During pseudoglandular stage of the human lung development the primitive bronchial buds are initially conformed by simple tubules lined by endoderm-derived epithelium surrounded by mesenchyme, which will progressively branch into airways and start to form distal epithelial saculles. For first time alveolar type II (AT2) pneumocytes appears. This study aims to characterize the genes and microRNAs involved in this differentiation process and decipher its role in the starting alveolar differentiation. Gene and microRNA profiling was performed in human embryonic lungs from 7 to 12 post conception weeks (pcw). Protein expression location of candidate genes were analyzed by immunofluorescense in embryonic lung tissue sections. mRNA/miRNA target pairs were identified using computational approaches and their expression was studied in purified epithelial/mesenchymal cell populations and in isolated tips and stalks from the bronchial tree. Additionally, silencing experiments in human embryonic lung mesenchymal cells and in human embryonic tip-derived lung organoids were performed, as well as organoid differentiation studies. AT2 cell markers were studied by qRT-PCR and by immunofluorescence. The TGFB-β phosphorylated pathways was analyzed with membrane protein arrays. Lung explants were cultured in air/liquid interface with/without peptides. We identified 88 differentially expressed genes, including IGFBP3. Although IGFBP3 mRNA was detected in both epithelial and mesenchymal populations, the protein was restricted to the epithelium, indicating post-transcriptional regulation preventing IGFBP3 protein expression in the mesenchyme. MicroRNA profiling identified miR-34a as an IGFBP3 regulator. miR-34a was up-regulated in mesenchymal cells, and its silencing in human embryonic lung mesenchymal cells increased IGFBP3 levels. Additionally, IGFBP3 expression showed a marked downregulation from 7 to 12 pcw, suggesting its involvement in the differentiation process. The differentiation of human tip-derived lung embryonic organoids showed a drastic reduction in IGFBP3, supported by the scRNAseq data. IGFBP3 silencing in organoids activated an alveolar-like differentiation process characterized by stem cell markers downregulation and upregulation of AT2 markers. This process was mediated by TGFβ signalling inhibition and BMP pathway activation. The IGFBP3/miR-34a axis restricts IGFBP3 expression in the embryonic undifferentiated lung epithelium, and the progressive downregulation of IGFBP3 during the pseudoglandular stage is required for alveolar differentiation.

Introduction Patient-derived organoids have emerged as a promising in vitro model for precision medicine, particularly in cancer, but also in non-cancer-related diseases. However, the optimal culture medium for culturing patient-derived lung organoids has not yet been agreed upon. This study aimed to shed light on the optimal selection of a culture media for developing studies using patient-derived lung organoids. Methods Tumor and normal paired tissue from 71 resected non-small cell lung cancer patients were processed for organoid culture. Lung cancer organoids (LCOs) were derived from tumor tissue and normal lung organoids (LNOs) from non-neoplastic lung tissue. Three different culture media were compared: Permissive culture medium (PCM); Limited culture medium (LCM); and Minimum basal medium (MBM). We assessed their effectiveness in establishing organoid cultures, promoting organoid growth and viability, and compared their differential phenotypic characteristics. Results While PCM was associated with the highest success rate and useful for long-term expansion, MBM was the best option to avoid normal organoid overgrowth in the organoid culture. The density, size, and viability of LNOs organoids were reduced using LCM and severely affected with MBM. LNOs cultured in PCM tend to differentiate to bronchospheres, while alveolosphere differentiation can be observed in those cultured with LCM. The morphological phenotype of LCO was influenced by the culture media of election. Mesenchymal cell overgrowth was observed when LCM was used. Conclusion This work highlights the importance of considering the research objectives when selecting the most suitable culture medium for growing patient-derived lung organoids.