Plants have mechanisms to transport secondary metabolites from where they are biosynthesized to the sites where they function, or to sites such as the vacuole for detoxification. However, current research has mainly focused on metabolite biosynthesis and regulation, and little is known about their transport. Tanshinone, a class diterpenoid with medicinal properties, is biosynthesized in the periderm of Salvia miltiorrhiza roots. Here, we discovered that tanshinone can be transported out of peridermal cells and secreted into the soil environment and that the ABC transporter SmABCG1 is involved in the efflux of tanshinone ⅡA and tanshinone Ⅰ. The SmABCG1 gene is adjacent to the diterpene biosynthesis gene cluster in the S. miltiorrhiza genome. The temporal-spatial expression pattern of SmABCG1 is consistent with tanshinone accumulation profiles. SmABCG1 is located on the plasma membrane and preferentially accumulates in the peridermal cells of S. miltiorrhiza roots. Heterologous expression in Xenopus laevis oocytes demonstrated that SmABCG1 can export tanshinone ⅡA and tanshinone Ⅰ. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of SmABCG1 in S. miltiorrhiza hairy roots resulted in a significant decrease in tanshinone contents in both hairy roots and the culture medium, whereas overexpression of this gene resulted in increased tanshinone contents. CYP76AH3 transcript levels increased in hairy roots overexpressing SmABCG1 and decreased in knockout lines, suggesting that SmABCG1 may affect the expression of CYP76AH3, indirectly regulating tanshinone biosynthesis. Finally, tanshinone ⅡA showed cytotoxicity to Arabidopsis roots. These findings offer new perspectives on plant diterpenoid transport and provide a new genetic tool for metabolic engineering and synthetic biology research.

Summary Activity‐based sensing probes are powerful tools for monitoring enzymatic activities in complex biological samples such as cellular and live animals; however, their application in plants remains challenging. Herein, fourteen activity‐based fluorescent probes were assayed against Arabidopsis O ‐methyltransferases ( At OMTs). One probe, 3‐BTD, displayed a high selectivity, reactivity, and fluorescence response toward At OMTs especially the isoform At CCoAOMT. We further characterized the features of this probe and explored whether it could be used to detect OMT activities in living plant cells. Our results show that 3‐BTD can be used to visualize OMT activity in Arabidopsis , and no fluorescent signal was observed in the comt / ccoaomt double mutant, indicating that it has good specificity. Interestingly, in contrast to the observation that At CCoAOMT‐YFP accumulated in both cytoplasm and nucleus, OMT enzymatic activity tracked by 3‐BTD probe was found only in the cytoplasm. This underscores the importance of activity‐based sensing in studying protein function. Moreover, 3‐BTD can be successfully applied in OMT visualization of different plants. This study indicates that 3‐BTD can serve as a potential probe for in situ monitoring the real activity of OMT in multiple plants and provides a strategy for visualizing the activity of other enzymes in plants.