The major determinant in the transcriptional control of class I genes of the major histocompatibility complex is an enhancer sequence located around −170 from the transcription start site, which binds a factor named KBF1. We have isolated a complementary cDNA coding for KBF1 and identified the DNA binding and dimerization domain of the protein. Because KBF1 and the transcription factor NF-κB bind to similar sequences, we investigated the relationship between these two molecules. It appeared that KBF1 is, by all criteria used, identical to the 50 kd DNA binding subunit of NF-κB. KBF1 (and therefore p50) also displays extensive amino acid sequence homology with the v-rel oncogene and the Drosophila maternal morphogen dorsal. In vitro experiments suggest functional homologies between KBF1 and v-rel.

Pilocytic astrocytoma, the most common childhood brain tumor, is typically associated with mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway alterations. Surgically inaccessible midline tumors are therapeutically challenging, showing sustained tendency for progression and often becoming a chronic disease with substantial morbidities. Here we describe whole-genome sequencing of 96 pilocytic astrocytomas, with matched RNA sequencing (n = 73), conducted by the International Cancer Genome Consortium (ICGC) PedBrain Tumor Project. We identified recurrent activating mutations in FGFR1 and PTPN11 and new NTRK2 fusion genes in non-cerebellar tumors. New BRAF-activating changes were also observed. MAPK pathway alterations affected all tumors analyzed, with no other significant mutations identified, indicating that pilocytic astrocytoma is predominantly a single-pathway disease. Notably, we identified the same FGFR1 mutations in a subset of H3F3A-mutated pediatric glioblastoma with additional alterations in the NF1 gene. Our findings thus identify new potential therapeutic targets in distinct subsets of pilocytic astrocytoma and childhood glioblastoma.

Smoothened (SMO) inhibitors recently entered clinical trials for sonic-hedgehog-driven medulloblastoma (SHH-MB). Clinical response is highly variable. To understand the mechanism(s) of primary resistance and identify pathways cooperating with aberrant SHH signaling, we sequenced and profiled a large cohort of SHH-MBs (n = 133). SHH pathway mutations involved PTCH1 (across all age groups), SUFU (infants, including germline), and SMO (adults). Children >3 years old harbored an excess of downstream MYCN and GLI2 amplifications and frequent TP53 mutations, often in the germline, all of which were rare in infants and adults. Functional assays in different SHH-MB xenograft models demonstrated that SHH-MBs harboring a PTCH1 mutation were responsive to SMO inhibition, whereas tumors harboring an SUFU mutation or MYCN amplification were primarily resistant.

Tumors are unorganized organs that contain many different cell types. In the recent years, many studies have reported that primary tumors contain fibroblasts/myofibroblasts (carcinoma-associated fibroblasts), mesenchymal cells such as pericytes/mural cells and other vascular smooth muscle cells. Several different markers are used routinely to identify carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) such as alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA), vimentin, S100A4 protein/fibroblast specific protein-1 (FSP1) and type I collagen. Likewise markers such as platelet derived growth factor receptor-beta (PDGFRbeta) and NG2 chondroitin sulfate proteoglycan (NG2) are used to identify mesenchymal cells such as pericytes and other vasculature associated smooth muscle cells. It is still unknown whether these markers overlap with each other or identify a unique population of cells within the tumor microenvironment. Therefore in the present study we utilized two different mouse models of cancer, the Rip1Tag2 mice that develop progressive pancreatic cancer and an orthotopic 4T1 breast cancer model, to study the overlap between six different mesenchymal markers commonly used in mouse cancer research. Our study demonstrates that among all the markers, S100A4/FSP1 identifies a unique population of fibroblasts with minimal overlap with markers for alphaSMA, PDGFRbeta and NG2. Vimentin and type I collagen are not specific markers for fibroblasts in these tumors. alphaSMA, PDGFRbeta and NG2 significantly overlap with each other in identifying a mixed population of fibroblasts (activated or resting), myofibroblasts, pericytes and vascular smooth muscle cells. Collectively, this study demonstrates that tumor microenvironment associated fibroblasts are a heterogeneous population and thus, the use of alphaSMA or vimentin as the only markers will not identify all the CAFs.

The vast majority of brain tumors in adults exhibit glial characteristics. Brain tumors in children are diverse: Many have neuronal characteristics, whereas others have glial features. Here we show that activation of the G i protein-coupled receptor CXCR4 is critical for the growth of both malignant neuronal and glial tumors. Systemic administration of CXCR4 antagonist AMD 3100 inhibits growth of intracranial glioblastoma and medulloblastoma xenografts by increasing apoptosis and decreasing the proliferation of tumor cells. This reflects the ability of AMD 3100 to reduce the activation of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 and Akt, all of which are pathways downstream of CXCR4 that promote survival, proliferation, and migration. These studies ( i ) demonstrate that CXCR4 is critical to the progression of diverse brain malignances and ( ii ) provide a scientific rationale for clinical evaluation of AMD 3100 in treating both adults and children with malignant brain tumors.

