Knight Whitworth University, Spokane, WA, USA Search for more papers by this author Nicholas R Leslie Nicholas R Leslie Division of Molecular Physiology, College of Life Sciences, University of Dundee, Wellcome Trust Biocentre, Dundee, UK Search for more papers by this author Agnieszka Zagozdzon Agnieszka Zagozdzon Department of Pathology, Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Roderick Bronson Roderick Bronson Department of Pathology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Search for more papers by this author Yefim Manevich Yefim Manevich Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Craig Beeson Craig Beeson Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Carola A Neumann Corresponding Author Carola A Neumann Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA Search for more papers by this author Author Information Juxiang Cao1,‡, Jennifer Schulte1,‡, Alexander Knight2, Nicholas R Leslie3, Agnieszka Zagozdzon4, Roderick Bronson5, Yefim Manevich1, Craig Beeson6 and Carola A Neumann 1 1Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Medical Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA 2Whitworth University, Spokane, WA, USA 3Division of Molecular Physiology, College of Life Sciences, University of Dundee, Wellcome Trust Biocentre, Dundee, UK 4Department of Pathology, Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA 5Department of Pathology, Harvard Medical School, Boston, MA, USA 6Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Department of Cell and Molecular Pharmacology, Medical University of South Carolina, 173 Ashley Ave., MSC-505, Charleston, SC 29425, USA. Tel.: +843 792 8367; Fax: 843 792 2475; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2009)28:1505-1517https://doi.org/10.1038/emboj.2009.101 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info It is widely accepted that reactive oxygen species (ROS) promote tumorigenesis. However, the exact mechanisms are still unclear. As mice lacking the peroxidase peroxiredoxin1 (Prdx1) produce more cellular ROS and die prematurely of cancer, they offer an ideal model system to study ROS-induced tumorigenesis. Prdx1 ablation increased the susceptibility to Ras-induced breast cancer. We, therefore, investigated the role of Prdx1 in regulating oncogenic Ras effector pathways. We found Akt hyperactive in fibroblasts and mammary epithelial cells lacking Prdx1. Investigating the nature of such elevated Akt activation established a novel role for Prdx1 as a safeguard for the lipid phosphatase activity of PTEN, which is essential for its tumour suppressive function. We found binding of the peroxidase Prdx1 to PTEN essential for protecting PTEN from oxidation-induced inactivation. Along those lines, Prdx1 tumour suppression of Ras- or ErbB-2-induced transformation was mediated mainly via PTEN. Introduction Peroxiredoxins (Prdxs) are a superfamily of small non-seleno peroxidases (22–27 kDa) currently known to possess six mammalian isoforms. Although their individual roles in cellular redox regulation and antioxidant protection are quite distinct, they all catalyse peroxide reduction to balance cellular H2O2 levels essential for signalling and metabolism (Rhee, 2006). Prdxs I–IV share the common CxxC motif and use thioredoxin (Trx) as an electron donor (Chae et al, 1994a). On reaction with peroxides, the Prdxs’ ‘peroxidatic’ cysteine (Cys51 in Prdx1) is oxidized into a sulfenic acid intermediate, which then forms a disulfide bond with the ‘resolving’ cysteine (Cys172 in Prdx1) from the other homodimer's subunit. Catalytic reduction of peroxides results in different oxidation states of the catalytic cysteine. Lower oxidation states (sulfenic acid) are reduced back