The glycoside hydrolase family 20 (GH20) predominantly features N‐acetylhexosaminidases (EC 3.2.1.52), with only few known lacto‐N‐biosidases (EC 3.2.1.140; LNBases). LNBases catalyze the degradation of lacto‐N‐tetraose (LNT), a prominent component of human milk oligosaccharides, thereby supporting a healthy infant gut microbiome development. We investigated GH20 diversity to discover novel enzymes that release disaccharides such as lacto‐N‐biose (LNB). Our approach combined peptide clustering, sequence analysis, and 3D structure model evaluation to assess active site topologies, focusing on the presence of a subsite ‐2. Five LNBases were active on pNP‐LNB and four showed activity on LNT. One enzyme displayed activity on both pNP‐LacNAc and pNP‐LNB, establishing the first report of N‐acetyllactosaminidase (LacNAcase) activity. Exploration of this enzyme cluster led to the identification of four additional enzymes sharing this dual substrate specificity. Comparing the determined crystal structure of a specific LNBase (TrpyGH20) and the first crystal structure of an enzyme with dual LacNAcase/LNBase activity (TrdeGH20) revealed a highly conserved subsite ‐1, common to GH20 enzymes, while the ‐2 subsites varied significantly. TrdeGH20 had a wider subsite ‐2, accommodating Gal with both β1,4‐ and β1,3‐linkages to the GlcNAc in subsite ‐1. Biotechnological applications of these enzymes may include structural elucidation of complex carbohydrates and glycoengineering.

The natural heterogeneity of guaiacyl (G) and syringyl (S) compounds resulting from lignin processing hampers their direct use as plant‐based chemicals and materials. Herein, we explore six short polyphenol oxidases (PPOs) from lignocellulose‐degrading ascomycetes for their capacity to react with G‐type and S‐type phenolic compounds. All six PPOs catalyze the ortho‐hydroxylation of G‐type compounds (guaiacol, vanillic acid, and ferulic acid), forming the corresponding methoxy‐ortho‐diphenols. Remarkably, a subset of these PPOs is also active towards S‐compounds (syringol, syringic acid, and sinapic acid) resulting in identical methoxy‐ortho‐diphenols. Assays with 18O2 demonstrate that these PPOs in particular catalyze ortho‐hydroxylation and ortho‐demethoxylation of S‐compounds and generate methanol as a co‐product. Notably, oxidative (ortho‐)demethoxylation of S‐compounds is a novel reaction for PPOs, which we propose occurs via a distinct reaction mechanism compared to aryl‐O‐demethylases. We further show that addition of a reducing agent can steer the PPO reaction to form methoxy‐ortho‐diphenols from both G‐ and S‐type substrates rather than reactive quinones that lead to unfavorable polymerization. Application of PPOs opens for new routes to reduce the heterogeneity and methoxylation degree of mixtures of G and S lignin‐derived compounds.

GH29A α-l-fucosidases (EC 3.2.1.51) catalyze the release of α-l-fucosyl moieties from the nonreducing end of glycoconjugates by hydrolysis and some also catalyze transglycosylation. The latter is particularly interesting with regard to designing enzymatic synthesis of human milk oligosaccharides (HMOs). We combined the bioinformatics tool conserved unique peptide patterns (CUPP) and phylogenetic clustering to discover new microbial GH29A α-l-fucosidases of the underexplored CUPP group GH29:13.1. Three uncharacterized bacterial enzymes (EaGH29, SeGH29, and PmGH29) and two previously identified GH29A α-l-fucosidases (BF3242 and TfFuc1) were selected for reaction optimization, biochemical, and structural characterization. Kinetics, pH-temperature optima, and substrate preference for 2-chloro-4-nitrophenyl-α-l-fucopyranoside (CNP-α-l-Fuc) and 2'-fucosyllactose (2'FL) were determined. Transglycosylation was favored at high neutral to alkaline pH, especially for EaGH29, SeGH29, TfFuc1, and BF3242, mainly because hydrolysis was decreased. The α-l-fucosidases exhibited medium regioselectivity in transglycosylation, generally forming two out of five detected lacto-N-fucopentaose (LNFP) isomers from 2'FL and lacto-N-tetraose (LNT). Alkaline pH also affected the transglycosylation product regioselectivity of SeGH29, which was also affected by a Leu/Phe exchange in the acceptor binding site. New crystal structures of TfFuc1 and BF3242 showed congruence in active site topology between these two enzymes and contributed to understanding the function of GH29A α-l-fucosidases. Notably, the structural data provide new insight into the role of an Asn residue located between the two catalytic residues in the active site.