Vertebrate hematopoietic stem cells are derived from vental mesoderm, which is postulated to migrate to both extra- and intraembryonic positions during gastrula and neurula stages. Extraembryonic migration has previously been documented, but the origin and migration of intraembryonic hematopoietic cells have not been visualized. The zebrafish and most other teleosts do not form yolk sac blood islands during early embryogenesis, but instead hematopoiesis occurs solely in a dorsal location known as the intermediate cell mass (IM) or Oellacher. In this report, we have isolated cDNAs encoding zebrafish homologs of the hematopoietic transcription factors GATA-1 and GATA-2 and have used these markers to determine that the IM is formed from mesodermal cells in a posterior-lateral position on the yolk syncytial layer of the gastrula yolk sac. Surprisingly, cells of the IM then migrate anteriorly through most of the body length prior to the onset of active circulation and exit onto the yolk sac. These findings support a hypothesis in which the hematopoietic program of vertebrates is established by variations in homologous migration pathways of extra- and intraembryonic progenitors.

The cellular composition of H3K27M gliomas Diffuse midline gliomas with histone H3 lysine27-to-methionine mutations (H3K27M-glioma) are an aggressive type of childhood cancer with few options for treatment. Filbin et al. used a single-cell sequencing approach to study the oncogenic programs, genetics, and cellular hierarchies of H3K27M-glioma. Tumors were mainly composed of cells resembling oligodendrocyte precursor cells, whereas differentiated malignant cells were a smaller fraction. In comparison with other gliomas, these cancers had distinct oncogenic programs and stem cell–like profiles that contributed to their stable tumor-propagating potential. The analysis also identified a lineage-specific marker that may be useful in developing therapies. Science , this issue p. 331

There are about 2.5 million glomeruli in the kidneys each consisting of a barrel of glomerular basement membrane surrounded by glomerular endothelial cells on the inside and glomerular epithelial cells with established foot processes (podocytes) on the outside. Defects in this filtration apparatus lead to glomerular vascular leak or proteinuria. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the regulation of glomerular vascular permeability is still unclear. Recent studies indicate that patients receiving anti-VEGF antibody therapy may have an increased incidence of proteinuria. In a different setting, pregnancies complicated by preeclampsia are associated with elevated soluble VEGF receptor 1 protein (sFlt-1), endothelial cell dysfunction and proteinuria. These studies suggest that neutralization of physiologic levels of VEGF, a key endothelial survival factor, may lead to proteinuria. In the present study, we evaluated the potential of anti-VEGF neutralizing antibodies and sFlt-1 in the induction of proteinuria. Our studies demonstrate that anti-VEGF antibodies and sFlt-1 cause rapid glomerular endothelial cell detachment and hypertrophy, in association with down-regulation of nephrin, a key epithelial protein in the glomerular filtration apparatus. These studies suggest that down-regulation or neutralization of circulating VEGF may play an important role in the induction of proteinuria in various kidney diseases, some forms of cancer therapy and also in women with preeclampsia. There are about 2.5 million glomeruli in the kidneys each consisting of a barrel of glomerular basement membrane surrounded by glomerular endothelial cells on the inside and glomerular epithelial cells with established foot processes (podocytes) on the outside. Defects in this filtration apparatus lead to glomerular vascular leak or proteinuria. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the regulation of glomerular vascular permeability is still unclear. Recent studies indicate that patients receiving anti-VEGF antibody therapy may have an increased incidence of proteinuria. In a different setting, pregnancies complicated by preeclampsia are associated with elevated soluble VEGF receptor 1 protein (sFlt-1), endothelial cell dysfunction and proteinuria. These studies suggest that neutralization of physiologic levels of VEGF, a key endothelial survival factor, may lead to proteinuria. In the present study, we evaluated the potential of anti-VEGF neutralizing antibodies and sFlt-1 in the induction of proteinuria. Our studies demonstrate that anti-VEGF antibodies and sFlt-1 cause rapid glomerular endothelial cell