to thiol by the Trx system. Higher oxidation states such as sulfinic acid can be reduced back to thiol by sulfiredoxin, whereas the oxidation to sulfonic acid is irreversible and results in Prdx degradation (Neumann and Fang, 2007). Loss of Prdx1 shortens the life span of mice due to the development of hemolytic anemia and cancer. Analysis of cells and mice lacking Prdx1 suggested that it not only regulated H2O2 levels, but also that it possessed the properties of a tumour suppressor (Neumann et al, 2003), which was further supported by the finding that Prdx1 interacts with c-Myc thereby selectively inhibiting c-Myc transcriptional activity (Egler et al, 2005). Peroxides are known to modify protein tyrosine phosphatases (PTPs) by oxidation. PTP catalytic property depends on a thiolate anion of a low pKa cysteine residue (pKa 4.7–5.4) located in the conserved motif of its active site (Zhang and Dixon, 1993; Peters et al, 1998). This highly nucleophilic group makes the initial attack on the phosphate group of the substrate, but renders the PTP extremely susceptible to oxidation resulting in its inactivation. The PTP and tumour suppressor PTEN exhibits phosphatase activity towards phosphoinositides and tyrosine phosphates and is known to be inactivated through H2O2-mediated oxidation or through growth factor signalling, including epithelial growth factor (EGF) or platelet-derived growth factor (PDGF) (Leslie et al, 2003; Kwon et al, 2004). Analysis of human recombinant PTEN revealed that two of the five cysteines in its N-terminal phosphatase domain (PTD) (Cys71 and Cys124) form a disulfide bond after oxidation, which resulted in the transient inhibition of its phosphatase activity and allowed oxidized PTEN to migrate faster on a non-reducing SDS–PAGE (Lee et al, 2002; Kwon et al, 2004). In stimulated macrophages, PTEN oxidation led to the temporary inhibition of its phosphatase activity and in the phosphorylation of Akt on Serine 473 (Leslie et al, 2003). PTEN deficiency is a hallmark of many human tumours (Keniry and Parsons, 2008) and is accompanied by enhanced cell proliferation, decreased cell apoptosis and increased Akt activity (Stambolic et al, 1998). Akt is regulated by PI3K and PTEN, thus playing a central role particularly in Ras- and ErbB-2-induced transformation. Akt activity has been proven crucial for the initiation of this transformation, both in vitro and in vivo (Sheng et al, 2001; Hutchinson et al, 2004; Lim and Counter, 2005) and phosphatase inactive PTEN (PTEN Cys124Ser) is incapable of suppressing Ras-induced transformation either in vitro or in vivo (Tolkacheva and Chan, 2000; Koul et al, 2002). Although it is known that PTEN activity is negatively regulated through oxidation, the existence of a protective mechanism inhibiting such inactivation has not been proposed. On the basis of our findings, we propose here that Prdx1 promotes PTEN tumour suppressive function by binding PTEN and protecting its lipid phosphatase activity from H2O2-induced inactivation. This way, Prdx1 controls excessive cellular Akt activity and reduces the susceptibility to H-Ras and ErbB-2-induced transformation. Results Prdx1 inhibits Ras-induced transformation through its peroxidase activity We tested first Prdx1 peroxidase activity under physiological conditions and measured endogenous H2O2 release in growing cells over time. Extracellular H2O2 buildup from Prdx1−/−;Prdx1WTMEFs was less compared with Prdx1−/−MEFs during the 240 min measured. In contrast, Prdx1−/−;Prdx1C51/172SMEFs resulted in an excess of extracellular H2O2 buildup (Supplementary Figure S1A). Rates calculated for extracellular H2O2 buildup (pmol/min) confirmed that Prdx1−/−;Prdx1WTMEFs released H2O2 at a 