We report the cloning of a transcription-associated histone acetyltransferase type A (HAT A). This Tetrahymena enzyme is strikingly homologous to the yeast protein Gcn5, a putative transcriptional adaptor, and we demonstrate that recombinant Gcn5p possesses HAT activity. Both the ciliate enzyme and Gcn5p contain potential active site residues found in other acetyltransferases and a highly conserved bromodomain. The presence of this domain in nuclear A-type HATs, but not in cytoplasmic B-type HATs, suggests a mechanism whereby HAT A is directed to chromatin to facilitate transcriptional activation. These findings shed light on the biochemical function of the evolutionarily conserved Gcn5p–Ada complex, directly linking histone acetylation to gene activation, and indicate that histone acetylation is a targeted phenomenon.

Double-stranded RNA induces potent and specific gene silencing through a process referred to as RNA interference (RNAi) or posttranscriptional gene silencing (PTGS). RNAi is mediated by RNA-induced silencing complex (RISC), a sequence-specific, multicomponent nuclease that destroys messenger RNAs homologous to the silencing trigger. RISC is known to contain short RNAs (∼22 nucleotides) derived from the double-stranded RNA trigger, but the protein components of this activity are unknown. Here, we report the biochemical purification of the RNAi effector nuclease from cultured Drosophila cells. The active fraction contains a ribonucleoprotein complex of ∼500 kilodaltons. Protein microsequencing reveals that one constituent of this complex is a member of the Argonaute family of proteins, which are essential for gene silencing in Caenorhabditis elegans , Neurospora , and Arabidopsis . This observation begins the process of forging links between genetic analysis of RNAi from diverse organisms and the biochemical model of RNAi that is emerging from Drosophila in vitro systems.

Nuclear exclusion of the forkhead transcription factor FOXO3a by protein kinase Akt contributes to cell survival. We investigated the pathological relationship between phosphoylated-Akt (Akt-p) and FOXO3a in primary tumors. Surprisingly, FOXO3a was found to be excluded from the nuclei of some tumors lacking Akt-p, suggesting an Akt-independent mechanism of regulating FOXO3a localization. We provide evidence for such a mechanism by showing that IκB kinase (IKK) physically interacts with, phosphorylates, and inhibits FOXO3a independent of Akt and causes proteolysis of FOXO3a via the Ub-dependent proteasome pathway. Cytoplasmic FOXO3a correlates with expression of IKKβ or Akt-p in many tumors and associates with poor survival in breast cancer. Further, constitutive expression of IKKβ promotes cell proliferation and tumorigenesis that can be overridden by FOXO3a. These results suggest the negative regulation of FOXO factors by IKK as a key mechanism for promoting cell growth and tumorigenesis.

Increased transcriptional activity of β-catenin resulting from Wnt/Wingless-dependent or -independent signaling has been detected in many types of human cancer, but the underlying mechanism of Wnt-independent regulation is poorly understood. We have demonstrated that AKT, which is activated downstream from epidermal growth factor receptor signaling, phosphorylates β-catenin at Ser552 in vitro and in vivo. AKT-mediated phosphorylation of β-catenin causes its disassociation from cell-cell contacts and accumulation in both the cytosol and the nucleus and enhances its interaction with 14-3-3ζ via a binding motif containing Ser552. Phosphorylation of β-catenin by AKT increases its transcriptional activity and promotes tumor cell invasion, indicating that AKT-dependent regulation of β-catenin plays a critical role in tumor invasion and development. Increased transcriptional activity of β-catenin resulting from Wnt/Wingless-dependent or -independent signaling has been detected in many types of human cancer, but the underlying mechanism of Wnt-independent regulation is poorly understood. We have demonstrated that AKT, which is activated downstream from epidermal growth factor receptor signaling, phosphorylates β-catenin at Ser552 in vitro and in vivo. AKT-mediated phosphorylation of β-catenin causes its disassociation from cell-cell contacts and accumulation in both the cytosol and the nucleus and enhances its interaction with 14-3-3ζ via a binding motif containing Ser552. Phosphorylation of β-catenin by AKT increases its transcriptional activity and promotes tumor cell invasion, indicating that AKT-dependent regulation of β-catenin plays a critical role in tumor invasion and development. β-Catenin, originally identified as a component of cell-cell adhesion structures, interacts with the cytoplasmic domain of E-cadherin and links E-cadherin to α-catenin, which in turn mediates anchorage of the E-cadherin complex to the cortical actin cytoskeleton (1Rimm D.L. Koslov E.R. Kebriaei P. Cianci C.D. Morrow J.