detachment and hypertrophy, in association with down-regulation of nephrin, a key epithelial protein in the glomerular filtration apparatus. These studies suggest that down-regulation or neutralization of circulating VEGF may play an important role in the induction of proteinuria in various kidney diseases, some forms of cancer therapy and also in women with preeclampsia. vascular endothelial growth factor antibody enzyme-linked immunosorbent assay glomerular basement membrane phosphate-buffered saline soluble vascular endothelial growth factor receptor 1 Vascular endothelial growth factor is a 43–46-kDa glycoprotein that serves as a key survival factor for vascular endothelium (1Ferrara N. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2: 795-803Crossref PubMed Scopus (1277) Google Scholar, 2Watanabe Y. Dvorak H.F. Exp. Cell Res. 1997; 233: 340-349Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 3Alon T. Hemo I. Itin A. Pe'er J. Stone J. Keshet E. Nat. Med. 1995; 1: 1024-1028Crossref PubMed Scopus (1417) Google Scholar, 4Ferrara N. Houck K. Jakeman L. Leung D.W. Endocr. Rev. 1992; 13: 18-32Crossref PubMed Scopus (1554) Google Scholar). Several splice variants of human VEGF1 have been reported to exist, and VEGF165 along with VEGF121 are key circulating forms (5Tischer E. Mitchell R. Hartman T. Silva M. Gospodarowicz D. Fiddes J.C. Abraham J.A. J. Biol. Chem. 1991; 266: 11947-11954Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 6Ferrara N. Houck K.A. Jakeman L.B. Winer J. Leung D.W. J. Cell. Biochem. 1991; 47: 211-218Crossref PubMed Scopus (539) Google Scholar, 7Brown L.F. Detmar M. Claffey K. Nagy J.A. Feng D. Dvorak A.M. Dvorak H.F. Exs. 1997; 79: 233-269PubMed Google Scholar). Physiological levels of VEGF in the serum are considered pivotal for maintaining vascular endothelial cell homeostasis (8Gerber H.P. Hillan K.J. Ryan A.M. Kowalski J. Keller G.A. Rangell L. Wright B.D. Radtke F. Aguet M. Ferrara N. Development (Camb.). 1999; 126: 1149-1159Crossref PubMed Google Scholar, 9Ferrara N. Kidney Int. 1999; 56: 794-814Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (660) Google Scholar, 10Wong A.K. Alfert M. Castrillon D.H. Shen Q. Holash J. Yancopoulos G.D. Chin L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 7481-7486Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). The importance of VEGF is further illustrated by the fact the deletion of even a single allele of VEGF in mice leads to embryonic lethality (11Carmeliet P. Ferreira V. Breier G. Pollefeyt S. Kieckens L. Gertsenstein M. Fahrig M. Vandenhoeck A. Harpal K. Eberhardt C. Declercq C. Pawling J. Moons L. Collen D. Risau W. Nagy A. Nature. 1996; 380: 435-439Crossref PubMed Scopus (3459) Google Scholar). While the importance of VEGF as a survival factor for vascular endothelium is well appreciated, its role in the regulation of kidney glomerular vascular endothelium behavior is poorly understood. Some studies have suggested that VEGF expression is reduced during renal injury (12Fan L. Wakayama T. Yokoyama S. Amano O. Iseki S. Nephron. 2002; 90: 95-102Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar, 13Honkanen E.O. Teppo A.M. Gronhagen-Riska C. Kidney Int. 2000; 57: 2343-2349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (47) Google Scholar, 14Kang D.H. Joly A.H. Oh S.W. Hugo C. Kerjaschki D. Gordon K.L. Mazzali M. Jefferson J.A. Hughes J. Madsen K.M. Schreiner G.F. Johnson R.J. J. Am. Soc. Nephrol. 2001; 12: 1434-1447PubMed Google Scholar) and supplementing the injured kidney with exogenous VEGF121 was shown to provide some improvement in renal function and histology (15Kang D.H. Hughes J. Mazzali M. Schreiner G.F. Johnson R.J. J. Am. Soc. Nephrol. 2001; 12: 1448-1457PubMed Google Scholar). Preeclampsia is also associated with proteinuria, hypertension, and endothelial cell dysfunction (16Pridjian G. Puschett J.B. Obstet. Gynecol. Surv. 2002; 57: 598-618Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 17Roberts J.M. Cooper D.W. Lancet. 2001; 357: 53-56Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1066) Google Scholar, 18Roberts J.M. Taylor R.N. Musci T.J. Rodgers G.M. Hubel C.A. McLaughlin M.K. Am. J. Obstet. Gynecol. 1989; 161: 1200-1204Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1668) Google Scholar). In this regard, Vuorela et al. (19Vuorela-Vepsalainen P. Alfthan H. Orpana A. Alitalo K. Stenman U.H. Halmesmaki E. Hum. Reprod. 