30% lower rate than Prdx1−/−MEFs, whereas Prdx1−/−;Cys51/172SMEFs released H2O2-release 1.5-fold more than Prdx1−/−MEFs (Figure 1A, left panel). Western blotting analysis further confirmed that Prdx1 was functioning as a peroxidase, as Prdx1WT protein formed mostly DTT-reducible (data not shown) H2O2-scavenging dimeric structures (Figure 1A, right panel), whereas Prdx1Cys51/172S did not, as dimer formation depends on Cys51 and Cys172 disulfides (Chae et al, 1994b). The remaining Prdx1 monomers were not over-oxidized and therefore active (unlike Prdx1 monomers in H2O2-treated Prdx1−/−;Prdx1WTMEFs). Prdx1 peroxidase activity was required to suppress H-Ras-induced tumour suppression, as Prdx1−/−MEFs transduced with retrovirus expressing H-RasV12 formed two-fold more colonies in soft agar compared with Prdx1+/+;H−RasV12MEFs (Figure 1B, left panel). Expression of exogenous Prdx1WT reduced colony formation by 50% in Prdx1−/−;H−RasV12MEFs and by 20% in Prdx1+/+;H−RasV12MEFs, whereas exogenously expressed Prdx1C51/172S modestly increased colony formation in Prdx1−/−;H−RasV12MEFs and Prdx1+/+;H−RasV12MEFs. Western blot analysis ensured that re-expression of Prdx1 proteins in Prdx1−/−MEFs did not exceed those Prdx1 levels found in Prdx1+/+MEFs (Figure 1B, right panel). Prdx1−/−;H−RasV12MEFs appeared also more spindle-like than Prdx1+/+;H−RasV12MEFs, whereas expression of Prdx1WT in Prdx1−/−;H−RasV12MEFs reversed the spindle-like morphology. Expression of exogenous Prdx1C51/172S, however, promoted spindle-like cell morphology in both Prdx1−/−;H−RasV12MEFs and Prdx1+/+;H−RasV12MEFs (Supplementary Figure S1B). Analysis of the Prdx1 peroxidase activity in H-RasV12-transformed MEFs showed that Prdx1−/−;Prdx1WT;H−RasV12MEFs released H2O2 at a 26% lesser rate than Prdx1−/−;H−RasV12MEFs, which was comparable to the rate found Prdx1−/−EVMEFs. In contrast, Prdx1−/−;C51/172S;H−RasV12MEFs had a 1.5-fold increased rate of H2O2 release compared with Prdx1−/−;Prdx1WT;H−RasV12MEFs (Figure 1C). Figure 1.(A) Left panel: rate of H2O2 release per minute was analysed by calculating the linear slope of data obtained in Supplementary Figure S1A. H2O2 release is expressed per 1 × 106 cells per minute. P-values were calculated using an unpaired Student's t-test. Rate of H2O2 release in Prdx1−/−MEFs compared with either Prdx1−/−Prdx1WTMEFs (*P=0.04) or Prdx1−/−Prdx1Cys51/172S (**P=0.001). Right panel: protein levels and oxidation status of expressed Prdx1 in MEFs used in left panel. Protein lysates were prepared as described under Materials and methods and analysed under non-reducing conditions. Status of over-oxidized Prdx1 was tested by using an antibody recognizing Prdx1 (Prdx1-SO2/SO3) (Woo et al, 2003). (B) Left panel: Prdx1−/−MEFs and Prdx1+/+MEFs were infected with retroviral constructs carrying genes for Prdx1WT or Prdx1C51/172S. MEFs were further infected with retrovirus expressing either H-RasV12 or puromycin resistance gene only (EV) and plated in duplicates in soft agar. Colonies were counted after 18–20 days. Right panel: proteins of clones used in soft agar experiment were analysed for expression levels of Prdx1 and Ras. (C) Rate of H2O2 release per minute was analysed by calculating the linear slope of MEFs used in (B, left panel). For each clone, six wells were plated and analysed. The experiment shown here is representative of three independent studies from two different sets of MEF clones obtained from Prdx1 littermates. P-values were calculated using an unpaired Student's t-test. *P=0.045; **P=0.004. Differences in Prdx1+/+MEFs were not statistically significant. Download figure Download PowerPoint Loss of Prdx1 promotes PTEN oxidation and Akt activation We investigated now whether Prdx1 