In cells, RNA polymerase (RNAP) must transcribe supercoiled DNA, whose torsional state is constantly changing, but how RNAP deals with DNA supercoiling remains elusive. We report direct measurements of individual Escherichia coli RNAPs as they transcribed supercoiled DNA. We found that a resisting torque slowed RNAP and increased its pause frequency and duration. RNAP was able to generate 11 ± 4 piconewton-nanometers (mean ± standard deviation) of torque before stalling, an amount sufficient to melt DNA of arbitrary sequence and establish RNAP as a more potent torsional motor than previously known. A stalled RNAP was able to resume transcription upon torque relaxation, and transcribing RNAP was resilient to transient torque fluctuations. These results provide a quantitative framework for understanding how dynamic modification of DNA supercoiling regulates transcription.

Using a custom spectroscopic single-molecule fluorescence (sSMF) instrument, three rhodamine species were distinguished within a single sample with RhB-2 exhibiting superior photostability.

The biological activity of tRNA is closely related to its mechanical folding properties. Although previous studies focused on the folding and unfolding mechanism of tRNA, its kinetics are largely unknown. In this study, combining optical tweezers and molecule dynamics simulations, we characterized the mechanical folding and unfolding processes of a single unmodified Saccharomyces cerevisiae tRNA phe . We identified the intermediates and pathways for tRNA mechanical folding and unfolding in the presence of Mg 2+ , discovering that the folding/unfolding kinetics of D stem-loop and T stem-loop but not the anti-codon stem-loop significantly affected by their upstream and downstream structures. The cooperative unfolding of the tRNA in the presence of Mg 2+ lead to a large hysteresis between the folding and unfolding pathway, and such hysteresis and unfolding cooperativity are significantly reduced by lowering the Mg 2+ concentration or mutating the nucleotides forming the 'elbow' structure. Moreover, both steered molecular dynamics simulation and optical tweezers experiment results support that, formation of tertiary interactions in the elbow region increases energy barriers of the mechanical unfolding pathway, including those in between intermediates, and determines the overall unfolding cooperativity. Our studies may shed light on the detailed tRNA chaperone mechanism of TruB and TrmA.

e15013 Background: Next-generation sequencing (NGS) can produce up to 6 Tb of data per run with single-nucleotide accuracy, making it ideal for quantifying isomiRs, which encompass both canonical miRNAs and their variants, for clinical applications. However, NGS has poor reproducibility and low sample throughput in quantifying circulating isomiRs due to significant technical variations and the limitations of the multiplex strategy, as evidenced by the fact that no isomiR NGS technique has been successfully used to diagnose cancer. Methods: To address these challenges, a library construction method including a dual unique-dual-index (DUDI) technology was developed. DUDI uses a pair of Inner UDI (IUDI) and outer UDI (OUDI) to label a sample. Twelve independent batches of isomiR NGS were carried out, including three repeated batches. Each batch included 100 gastric cancer and 100 control plasma samples. Batch effect, correlation coefficient (R), and principal component (PCA) analyses were used to evaluate technical reproducibility. Machine learning binary classification was used to assess biological reproducibility, with each pair of batch data serving interchangeably as both training and testing data. Results: In this multicenter study, over 700G of isomiR data were generated from 402 gastric cancer and 498 control samples, with a maximum error rate of 1 in 7 million isomiRs being assigned to wrong samples. The PCA plot indicates high technical reproducibility across the three repeated batches, shown by the extensive intermingling of data points from each batch and the lack of distinct batch-wise clustering. This observation is reinforced by that the R value for each of 239 isomiRs between the repeated batches are close to 1. While the mutual machine learning validations between the repeated batches yielded ~95% accuracy, indicating high biological reproducibility. The accuracies of the validations between the different batches of different samples range from 70% to 82%. The lower accuracy is as expected, given the high genetic heterogeneity of cancer and the small sample size. Furthermore, the IsomiR differentiated expression profiles from the current NGS study closely match those from prior qPCR studies. Conclusions: The DUDI library construction method can produce reproducible high sample throughput NGS data, yet it is cost-effective and straightforward. The maximum number of samples that can be multiplexed in an NGS project is almost one million, i.e., 976 * 976, as IUDI and OUDI can be any of the 976 designed DUDIs. This number far exceeds the high sample throughput requirements of any NGS application. While the capability to distinguish true biological variations of IsomiRs from technical noise, demonstrated by the high technical and biological reproducibility and concordance with the qPCR data, enables the development of robust machine learning algorithms for cancer diagnostics.

During transcription, RNA polymerase (RNAP) supercoils DNA as it forward-translocates. Accumulation of this torsional stress in DNA can become a roadblock for an elongating RNAP and thus should be subject to regulation during transcription. Here, we investigate whether, and how, a transcription factor may regulate the torque generation capacity of RNAP and torque-induced RNAP stalling. Using a real-time assay based on an angular optical trap, we found that under a resisting torque, RNAP was highly prone to extensive backtracking. However, the presence of GreB, a transcription factor that facilitates the cleavage of the 3′ end of the extruded RNA transcript, greatly suppressed backtracking and remarkably increased the torque that RNAP was able to generate by 65%, from 11.2 to 18.5 pNnm. Analysis of the real-time trajectories of RNAP position at a stall revealed the kinetic parameters of backtracking and GreB rescue. These results demonstrate that backtracking is the primary mechanism that limits transcription against DNA supercoiling and the transcription factor GreB effectively enhances the torsional capacity of RNAP. These findings broaden the potential impact of transcription factors on RNAP functionality.

An attenuation of visible probe radiation identified in earlier absorption studies of microwave plasma-activated CH

Oxygen scavenging systems (OSSs) are critical for dye stability in single-molecule fluorescence (SMF) experiments. However, the commonly used protocatechuic acid (PCA)/protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) OSS alters DNA mechanical properties, limiting its applicability....