1999; 14: 1346-1351Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar) demonstrate that VEGF is bound by a circulating serum protein in the amniotic fluid and maternal serum. Later, the same group demonstrates that soluble VEGF receptor 1 protein (sFlt-1) is significantly elevated in the amniotic fluid of peeclamptic women, again suggesting a pathogenic significance for the decrease of VEGF levels in the serum and amniotic fluid in this condition (20Vuorela P. Helske S. Hornig C. Alitalo K. Weich H. Halmesmaki E. Obstet. Gynecol. 2000; 95: 353-357Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar). In a related study, Zhou et al. (21Zhou Y. McMaster M. Woo K. Janatpour M. Perry J. Karpanen T. Alitalo K. Damsky C. Fisher S.J. Am. J. Pathol. 2002; 160: 1405-1423Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (536) Google Scholar) demonstrate that cytotrophoblasts from placentas of women whose pregnancies were complicated by preeclampsia produce higher levels of sFlt-1 in vitro as compared with control cells. Such separate studies collectively suggest a causal connection between proteinuria/hypertension and endothelial cell dysfunction, mediated by sFlt-1. The significance of physiological circulating levels of VEGF in the regulation of glomerular vascular leak or proteinuria is important to evaluate as anti-VEGF antibody therapy, and VEGF receptor antagonists are being used in several clinical cancer trials (www.nci.nih.gov). In this regard, recent reports from Phase I and Phase II human clinical cancer trials using anti-VEGF antibodies (Bevacizumab) suggest that proteinuria was associated with this treatment protocol (22Kabbinavar F. Hurwitz H.I. Fehrenbacher L. Meropol N.J. Novotny W.F. Lieberman G. Griffing S. Bergsland E. J. Clin. Oncol. 2003; 21: 60-65Crossref PubMed Scopus (1582) Google Scholar). These results suggest that anti-VEGF antibodies may induce proteinuria. In the present study we evaluated the capacity of anti-mouse VEGF neutralizing antibodies and sFlt-1 to induce proteinuria. Our results indicate that a single intravenous infusion of anti-VEGF antibodies into normal healthy mice results in excessive albumin excretion in the urine (proteinuria) via massive glomerular endothelial cell detachment/damage and suppression of the glomerular epithelial slit diaphragm apparatus-associated protein, nephrin. Thus we propose that circulating physiological levels of VEGF are important for the proper function and survival of glomerular endothelial cells and appropriate filtration of blood in the kidney glomeruli. Additionally, these results suggest that long term proteinuria may be a significant side effect of chronic anti-VEGF therapy. Anti-VEGF antibody and sFlt-1 bolus injection studies were performed in wild-type CD1 mice. Each mice were injected with a single intravenous injection of anti-VEGF antibody or sFlt-1/Fc at a concentration of 3.25 and 32.5 pm (picomole per liter). This concentration corresponds to equivalent molar concentration to that of 65 pg/ml (3.25 pm) of normal plasma VEGF (1:1 ratio) and 10 times molar excess to that of 65 pg/ml (3.25 pm) of normal plasma VEGF concentration (1:10 ratio). Mouse anti-VEGF antibody (IgG1) and sFlt-1/Fc chimera were purchased from NeoMarkers (Fremont, CA) and R&D Systems (Minneapolis, MN), respectively. For the in vivo inhibition experiments, human recombinant VEGF165 was injected at a concentration of 32.5 pm to counteract the anti-VEGF antibodies injected at the same concentration. Since timed urine collection was essential to assess protienuria, we used 10 μg of furosemide in 200 μl of PBS for injection after the infusion of anti-VEGF antibodies or sFlt-1. Mice injected with control IgG1 served a control. One-hundred microliters of urine was collected 0, 1, 3, 5, and 24 h after the initial injection. Injections of furosemide were repeated every 1 h before the collection of the urine. Albumin and creatinine concentrations in the urine were estimated using a colorimetric assay according to the manufacturer's recommendations (Sigma). Urine albumin excretion was estimated as the quotient of urine albumin and urine creatinine (23Kristal B. Shasha S.M. Labin L. Cohen A. Am. J. Nephrol. 