regulates H-Ras effector pathways known to promote transformation, including PI3K/Akt, RalGEF or MAPK pathways (Li et al, 2004; Lim and Counter, 2005). Treatment of MEFs with H2O2 (50 μM) for increasing periods of time enhanced Akt phosphorylation on Ser473 (pAktSer473) and Thr308 (pAktThr308) at a higher level in Prdx1−/−MEFs compared with Prdx1+/+MEFs (Figure 2A). This finding correlated with a steady increase of PTEN oxidation over time in Prdx1−/−MEFs, whereas in Prdx1+/+MEFs PTEN oxidation plateaued after 6–8 min (Figure 2B and C). Phosphorylation of Akt on serine 473 (pAktSer473) and PTEN oxidation increased also in Prdx1−/− MEFs compared with Prdx1+/+MEFs when exposed to increasing amounts of H2O2 (Supplementary Figure S2A and B). Similar data were obtained by inducing H2O2 endogenously through treating cells with PDGF, as it led to a larger increase in (1) pAktSer473 and pAktThr308 (Figure 2D) and (2) PTEN oxidation in Prdx1−/−MEFs when compared with Prdx1+/+MEFs (Figure 2E). Although PTEN oxidation steadily increased in Prdx1−/−MEFs, it decreased in Prdx1+/+MEFs over time (Figure 2E and F). Levels of PAktSer473 and PTEN oxidation was also increased in Prdx1−/−MEFs compared with Prdx1+/+MEFs when exposed to increasing amounts of H2O2 or PDGF (Supplementary Figure S2A–D). Lastly, we confirmed that lack of Prdx1 enhanced basal and H2O2-induced phosphorylation of Akt substrates in Prdx1−/−MEFs more than in Prdx1+/+MEFs (Figure 2G). Figure 2.(A) Prdx1−/−MEFs and Prdx1+/+MEFs were stimulated with H2O2 as indicated. Protein lysates were collected under argonized conditions by scraping cells into argon-purged lysis buffer (see Materials and methods) and analysed under non-reducing conditions on SDS–PAGE. Akt phosphorylation was detected on Ser473 and Thr308. Akt protein as loading control. (B) Prdx1−/−MEFs and Prdx1+/+MEFs protein lysates were treated as described under (A) and analysed for oxidized PTEN proteins. Actin as loading control. (C) Levels of oxidized PTEN proteins were evaluated by quantifying oxidized and reduced PTEN using a Fuji imaging system (LAS 3000) and related software (ImageGuage). Quantifications of staining intensities were obtained by analysing protein bands from the same ECL obtained film exposure. The y-axis represents staining intensities in arbitrary units of oxidized PTEN. Curves represent data from three independent experiments. (D) Prdx1−/−MEFs and Prdx1+/+MEFs were stimulated with PDGF as indicated. Protein lysates were collected and analysed as described under (A). (E) Prdx1−/−MEFs and Prdx1+/+MEFs protein lysates were treated as described under (D) and analysed for oxidized PTEN proteins. Actin as loading control. (F) Data analysis was done as described under (C). All experiments shown are representative of at least three independent studies including two sets of MEF clones from Prdx1 littermates. (G) Serum starved MEFs were stimulated with H2O2 as indicated. Protein lysates were collected and analysed as described under (A). Akt substrates were detected by western blotting using an phospho-Akt substrate antibody (RXRXXS/T). Download figure Download PowerPoint Prdx1 interacts with PTEN PTEN forms a complex with endogenous and epitope-tagged HA–Prdx1 (Figure 3A). This complex was regulated by oxidative stress, as co-expressed epitope-tagged Myc–PTEN and HA–Prdx1 dissociated under increasing concentrations of oxidative stress (Figure 3B, upper panel). In contrast, increasing dosages of H2O2 did not disrupt binding of Prdx1Cys51/72Ser with PTEN (Figure 3C). Immunoblotting confirmed equal expression of proteins (Supplementary Figure S3A and B). Peroxidatic Cys51 may regulate the H2O2-induced Prdx1:PTEN complex disruption as Prdx1C51S and