ABSTRACT The densely glycosylated spike (S) proteins that are highly exposed on the surface of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) facilitate viral attachment, entry, and membrane fusion. We have previously reported all the 22 N -glycosites and site-specific N -glycans in the S protein protomer. Herein, we report the comprehensive and precise site-specific O-glycosylation landscapes of SARS-CoV-2 S proteins, which were characterized using high-resolution mass spectrometry. Following digestion using trypsin and trypsin/Glu-C, and de-N-glycosylation using PNGase F, we determined the mucin-type (GalNAc-type) O-glycosylation pattern of S proteins, including unambiguous O -glycosites and the 6 most common O -glycans occupying them, via Byonic identification and manual validation. Finally, 43 O -glycosites were identified in the insect cell-expressed S protein. Most glycosites were modified by non-sialylated O -glycans such as HexNAc(1) and HexNAc(1)Hex(1). In contrast, 30 O -glycosites were identified in the human cell-expressed S protein S1 subunit. Most glycosites were modified by sialylated O -glycans such as HexNAc(1)Hex(1)NeuAc(1) and HexNAc(1)Hex(1)NeuAc(2). Our results are the first to reveal that the SARS-CoV-2 S protein is a mucin-type glycoprotein; clustered O -glycans often occur in the N- and the C-termini of the S protein, and the O -glycosite and O -glycan compositions vary with the host cell type. These site-specific O-glycosylation landscapes of the SARS-CoV-2 S protein are expected to provide novel insights into the viral binding mechanism and present a strategy for the development of vaccines and targeted drugs.

Hepatocyte transplantation and bioartificial liver (BAL) systems hold significant promise as less invasive alternatives to traditional transplantation, providing crucial temporary support for patients with acute and chronic liver failure. Although human hepatocytes are ideal, their use is limited by ethical concerns and donor availability, leading to the use of porcine hepatocytes in BAL systems due to their functional similarities. Recent advancements in gene-editing technology have improved porcine organ xenotransplantation clinical trials by addressing immune rejection issues. Gene-edited pigs, such as alpha-1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knockout pigs, offer a secure source of primary cells for BAL systems. Our research focuses on optimizing the safety and functionality of porcine primary hepatocytes during large-scale cultivation. We achieved this by creating GGTA1 knockout pigs through one-step delivery of CRISPR/Cas9 to pig zygotes via oviduct injection of rAAV, and enhancing hepatocyte viability and function by co-culturing hepatocytes with Roof plate-specific spondin 1 overexpressing HUVECs (R-HUVECs). Using a Rocker culture system, approximately 10

The glycoprotein spike (S) on the surface of SARS-CoV-2 is a determinant for viral invasion and host immune response. Herein, we characterized the site-specific N-glycosylation of S protein at the level of intact glycopeptides. All 22 potential N-glycosites were identified in the S-protein protomer and were found to be preserved among the 753 SARS-CoV-2 genome sequences. The glycosite occupancy by different glycoforms exhibited remarkable heterogeneity in human cell-expressed protein subunits, including up to 157 N-glycans, mainly of the complex type. In contrast, the insect cell-expressed S protein contained 38 N-glycans, primarily of the high-mannose type. Our results revealed that the glycan types were highly determined by the differential processing of N-glycans among human and insect cells. This N-glycosylation landscape and the differential N-glycan patterns among distinct host cells are expected to shed light on the infection mechanism and present a positive view for the development of vaccines and targeted drugs.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract Necroptosis and pyroptosis are lytic and inflammatory types of programmed cell death that require the membrane destruction predominantly driven by the mixed lineage kinase domain-like (MLKL) and gasdermin D (GSDMD) proteins, respectively. However, the crosstalk between them remains largely unknown. Here, our research discloses that endoplasmic reticulumn transmembrane protein inositol-requiring enzyme-1α (IRE-1α) is a potential modulator of both necroptosis and pyroptosis, paricularly in liver pathology. Interestingly, enhanced expression of IRE-1α triggers hepatic pyroptosis, while defective IRE-1α level activates hepatic necroptosis, and both processes are closed related to the activity of GSDMD in mice. To elucidate unknown crosstalk, by using pharmacological and genetic methods, we first demonstrated that IRE-1α suppresses necroptosis by promoting the expression of GSDMD and cleaves caspase-8 and by inhibiting the expression of receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1), RIPK3 and MLKL. Unexpectedly, excess IRE-1α initiates pyroptosis by increasing GSDMD and NLRP3 levels. Our work clearly provides insight into the modulation of IRE-1α to dominate necroptosis and pyroptosis and suggests that IRE-1α may be a promising therapeutic target for drug discovery in both types of tissue injuries.