1988; 8: 198-203Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar). For these experiments, five mice per each group were used. Some mice were sacrificed 5 h after to collect kidneys for immunohistochemistry. The entire experiment was repeated three times. Immunofluorescence staining was performed as described previously (24Hamano Y. Grunkemeyer J.A. Sudhakar A. Zeisberg M. Cosgrove D. Morello R. Lee B. Sugimoto H. Kalluri R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 31154-31162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar). Briefly, 4-μm cryosections were fixed in acetone (−20 °C) for 3 min and dried at room temperature. After incubation with primary antibodies to nephrin, CD2AP, podocin, and α-actinin-4 for 2 h at room temperature, the sections were washed three times with PBS and incubated with fluorescein isothiocyanate-labeled secondary antibodies. After washing with PBS the sections were covered with glass slips using Vectashield mounting media (Vector Laboratories, Burlingame, CA). The staining was analyzed using a fluorescence microscope Eclipse TE300 (Nikon, Tokyo, Japan). Antibodies to nephrin, CD2AP, podocin, and α-actinin-4 were reported by our laboratory in a previous publication (24Hamano Y. Grunkemeyer J.A. Sudhakar A. Zeisberg M. Cosgrove D. Morello R. Lee B. Sugimoto H. Kalluri R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 31154-31162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar). Equal weights of cortical portions of kidneys from each groups were homogenized in liquid nitrogen and they were solubilized in the lysis buffer (0.05 m Hepes, pH 7.5, 0.01 m CaCl2, 4 mmN-ethylmaleimide, 5 mm benzamidine HCl, 1 mm phenylmethanesulfonyl fluoride, and 25 mmε-aminohexanoic acid). The lysates were dialyzed with PBS and electrophoresed on a 10% SDS-polyacrylamide gel. Immunoblots were blocked with 5% skim milk-containing TBST buffer (0.1% Tween 20, 20 mm Tris, pH 7.6, 140 mm NaCl). Western blotting was performed by incubating with indicated antibodies in TBST buffer followed by secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase and then developed by ECL kit as an enhanced chemiluminescence system (Amersham Biosciences). Transmission electron microscopy was performed as described previously (25Cosgrove D. Rodgers K. Meehan D. Miller C. Bovard K. Gilroy A. Gardner H. Kotelianski V. Gotwals P. Amatucci A. Kalluri R. Am. J. Pathol. 2000; 157: 1649-1659Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (167) Google Scholar). Analysis of variance was used to determine statistical differences. As needed, further analysis was carried out using t test with Bonferroni correction to identify significant differences. A p value <0.05 was considered statistically significant. Circulating physiological levels of free VEGF in the normal mouse plasma (VEGF164 and VEGF120) is about 65 pg/ml (3.25 pm) as determined by ELISA (data not shown). We used neutralizing mouse anti-VEGF antibodies at two different concentrations, equivalent molar amount to the free serum VEGF in normal mice according to our measurement (3.25 pm) and also 10-fold molar excess (32.5 pm), to evaluate their capacity to induce proteinuria (as measured by albumin content in the urine). The amount of protein in the urine was estimated as the ratio of urine protein to urine creatinine (Fig. 1). Our results indicate that starting 3 h after the intravenous injection of anti-VEGF antibody, the mice develop significant proteinuria and maintain the same level of proteinuria for next 7 h and gradually after 24 h the albumin content in the urine returns to normal levels (Fig. 1A; data not shown). The amount of proteinuria in mice with 1:1, VEGF:anti-VEGF antibody ratio (1:1 ratio), is less compared with 1:10 ratio (Fig. 1A). The likely explanation for this is the potential lack of sensitivity on part of the ELISA assay to detect all of the circulating VEGF in the plasma. Nevertheless, these experiments suggest that very low amounts of anti-VEGF antibody (3.25 pm) can induce proteinuria. To further establish the specificity of this antibody, we performed the antibody infusion (1:10 ratio) experiments in conjunction with infusion of equivalent molar amounts of exogenous human VEGF165(32.5 pm). Such experiments show that human VEGF165 can inhibit proteinuria inducing capacity of anti-VEGF antibody, providing further proof that anti-VEGF antibody specifically induces proteinuria (Fig. 1A). Recent studies propose that sFlt-1 can also neutralize circulating VEGF and suggest the use of this protein as an anti-cancer agent (26Bainbridge J.W. Mistry A. De Alwis M. Paleolog E. Baker A. Thrasher A.J. Ali R.R. Gene Ther. 2002; 9: 320-326Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar, 27Lai C.M. Brankov M. Zaknich T. Lai Y.K. Shen W.Y. Constable I.J. Kovesdi I. Rakoczy P.E. Hum. Gene Ther. 2001; 12: 1299-1310Crossref PubMed Scopus (99) Google Scholar, 28Goldman C.K. Kendall R.L. Cabrera G. Soroceanu L. Heike Y. Gillespie G.Y. Siegal G.P. Mao X. Bett A.J. Huckle W.R. Thomas K.A. Curiel D.