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 8813-8817Crossref PubMed Scopus (633) Google Scholar, 2Vasioukhin V. Fuchs E. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: 76-84Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar, 3Nagafuchi A. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: 600-603Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar). Genetic and embryologic studies have revealed that β-catenin is also a component of the Wnt signaling pathway and that it exhibits signaling functions (4Kikuchi A. Cancer Sci. 2003; 94: 225-229Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). In the absence of a Wnt/Wingless signal, cytoplasmic β-catenin interacts with axin/conductin, glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), 3The abbreviations used are: GSK-3β, glycogen synthase kinase-3β; TCF/LEF-1, T-cell factor/lymphoid enhancer factor 1; EGF, epidermal growth factor; EGFR, EGF receptor; CHO, Chinese hamster ovary; HA, hemagglutinin; WT, wild type; PKA, cAMP-dependent protein kinase. and the adenomatous polyposis coli (APC) protein, which competes with E-cadherin for binding to the armadillo-like repeats of β-catenin (5Hulsken J. Birchmeier W. Behrens J. J. Cell Biol. 1994; 127: 2061-2069Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar). β-Catenin is phosphorylated in its N-terminal domain by GSK-3β, which leads to its degradation via the ubiquitin/proteasome pathway mediated by SKP1/CUL1/F-box E3 ligase (6Aberle H. Bauer A. Stappert J. Kispert A. Kemler R. EMBO J. 1997; 16: 3797-3804Crossref PubMed Scopus (2160) Google Scholar, 7Orford K. Orford C.C. Byers S.W. J. Cell Biol. 1999; 146: 855-868Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar, 8Rubinfeld B. Albert I. Porfiri E. Fiol C. Munemitsu S. Polakis P. Science. 1996; 272: 1023-1026Crossref PubMed Scopus (1301) Google Scholar, 9Yost C. Torres M. Miller J.R. Huang E. Kimelman D. Moon R.T. Genes Dev. 1996; 10: 1443-1454Crossref PubMed Scopus (1018) Google Scholar, 10Behrens J. Jerchow B.A. Wurtele M. Grimm J. Asbrand C. Wirtz R. Kuhl M. Wedlich D. Birchmeier W. Science. 1998; 280: 596-599Crossref PubMed Scopus (1113) Google Scholar, 11Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). Activation of the Wnt/Wingless pathway inhibits GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin. Stabilized, hypophosphorylated β-catenin translocates to the nucleus, where it interacts with transcription factors of the TCF/LEF-1 family, leading to the increased expression of genes, such as MYC and CCND1 (12He T.C. Sparks A.B. Rago C. Hermeking H. Zawel L. da Costa L.T. Morin P.J. Vogelstein B. Kinzler K.W. Science. 1998; 281: 1509-1512Crossref PubMed Scopus (4084) Google Scholar, 13Tetsu O. McCormick F. Nature. 1999; 398: 422-426Crossref PubMed Scopus (3259) Google Scholar, 14Shtutman M. Zhurinsky J. Simcha I. Albanese C. D'Amico M. Pestell R. Ben-Ze'ev A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 5522-5527Crossref PubMed Scopus (1919) Google Scholar). Hepatocyte growth factor and epidermal growth factor (EGF) induce β-catenin signaling under conditions where they stimulate cell motility (15Muller T. Bain G. Wang X. Papkoff J. Exp. Cell Res. 2002; 280: 119-133Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar, 16Lu Z. Ghosh S. Wang Z. Hunter T. Cancer Cell. 2003; 4: 499-515Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (564) Google Scholar). Gain of function mutations in β-catenin, including N-terminal mutations that lead to stabilization of the protein or loss of function mutations in proteins that participate in the regulated turnover of β-catenin, such as the tumor suppressor APC, result in up-regulation of β-catenin protein levels, thus increasing its transcriptional activity. Increased β-catenin-TCF/LEF-1 transactivation by enhanced β-catenin stability, resulting from mutations in APC, AXIN1, or CTNNB1 (which encodes β-catenin), is found in a wide variety of human cancers, including colon cancer, desmoid tumor, gastric cancer, hepatocarcinoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, and prostate cancer (17Polakis P. Genes Dev. 2000; 14: 1837-1851Crossref PubMed Google Scholar, 18Peifer M. Polakis P. Science. 2000; 287: 1606-1609Crossref PubMed Scopus (1143) Google Scholar, 19Morin P.J. BioEssays. 1999; 21: 1021-1030Crossref PubMed Scopus (815) Google Scholar). Mutations of Wnt pathway proteins that alter the stability of β-catenin are not the only factor that contributes to β-catenin activation. For instance, in 12 of 20 (60.0%) endometrial cancers, β-catenin was found to accumulate in the nucleus, which is a hallmark of β-catenin activation, whereas there were only two instances of mutations in the CTNNB1 gene (20Ashihara K. Saito T. Mizumoto H. Nishimura M. Tanaka R. Kudo R. Med. Electron Microsc. 