Prdx1C51/172S proteins bind more to wild-type PTEN than Prdx1C172S (Figure 3D). We further confirmed a physical association between Prdx1 and PTEN by using GST-pull down of GST–Prdx1 and His–PTEN (Figure 3E). Mutational analysis suggested that Prdx1 interacts within the C2 domain of PTEN (amino acids 186–274) (Figure 3F; Supplementary Figure S3C and D) and PTEN with the N terminus of Prdx1 (amino acids 1–40) and the C terminus of Prdx1 (amino acids 157–199) (Figure 3F, lower schematic and Supplementary Figure S3G). Computational analysis allowed us to narrow those interaction surfaces (Figure 3G). The images of Prdx1 and PTEN were generated from coordinates from the protein database 1d5r (Lee et al, 1999) and 2z9s (Matsumura et al, 2008), respectively. As shown for PTEN, the region of 186–251 consists of two double-stranded anti-parallel sheets connected through two flexible loops. Similarly, the 1–40 region of Prdx1 consists of a single double-stranded anti-parallel sheet and another, surface exposed single sheet strand. In Figure 3G, the Prdx-1 protein is shown only as the monomer and the helical region that lies at the dimer interface, residues 183–199, are also positioned in a surface exposed position that is obviously well poised to mediate a protein–protein interaction. Deleting the identified interaction sites in PTEN and Prdx1 altered enzyme activity of both enzymes (data not shown), which did not allow us to study the role of a physical interaction in protecting PTEN lipid phosphatase activity. Figure 3.(A) Epitope-tagged PTEN was expressed in 293T cells. Cell lysate was prepared under anaerobic conditions and immunoprecipitates were prepared as described in Materials and methods. A measure of 1000 μg of protein was immunoprecipitated (anti-PTEN antibody; Santa Cruz). Proteins were analysed by SDS–PAGE. PTEN and Prdx1 proteins were detected by staining membranes with anti-PTEN (138G6, Cell Signaling) and anti-Prdx1 (Abcam) antibodies, respectively. (B) Epitope-tagged PTEN and Prdx1 wild type were co-expressed in 293T cells. Before lysis, cells were treated with increasing dosages of H2O2 as indicated for 15 min. Cell lysates were prepared under anaerobic conditions, and precipitated over night using HA-conjugated agarose beads. IPs were washed four times with argon-purged lysis buffer and analysed by western blotting. Proteins were detected with anti-PTEN, anti-Prdx1-SO2/-SO3 and anti-Prdx1 antibodies. Epitope-tagged Prdx1 migrates slower electrophoretically than endogenous Prdx1, labelled as HA–Prdx1. Epitope-tagged PTEN is labelled as Myc–PTEN. Anti-Prdx1-SO2/-SO3 can cross-react with Prdx2-4 and stains more intense in the IP proteins due to over night incubation and longer exposure to atmospheric oxygen. In contrast, lysates were immediately frozen (Supplementary Figure S3A and B). (C) Myc–PTEN and HA–Prdx1C51/172S were analysed as described under (B). Anti-Prdx1-SO2/-SO3 does not bind Prdx1C51/172S. (D) Recombinant His–PTEN (100 nM) was applied to equimolar GST or GST–Prdx1 and incubated over night. Glutathione sepharose (GST) beads were added for GST-pull down and analysed by western blotting. Input represents 1/50 of the total. (E) HA–Prdx1 wild type and cysteine to serine mutants of catalytically active Prdx1 cysteines were co-expressed with Myc-tagged PTEN wild type. HA–IPs were processed as under (B). Left side shows co-immunoprecipitations, right side shows expression of PTEN and Prdx1 cysteine to serine mutants. (F) Schematic domain structure of potential interaction sites of Prdx1 with PTEN (upper schematic) and PTEN with Prdx (lower schematic). (G) Identification of potential interaction sites using computer modelling (SwissPdb Viewer version 