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 8795-8800Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar, 29Hasumi Y. Mizukami H. Urabe M. Kohno T. Takeuchi K. Kume A. Momoeda M. Yoshikawa H. Tsuruo T. Shibuya M. Taketani Y. Ozawa K. Cancer Res. 2002; 62: 2019-2023PubMed Google Scholar, 30Yang W. Arii S. Mori A. Furumoto K. Nakao T. Isobe N. Murata T. Onodera H. Imamura M. Cancer Res. 2001; 61: 7840-7845PubMed Google Scholar). Therefore, in the present study we used mouse sFlt-1/Fc fusion protein to perform similar experiments as done using anti-VEGF antibodies. Again, consistent with anti-VEGF antibody experiments, we show that sFlt-1 can induce proteinuria in mice within 3 h of intravenous injection and this effect disappears by 24 h (Fig. 1B; data not shown). Additionally, as shown earlier, exogenous VEGF supplementation at equivalent molar concentration of sFlt-1 (32.5 pm) inhibits the proteinuria-inducing effect of sFlt-1 (Fig. 1B). These results collectively show that intravenous injection of a single dose of anti-VEGF antibodies and sFlt-1 to neutralize circulating VEGF leads to proteinuria. We next performed ultrastructural transmission electron microscopy analysis of the kidney glomerular tissue sections from mice which developed proteinuria upon treatment with anti-VEGF antibodies and sFlt-1. The control kidney sections, 5 h after injected with 32.5 pm of IgG1, reveal normal ultrastructual histology with well defined endothelial layer (arrowhead) adjacent to the glomerular basement membrane (GBM), proper alignment of podocyte foot processes (black arrow), and slit diaphragms (white arrow) (Fig. 1, C and D). Starting 3 h and even at 24 h, anti-VEGF antibodies treatment reveal glomerular endothelial hypertrophy (Fig. 1E,dotted line), damage (Fig. 1F, dotted line), endothelial cell detachment from GBM (Fig. 1G,arrow) and occasional disruption/loss of slit diaphragms (Fig. 1, E–H, arrowhead). Similar results are observed when kidney from sFlt-1 injected mice are analyzed (data not shown). These results suggest that anti-VEGF antibody and sFlt-1 infusion leads to glomerular endothelial cell damage and also patchy yet significant glomerular epithelial cell damage (podocytes). Such defects could result in proteinuria as shown by recent studies (22Kabbinavar F. Hurwitz H.I. Fehrenbacher L. Meropol N.J. Novotny W.F. Lieberman G. Griffing S. Bergsland E. J. Clin. Oncol. 2003; 21: 60-65Crossref PubMed Scopus (1582) Google Scholar, 24Hamano Y. Grunkemeyer J.A. Sudhakar A. Zeisberg M. Cosgrove D. Morello R. Lee B. Sugimoto H. Kalluri R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 31154-31162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar,31Ostendorf T. Kunter U. Eitner F. Loos A. Regele H. Kerjaschki D. Henninger D.D. Janjic N. Floege J. J. Clin. Invest. 1999; 104: 913-923Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar). Fenestrations associated with glomerular endothelial cells are a characteristic feature of the kidney (32Jones D.B. Lab. Invest. 1985; 52: 453-461PubMed Google Scholar, 33Bulger R.E. Eknoyan G. Purcell II, D.J. Dobyan D.C. J. Clin. Invest. 1983; 72: 128-141Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar). Such fenestrations are considered to allow for the filtration property of the glomerulus (34Farquhar M.G. Wissig S.L. Palade G.E. J. Am. Soc. Nephrol. 1999; 10: 2645-2662PubMed Google Scholar, 35Venkatachalam M.A. Karnovsky M.J. Fahimi H.D. Cotran R.S. J. Exp. Med. 1970; 132: 1153-1167Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 36Rennke H.G. Venkatachalam M.A. Kidney Int. 1977; 11: 44-53Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 37Oliver C. Essner E. J. Exp. Med. 1972; 136: 291-304Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). It is well established now that fenestrated endothelium does not prevent albumin penetration and in general many large proteins can pass through the fenestrations (34Farquhar M.G. Wissig S.L. Palade G.E. J. Am. Soc. Nephrol. 1999; 10: 2645-2662PubMed Google Scholar, 37Oliver C. Essner E. J. Exp. Med. 1972; 136: 291-304Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar, 38Rennke H.G. Venkatachalam M.A. Fed. Proc. 1977; 36: 2519-2526PubMed Google Scholar). Thus, presence of albumin in the urine has to be due to a defect in the glomerular basement membrane or podocyte slit diaphragm structure associated with glomerular epithelial cells (34Farquhar M.G. Wissig S.L. Palade G.E. J. Am. Soc. Nephrol. 