Hyperacute rejection of porcine organs by old world primate recipients is mediated through preformed antibodies against galactosyl-α-1,3-galactose (Galα-1,3-Gal) epitopes expressed on the pig cell surface. Previously, we generated inbred miniature swine with a null allele of the α-1,3-galactosyltransferase locus ( GGTA1 ) by nuclear transfer (NT) with gene-targeted fibroblasts. To expedite the generation of GGTA1 null pigs, we selected spontaneous null mutant cells from fibroblast cultures of heterozygous animals for use in another round of NT. An unexpectedly high rate of spontaneous loss of GGTA1 function was observed, with the vast majority of null cells resulting from loss of the WT allele. Healthy piglets, hemizygous and homozygous for the gene-targeted allele, were produced by NT by using fibroblasts that had undergone deletional and crossover/gene conversion events, respectively. Aside from loss of Galα-1,3-Gal epitopes, there were no obvious phenotypic differences between these null piglets and WT piglets from the same inbred lines. In fact, congenital abnormalities observed in the heterozygous NT animals did not reappear in the serially produced null animals.

Abstract The nascent mRNA transcribed in the nucleus is cleaved and polyadenylated before it is transported to the cytoplasm for translation 1 . Polyadenylation can also occur in the cytoplasm for post-transcriptional regulation, especially in neurons, oocytes and early embryos 1,2 . Recently, we revealed transcriptome-wide maternal mRNA cytoplasmic re-polyadenylation during the mammalian oocyte-to-embryo transition (OET) 3-6 . However, the mechanism of re-polyadenylation during mammalian OET, including the sites to be re-polyadenylated and the enzymes involved, is still poorly understood. Here, by analyzing the PAIso-seq1 and PAIso-seq2 poly(A) inclusive transcriptome data during OET in mice, rats, pigs, and humans, we reveal conserved re-polyadenylation of mRNA degradation intermediates. These re-polyadenylated mRNA degradation intermediates account for over half of the polyadenylated mRNA during OET in all four species. We find that mRNA degradation intermediates for re-polyadenylation are generated through Btg4-mediated deadenylation in both mouse and human. Interestingly, the poly(A) tails on the re-polyadenylated mRNA degradation intermediates are of different lengths and contain different levels of non-A residues compared to regular polyadenylation sites, suggesting specific regulation and function of these poly(A) tails in mammalian OET. Together, our findings reveal the maternal mRNA degradation intermediates as substrates for conserved cytoplasmic dominant re-polyadenylation during mammalian OET, and uncover the mechanism of production of these mRNA degradation intermediates. These findings provide new insights into mRNA post-transcriptional regulation, and a new direction for the study of mammalian OET.

SUMMARY Poly(A) tail length and non-A residues are vital for oocyte-to-embryo transition (OET) in mice and humans 1–5 . However, the role of poly(A) tail length and non-A residues during OET in other commonly used mammalian animal models for human diseases remains unexplored. In addition, the degree of conservation in maternal mRNA poly(A) tail dynamics during OET across different mammal species is unknown. Here, we conduct a comparative analysis of the poly(A) tails during OET across four species: mice, rats, pigs, and humans. Dynamics during OET found to be conserved across all four species include: maternal mRNA deadenylation during oocyte maturation and re-polyadenylation after fertilization; a fall-rise trend in poly(A) tail length distribution; a rise-fall trend in the ratio of poly(A) tails with non-A residues; higher abundance of non-A residues in poly(A) tails of maternal mRNA than in zygotic genome activation (ZGA) mRNA; maternal mRNA with U residues degrades faster than those without U residues at the stage when ZGA takes place. While in mice and rats maternal mRNA deadenylation is impaired in parthenogenetic embryos and ZGA inhibition leads to blocked maternal mRNA deadenylation in mice and humans. In contrast, the length of consecutive U residues and the duration time of U residues in poly(A) tail diverges across the four species. Together, these findings reveal that the poly(A) tail mediated maternal mRNA post-transcriptional regulation is highly conserved in mammals with unique divergences in the length and life-span of U residues, providing new insights for the further understanding of OET across different mammals.

Abstract Metabolism feeds into the regulation of epigenetics via metabolic enzymes and metabolites. However, metabolic features, and their impact on epigenetic remodeling during mammalian pre-implantation development, remain poorly understood. In this study, we established the metabolic landscape of mouse pre-implantation embryos from zygote to blastocyst, and quantified some absolute carbohydrate metabolites. We integrated these data with transcriptomic and proteomic data, and discovered the metabolic characteristics of the development process, including the activation of methionine cycle from 8-cell embryo to blastocyst, high glutaminolysis metabolism at blastocyst stage, enhanced TCA cycle activity from the 8-cell embryo stage, and active glycolysis in the blastocyst. We further demonstrated that oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) synthesis is indispensable for mouse pre-implantation development. Mechanistically, in part, NAD + is required for the exit of minor zygotic gene activation (ZGA) by cooperating with SIRT1 to remove zygotic H3K27ac. In human, NAD + supplement can promote the removal of zygotic H3K27ac and benefit pre-implantation development. Our findings demonstrate that precise and timely regulation of minor ZGA is controlled by metabolic dynamics, and enhance our understanding of the metabolism of mammalian early embryos. Highlights We identified the metabolic features of mouse pre-implantation embryo development. NAD + synthesis is indispensable for mouse embryo pre-implantation development. NAD + -mediated erasure of zygotic H3K27ac is required for the exit of minor ZGA. NAD + supplement promotes the removal of zygotic H3K27ac and benefits preimplantation development of human embryos.