4; http://www.expasy.org/spdbv) (Guex and Peitsch, 1997). *Prdx1 N terminus. Download figure Download PowerPoint Prdx1 interaction with PTEN protects and promotes PTEN lipid phosphates activity under oxidative stress PTEN lipid phosphatase activity was fully protected by Prdx1 in cells under mild oxidative stress (25 μM H2O2) (Figure 4A), where Prdx1 was found to bind PTEN (Figure 3B). However, under higher oxidative stress treatment (500 μM H2O2), which resulted in decreased binding of PTEN and Prdx1 (Figure 3B), impaired PTEN's lipid phosphatase activity. Western blotting confirmed equal amounts of PTEN protein in the lipid phosphatase assay (Figure 4A, lower panel). To complement those results, we exposed recombinant purified His-tagged PTEN to H2O2 in the absence or presence of increasing amounts of purified recombinant Prdx1 and assayed PTEN for PI(3,4,5)P3 utilization. As expected (Figure 4B), in the presence of H2O2, we found that low molar amounts of Prdx1 protein weakly protected PTEN lipid phosphatase activity, whereas equimolar Prdx1 fully restored and further increases in Prdx1 protein amount did not enhance PTEN lipid phosphatase activity any more. Pre-incubation of PTEN in this assay with N-and C-terminal Prdx1 peptide replica (P1 and P2, respectively; peptide sequences were based on Prdx1 interaction mapping as shown in Supplementary Figure S3G and discussed for Figure 3G) decreased PTEN lipid phosphatase activity efficiently to 53%, which was comparable to PTEN activity observed with H2O2 treatment in the absence of Prdx1 (50%) (Figure 4C). Addition of P1 decreased PTEN lipid phosphatase activity only to 65%, whereas P2 lowered it to 57%. However, as shown in Figure 4D, the addition of His-purified PTEN to recombinant Prdx1 inhibited Prdx1 peroxidase activity. Under our experimental conditions, the kinetics of NADPH oxidation to NADP+ were linear and the Prdx1 inhibition was proportional to molar amount of PTEN and reached saturation (completed inhibition) at PTEN/Prdx1=1:1 (mol/mol) ratio. Moreover, an increase in PTEN ratio lowered the velocity of Prdx1 peroxidase activity (Figure 4E). Figure 4.(A) Epitope-tagged Myc–PTEN and HA–Prdx1 were co-expressed in 293T cells, which were treated with H2O2 for 15 min, as indicated. Cell lysates were prepared under anaerobic conditions, and precipitated over night as described above by using anti-PTEN antibody. PTEN-immunoprecipitates were analysed for PI(3,4,5)P3-utilization in a 96-well plate assay as described in Materials and methods (triplicate samples). All results are presented as mean±s.e. (or difference) for at least two independent experiments. Equal PTEN protein amount was confirmed by western blotting. (B) 500 μM of H2O2 was added to either 20 pmoles of recombinant His-purified PTEN in the presence of different amounts of recombinant purified Prdx1 as indicated and described in Materials and methods. Experiment shown is representative of three independent studies. (C) PTEN activity was measured as described in (B) in the presence of peptides interfering with Prdx1 binding to PTEN. P1 (peptide 1) is replica of first N-terminal 21 amino acids (AS) of Prdx1; P1 Sc, scrambled sequence of P1; P2 (peptide 2), replica of last C-terminal 26 AS of Prdx1; P2 Sc, scrambled sequence of P2. The results are presented as mean±s.e. (or difference) for at least two independent experiments. (D) Prdx1 peroxidase activity was measured by a standard thioredoxin (Trx)/thioredoxin reductase (TrxR)/NADPH-coupled spectrophotometric assay (see Materials and methods for details). A measure of 20 pmoles of purified Prdx1 (Sigma) was incubated with 500 μM H2O2 and increasing molar amounts of purified His–PTEN as indicated. Prdx1 peroxidase activity (without PTEN) was about 68 nmol/mg protein/min under those conditions (extinction coefficient 6.62 mM−1 cm−1 for NADPH at 340 nm). Experiment shown is representative of three to four independent studies. (E) Relative reaction velocity of Prdx1 peroxidase activity from (D) was determined by plotting linear regression coefficient K (y=a−Kx, where y is the absorbency at 340 nm and x is time) versus various PTEN/Prdx1 (mol/mol) ratios. The results are presented as mean±s.e. (or difference) for at least two independent experiments. Download figure Download PowerPoint Prdx1 suppresses H-Ras and ErbB-2-induced transformation mainly via promoting PTEN activity Next, we examined in PTEN−/−MEFs whether Prdx1 has an important function in PTEN-induced tumour suppression. Although Prdx1 knock down in PTEN−/−MEFs decreased pAktSer473 levels, H2O2 treatment of MEFs increased it equally in PTEN−/−MEFs and PTEN+/+MEFs (Figure 5A). Prdx1 is neither over-oxidized nor does it form less peroxidase active dimers in PTEN−/−MEFs compared with PTEN−/−MEFs reconstituted with GFP–PTEN, suggesting that in PTEN-null cells, Prdx1 activity is not compromised after H2O2 treatment (Figure 5B). PI3K/Akt signalling is also essential for oncogenic ErbB-2-induced transformation (Maroulakou et al, 2007), and Akt1 deficiency sufficiently suppresses tumour development in PTEN+/−mice (Chen et al, 2006). As shown for H-Ras (Figure 1B), Prdx1WT also prevented ErbB-2/neuT-induced transformation depending on its peroxidase activity (Supplementary Figure S5A). By using small hairpin (sh) RNA targeting Prdx1 mRNA (shPrdx1) in PTEN−/−MEFs, transformed by either H-RasV12 or ErbB-2/neuT, we showed that Prdx1 suppressed transformation mainly by regulating PTEN (Figure 5C–E). Although shPrdx1 expressed in PTEN−/−;H−RasV12MEFs or PTEN−/−;ErbB−2/neuT MEFs did not increase colony formation compared with PTEN−/−;H−Ras;pMKO1MEFs or PTEN−/−ErbB−2/neuT;pMKO1MEFs, in PTEN−/−;shPrdx1;GFP−PTEN,H−RasV12MEFs showed 1.5-fold increase in colony formation compared with PTEN−/−;pMKO1;GFP−PTEN,H−RasV12MEFs and PTEN−/−;shPrdx1;GFP−PTEN,ErbB−2/neuTMEFs and 1.35-fold increase in colony formation compared with PTEN−/−;pKMO1;GFP−PTEN;ErbB−2/neuTMEFs. Furthermore, a slight increase of Prdx1 oxidation was noted in PTEN−/−;pMKO1;H−RasV12MEFs compared with PTEN−/−;GFP−PTEN;H−RasV12MEFs and in PTEN−/−;pMKO1;ErbB−2/neuTMEFs compared with PTEN−/−;GFP−PTEN;ErbB−2/neuTMEFs. By using minimum dosages of two well-known PI3K inhibitors, Wortmannin (WM) and Ly294002 (Ly) that inhibited H2O2-induced Akt activity in Prdx1−/−MEFs less efficiently than in Prdx1+/+MEFs (Supplementary Figure S5B), we found that partial inhibition of PI3K/Akt activity translates into less efficient inhibition of H-Ras or ErbB-2-induced transformation in Prdx1−/−MEFs compared with Prdx1+/+MEFs (Table I): 5 nM WM reduced Prdx1−/−;H−RasV12MEFs colony number by <4%, 10 nM WM by 2.3%. However, 5 nM WM decreased Prdx1+/+;H−RasV12MEFs colony numbers by 46% and (P=<0.001) 10 nM WM by 67%. Similarly, 10 μM Ly decreased Prdx1−/−;H−RasV21MEFs colony number by 61% and in Prdx1+/+;H−RasV12MEFs by 73%. However, 10 μM Ly decreased colony number of Prdx1−/−;ErbB−2/neuTMEFs by only 53%, whereas in Prdx1+/+;ErbB−2/neuTMEFs by 75%. Moreover, 25 μM Ly decreased colony formation equally in Prdx1−/−;ErbB−2/neuTMEFs and Prdx1+/+;ErbB−2/neuTMEFs to 4–5%. Figure 5.