1999; 10: 2645-2662PubMed Google Scholar, 39Graham Jr., R.C. Karnovsky M.J. J. Exp. Med. 1966; 124: 1123-1134Crossref PubMed Scopus (296) Google Scholar, 40Caulfield J.P. Farquhar M.G. J. Exp. Med. 1975; 142: 61-83Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar, 41Caulfield J.P. Farquhar M.G. J. Cell Biol. 1974; 63: 883-903Crossref PubMed Scopus (232) Google Scholar, 42Rodewald R. Karnovsky M.J. J. Cell Biol. 1974; 60: 423-433Crossref PubMed Scopus (439) Google Scholar, 43Schneeberger E.E. Levey R.H. McCluskey R.T. Karnovsky M.J. Kidney Int. 1975; 8: 48-52Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (24) Google Scholar, 44Deen W.M. Lazzara M.J. Myers B.D. Am. J. Physiol. 2001; 281: F579-F596Crossref PubMed Google Scholar). In the anti-VEGF antibody and sFlt-1 experiments, the glomerular basement membrane is quite intact but occasional defects in the glomerular podocyte architecture can be detected (Fig. 1, E–H). Therefore, we examined four recently identified glomerular podocyte-associated proteins considered to be important for glomerular filtration. Human mutations in nephrin, podocin, and α-actinin-4 result in kidney diseases associated with proteinuria (45Kaplan J.M. Kim S.H. North K.N. Rennke H. Correia L.A. Tong H.Q. Mathis B.J. Rodriguez-Perez J.C. Allen P.G. Beggs A.H. Pollak M.R. Nat. Genet. 2000; 24: 251-256Crossref PubMed Scopus (1043) Google Scholar, 46Boute N. Gribouval O. Roselli S. Benessy F. Lee H. Fuchshuber A. Dahan K. Gubler M.C. Niaudet P. Antignac C. Nat. Genet. 2000; 24: 349-354Crossref PubMed Scopus (1199) Google Scholar, 47Kestila M. Lenkkeri U. Mannikko M. Lamerdin J. McCready P. Putaala H. Ruotsalainen V. Morita T. Nissinen M. Herva R. Kashtan C.E. Peltonen L. Holmberg C. Olsen A. Tryggvason K. Mol. Cell. 1998; 1: 575-582Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1566) Google Scholar). Recently, CD2AP has been implicated as critical for glomerular podocyte function (48Shih N.Y. Li J. Karpitskii V. Nguyen A. Dustin M.L. Kanagawa O. Miner J.H. Shaw A.S. Science. 1999; 286: 312-315Crossref PubMed Scopus (698) Google Scholar). Mice deficient in nephrin die 2 days after birth associated with massive proteinuria and kidney defects (24Hamano Y. Grunkemeyer J.A. Sudhakar A. Zeisberg M. Cosgrove D. Morello R. Lee B. Sugimoto H. Kalluri R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 31154-31162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar, 49Putaala H. Soininen R. Kilpelainen P. Wartiovaara J. Tryggvason K. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 1-8Crossref PubMed Scopus (423) Google Scholar, 50Rantanen M. Palmen T. Patari A. Ahola H. Lehtonen S. Astrom E. Floss T. Vauti F. Wurst W. Ruiz P. Kerjaschki D. Holthofer H. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 1586-1594Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). Other studies have shown that nephrin is key regulator of glomerular filtration apparatus (51Holthofer H. Ahola H. Solin M.L. Wang S. Palmen T. Luimula P. Miettinen A. Kerjaschki D. Am. J. Pathol. 1999; 155: 1681-1687Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar, 52Ruotsalainen V. Ljungberg P. Wartiovaara J. Lenkkeri U. Kestila M. Jalanko H. Holmberg C. Tryggvason K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 7962-7967Crossref PubMed Scopus (610) Google Scholar). Thus, in this study we examined the effect of anti-VEGF antibodies and sFlt-1 on the expression of glomerular slit diaphragm/podocyte associated proteins. The expression of nephrin, CD2AP, podocin, and α-actinin-4 were examined in the kidneys from mice infused with anti-VEGF antibodies (1:10 ratio). By immunofluoresence and Western blot using either kidney sections or kidney extracts, we demonstrate that anti-VEGF antibodies significantly reduce the expression of glomerular slit diaphragm associated protein, nephrin (Fig. 2). The expression of CD2AP, podocin, and α-actinin-4 was unchanged in these kidneys (Fig. 2). Similar results are also obtained when kidneys from sFlt-1 injected mice were analyzed (data not shown). These results suggest that significant decrease in the expression of nephrin, a component of glomerular slit diaphragm which constitutes an important barrier to large serum proteins such as albumin, is a key mediator of anti-VEGF antibody and sFlt-1 induced proteinuria in mice. These results are consistent with other reports which suggest that nephrin expression must be altered for induction of proteinuria (53Langham R.G. Kelly D.J. Cox A.J. Thomson N.M. Holthofer H. Zaoui P. Pinel N. Cordonnier D.J. Gilbert R.E. Diabetologia. 2002; 45: 1572-1576Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 54Benigni A. Tomasoni S. Gagliardini E. Zoja C. Grunkemeyer J.A. Kalluri R. Remuzzi G. J. Am. Soc. Nephrol. 