Abstract Mitochondria are responsible for producing a cell’s energy and play a central role in many metabolic tasks, as well as signaling transduction and cell death 1 . Mitochondria dysfunctions cause several human diseases and aging processes 2–8 . Mammalian oocytes contain far more mitochondria than somatic cells. The nuclear localization of mitochondrial tricarboxylic acid cycle (TCA) cycle enzymes, which normally localize in the mitochondria, is critical for zygotic genome activation (ZGA) and the oocyte-to-embryo transition (OET) in mice 9 . However, during the mammalian OET, the abundance and post-transcriptional regulation of mitochondrial mRNA (MT-mRNA), particularly the poly(A) tail, has never been studied. Here, we used two independent sequencing methods (PAIso-seq1 and PAIso-seq2) to describe the features of MT-mRNA in mouse cell lines, thirteen mouse tissues and during the OET in mouse, rat, pig, and humans. These features included expression abundance, poly(A) tail length, and non-A residues in poly(A) tails. Unlike nuclear mRNA, we discovered that MT-mRNA has a stable distribution pattern of poly(A) tail length in different cell lines, across tissues, and during mammalian OET. MT-mRNA possesses non-A residues in the poly(A) tail (non-A residues hereafter), which change slightly across tissues and during the OET. We also found that the abundance of MT-mRNA varies substantially across tissues, increases during the OET, and increases along major ZGA in mice, rats, pigs, and humans. These findings provide insights into changes in MT-mRNA abundance and poly(A) tail during the mammalian OET and provide a resource for future studies on the posttranscriptional regulation of mitochondrial transcripts.

Abstract As crucial phagocytes of the innate immune system, macrophages (M ϕ s) protect mammalian hosts, maintain tissue homeostasis and influence disease pathogenesis. Nonetheless, M ϕ s are susceptible to various pathogens, including bacteria, viruses and parasites, which cause various infectious diseases, necessitating a deeper understanding of pathogen–M ϕ interactions and therapeutic insights. Pluripotent stem cells (PSCs) have been efficiently differentiated into PSC‐derived M ϕ s (PSCdM ϕ s) resembling primary M ϕ s, advancing the modelling and cell therapy of infectious diseases. However, the mass production of PSCdM ϕ s, which lack proliferative capacity, relies on large‐scale expansions of PSCs, thereby increasing both costs and culture cycles. Notably, M ϕ s deficient in the MafB/c‐Maf genes have been reported to re‐enter the cell cycle with the stimulation of specific growth factor cocktails, turning into self‐renewing M ϕ s (SRM ϕ s). This review summarizes the applications of PSCdM ϕ s in the modelling and cell therapy of infectious diseases and strategies for establishing SRM ϕ s. Most importantly, we innovatively propose that PSCs can serve as a gene editing platform to creating PSC‐derived SRM ϕ s (termed PSRM ϕ s), addressing the resistance of M ϕ s against genetic manipulation. We discuss the challenges and possible solutions in creating PSRM ϕ s. In conclusion, this review provides novel insights into the development of physiologically relevant and expandable M ϕ models, highlighting the enormous potential of PSRM ϕ s as a promising avenue for the modelling and cell therapy of infectious diseases.

Abstract The zygotic genome activation (ZGA) is crucial for the development of pre-implantation embryos. Long noncoding RNAs (lncRNAs) play significant roles in many biological processes, but the study on their role in the early embryonic development of pigs is limited. In this study, we identify lncFKBPL as an enhancer-type lncRNA essential for pig embryo development. LncFKBPL is expressed from the 4-cell stage to the morula stage in pig embryos, and interference with lncFKBPL leads to a developmental arrest at the 8-cell stage. Mechanistic investigations uncover that lncFKBPL is able to bind to MED8, thereby mediating enhancer activity and regulating FKBPL expression. Additionally, FKBPL interacts with the molecular chaperone protein HSP90AA1, stabilizing CDK9 and boosting its protein-level expression. Elevated CDK9 levels enhance Pol II phosphorylation, facilitating ZGA. Our findings illuminate the role of lncFKBPL as an enhancer lncRNA in pig ZGA regulation and early embryo development, providing a foundation for further exploration in this area.