(A) PTEN−/−MEFs were serum starved for 48 h and treated with H2O2 as indicated for 10 min. Protein lysates were analysed for pAktSer473 as described before. (B) PTEN−/−MEFs were infected with retrovirus expressing GFP–PTEN. After 5-day selection in puromycin (2 μg/ml), MEFs were serum starved, exposed for 10 min to H2O2 and analysed for Prdx1 oxidation and formation of dimeric structures by non-reducing SDS–PAGE. *Prdx1 hetero-dimer formation with other Prdxs. (C) PTEN−/−MEFs were infected with retrovirus expressing shPrdx1, GFP–PTEN, H-RasV12 or various vectors carrying resistance gene only (pBabe, pMKO1). MEFs were plated in soft agar. Colonies were counted after 21 days. *P<0.001 (Student's t-test). (D) As under C, except MEFs express ErbB-2/neuT instead of H-rasV12. **P<0.039 (Student's t-test). (E) Immunoblotting of MEFs from (C and D). Download figure Download PowerPoint Table 1. Prdx1−/−MEFs have a higher sensitivity to PI3K inhibitors in H-Ras or ErbB-2 induced transformation Wortmannin (nm) H-Ras colony number in % Ly294002

The insulin/IGF-1 (insulin-like growth factor 1)-activated protein kinase Akt (also known as protein kinase B) phosphorylates Ser487 in the ‘ST loop’ (serine/threonine-rich loop) within the C-terminal domain of AMPK-α1 (AMP-activated protein kinase-α1), leading to inhibition of phosphorylation by upstream kinases at the activating site, Thr172. Surprisingly, the equivalent site on AMPK-α2, Ser491, is not an Akt target and is modified instead by autophosphorylation. Stimulation of HEK (human embryonic kidney)-293 cells with IGF-1 caused reduced subsequent Thr172 phosphorylation and activation of AMPK-α1 in response to the activator A769662 and the Ca2+ ionophore A23187, effects we show to be dependent on Akt activation and Ser487 phosphorylation. Consistent with this, in three PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)-null tumour cell lines (in which the lipid phosphatase PTEN that normally restrains the Akt pathway is absent and Akt is thus hyperactivated), AMPK was resistant to activation by A769662. However, full AMPK activation could be restored by pharmacological inhibition of Akt, or by re-expression of active PTEN. We also show that inhibition of Thr172 phosphorylation is due to interaction of the phosphorylated ST loop with basic side chains within the αC-helix of the kinase domain. Our findings reveal that a previously unrecognized effect of hyperactivation of Akt in tumour cells is to restrain activation of the LKB1 (liver kinase B1)–AMPK pathway, which would otherwise inhibit cell growth and proliferation.

With the discovery of an isoform based on an alternative translation start site, PTEN nomenclature needs an update.

Engineering 3D tissue-like constructs for applications such as regenerative medicine remains a major challenge in biomedical research. Recently, self-healing, viscoplastic fluids have been introduced as suspension media to allow lower viscosity, water-rich bioinks to be printed within them for the fabrication of more biomimetic structures. Here, we present gellan gum granular gels produced through the application of shear during gelation, as a candidate suspension medium. We demonstrate that these granular gels exhibit viscoplasticity over a wide range of temperatures, permitting their use for 3D bioprinting of filaments and droplets at low (4°C) as well as physiological temperatures. These granular gels exhibit very low yield stresses (down to 0.4 Pa) which facilitated printing at print speeds up to 60 mm . s -1 . Furthermore, we demonstrate the printing of cell-laden droplets maintained over 7 days to show the potential for multiple days of cell culture, as well as the fabrication of hydrogel features within a crosslinkable version of the suspension medium containing granular gellan gum and gelatine-methacryloyl. The combination of ease of preparation, high printing speed, wide temperature tolerance, and crosslinkability makes this gellan gum sheared through cooling-induced gelation an attractive candidate for suspended biofabrication.