2001; 12: 941-948Crossref PubMed Google Scholar). Collectively, these experiments provide evidence for the importance for circulating physiological levels VEGF in the homeostasis of kidney glomerulus. The glomerular endothelial cells are known to express VEGF receptors 1 and 2, while glomerular epithelial cells do not express these receptors (55Simon M. Rockl W. Hornig C. Grone E.F. Theis H. Weich H.A. Fuchs E. Yayon A. Grone H.J. J. Am. Soc. Nephrol. 1998; 9: 1032-1044PubMed Google Scholar, 56Feng D. Nagy J.A. Brekken R.A. Pettersson A. Manseau E.J. Pyne K. Mulligan R. Thorpe P.E. Dvorak H.F. Dvorak A.M. J. Histochem. Cytochem. 2000; 48: 545-556Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar). Thus the effect on glomerular epithelial cells is conceivably indirect and derived from the loss of glomerular endothelial cells due to the lack of survival signals from circulating VEGF (Fig. 2). This study also provides the necessary biochemical and molecular proof that anti-VEGF antibodies and sFlt-1 can cause proteinuria, offering a possible explanation for proteinuria observed in some cancer patients on anti-VEGF antibody therapy and also pregnancies complicated by preeclampsia (16Pridjian G. Puschett J.B. Obstet. Gynecol. Surv. 2002; 57: 598-618Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 17Roberts J.M. Cooper D.W. Lancet. 2001; 357: 53-56Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1066) Google Scholar, 19Vuorela-Vepsalainen P. Alfthan H. Orpana A. Alitalo K. Stenman U.H. Halmesmaki E. Hum. Reprod. 1999; 14: 1346-1351Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar, 20Vuorela P. Helske S. Hornig C. Alitalo K. Weich H. Halmesmaki E. Obstet. Gynecol. 2000; 95: 353-357Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar, 21Zhou Y. McMaster M. Woo K. Janatpour M. Perry J. Karpanen T. Alitalo K. Damsky C. Fisher S.J. Am. J. Pathol. 2002; 160: 1405-1423Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (536) Google Scholar). In this regard, a possible method to neutralize the effects of anti-VEGF antibodies and sFlt-1 needs to be explored. We thank Dr. Judah Folkman for his helpful discussion in the spring of 2002. We also thank Lori Siniski in the preparation of this manuscript.

In vertebrates, hematopoietic and vascular progenitors develop from ventral mesoderm. The first primitive wave of hematopoiesis yields embryonic red blood cells, whereas progenitor cells of subsequent definitive waves form all hematopoietic cell lineages. In this report we examine the development of hematopoietic and vasculogenic cells in normal zebrafish and characterize defects inclocheandspadetailmutant embryos. The zebrafish homologs oflmo2, c-myb, fli1, flk1, andflt4have been cloned and characterized in this study. Expression of these genes identifies embryonic regions that contain hematopoietic and vascular progenitor cells. The expression ofc-mybalso identifies definitive hematopoietic cells in the ventral wall of the dorsal aorta. Analysis ofb316mutant embryos that carry a deletion of thec-mybgene demonstrates thatc-mybis not required for primitive erythropoiesis in zebrafish even though it is expressed in these cells. Bothclocheandspadetailmutant embryos have defects in primitive hematopoiesis and definitive hematopoiesis. Theclochemutants also have significant decreases in vascular gene expression, whereasspadetailmutants expressed normal levels of these genes. These studies demonstrate that the molecular mechanisms that regulate hematopoiesis and vasculogenesis have been conserved throughout vertebrate evolution and thecloandsptgenes are key regulators of these programs.

Dysfunctional endothelium contributes to more diseases than any other tissue in the body. Small interfering RNAs (siRNAs) can help in the study and treatment of endothelial cells in vivo by durably silencing multiple genes simultaneously, but efficient siRNA delivery has so far remained challenging. Here, we show that polymeric nanoparticles made of low-molecular-weight polyamines and lipids can deliver siRNA to endothelial cells with high efficiency, thereby facilitating the simultaneous silencing of multiple endothelial genes in vivo. Unlike lipid or lipid-like nanoparticles, this formulation does not significantly reduce gene expression in hepatocytes or immune cells even at the dosage necessary for endothelial gene silencing. These nanoparticles mediate the most durable non-liver silencing reported so far and facilitate the delivery of siRNAs that modify endothelial function in mouse models of vascular permeability, emphysema, primary tumour growth and metastasis. Polymeric nanoparticles can efficiently deliver siRNAs to endothelial cells in vivo and silence multiple genes for weeks.