2002; 35: 9-15Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). Similarly, only 1 of 65 primary melanomas had detectable CTNNB1 mutations, with a third of the cases displaying nuclear accumulation of β-catenin (21Rimm D.L. Caca K. Hu G. Harrison F.B. Fearon E.R. Am. J. Pathol. 1999; 154: 325-329Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (257) Google Scholar). Moreover, nearly 50% of hepatocellular carcinomas, in which the APC gene is rarely mutated, reveal nuclear accumulation of β-catenin protein, and genetic alterations in CTNNB1 are detected only in 16–26% of the tumors (22de La Coste A. Romagnolo B. Billuart P. Renard C.A. Buendia M.A. Soubrane O. Fabre M. Chelly J. Beldjord C. Kahn A. Perret C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 8847-8851Crossref PubMed Scopus (983) Google Scholar, 23Satoh S. Daigo Y. Furukawa Y. Kato T. Miwa N. Nishiwaki T. Kawasoe T. Ishiguro H. Fujita M. Tokino T. Sasaki Y. Imaoka S. Murata M. Shimano T. Yamaoka Y. Nakamura Y. Nat. Genet. 2000; 24: 245-250Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar, 24Miyoshi Y. Iwao K. Nagasawa Y. Aihara T. Sasaki Y. Imaoka S. Murata M. Shimano T. Nakamura Y. Cancer Res. 1998; 58: 2524-2527PubMed Google Scholar, 25Ihara A. Koizumi H. Hashizume R. Uchikoshi T. Hepatology. 1996; 23: 1441-1447PubMed Google Scholar). Clearly, more than one mechanism regulates the activity of β-catenin (26Lu Z. Hunter T. Cell Cycle. 2004; 3: 571-573Crossref PubMed Google Scholar). In response to EGF stimulation, β-catenin translocates into the nucleus and increases its transactivation without altering its stability and phosphorylation level by GSK-3β (16Lu Z. Ghosh S. Wang Z. Hunter T. Cancer Cell. 2003; 4: 499-515Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (564) Google Scholar). Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast-crisis chronic myelogenous leukemia have high nuclear β-catenin accumulation presumably, driven by Bcr-Abl (27Jamieson C.H. Ailles L.E. Dylla S.J. Muijtjens M. Jones C. Zehnder J.L. Gotlib J. Li K. Manz M.G. Keating A. Sawyers C.L. Weissman I.L. N. Engl. J. Med. 2004; 351: 657-667Crossref PubMed Scopus (1266) Google Scholar). In this report, we demonstrate that AKT phosphorylates β-catenin at Ser552, which leads to its disassociation from cell-cell contacts, increases its binding to 14-3-3ζ and its transcriptional activity and enhances invasion by tumor cells. Cells and Cell Culture Conditions—A431 human epidermoid carcinoma cells, CHO AA8 cells, and 293T cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% bovine calf serum (HyClone, Logan, UT). Cell cultures were made quiescent by growing them to confluence and then replacing the medium with fresh medium containing 0.5% serum for 1 day. Materials—Rabbit monoclonal antibody recognizing phosphorylated RRX(S/T) peptide was obtained from Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Polyclonal antibody for 14-3-3ζ and monoclonal antibodies for β-catenin (E-5) and HA were acquired from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Polyclonal phospho-β-catenin (Ser33/Ser37)-specific antibody, mouse monoclonal antibodies for FLAG and tubulin, and EGF were purchased from Sigma, along with Hygromycin, AKT inhibitor IV, active His-tagged AKT1 (purified from insect cells), and protein kinase A (purified from bovine heart) from EMD Biosciences. Active GST-AKT2 (purified from insect cells) was obtained from Biomol International (Plymouth Meeting, PA), Hoechst 33342, fluorescein isothiocyanate-conjugated anti-mouse antibody and Texas Red-conjugated anti-rabbit antibody were from Molecular Probes (Eugene, OR), and HyFect transfection reagents was from Denville Scientific (Metuchen, NJ). GelCode Blue Stain Reagent was obtained from Pierce. Transfection—Cells were plated at a density of 4 × 105/60-mm-diameter dish 18 h prior to transfection. Transfection was performed using either calcium phosphate or HyFect reagents (Deveville Scientific) according to the vendor's instructions. Transfected cultures were selected with hygromycin (200 μg/ml) for 10–14 days at 37 °C. At that time, antibiotic-resistant colonies were picked, pooled, and expanded for further analysis under selective conditions. Immunoprecipitation and Immunoblotting Analysis—Extraction of proteins with a modified buffer from cultured cells was followed by immunoprecipitation and immunoblotting with corresponding antibodies, as described previously (28Lu Z. Liu D. Hornia A. Devonish W. Pagano M. Foster D.A. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 839-845Crossref PubMed Scopus (284) Google Scholar). DNA Constructs and Mutagenesis—A PCR-amplified human β-catenin cDNA was cloned either into pColdI vector (TaKaRa, Shiga, Japan) between BamHI and HindIII or into pcDNA3.1/hygro(+)-FLAG vector between BamHI and NotI. pColdI-β-catenin S552A or S675A and pcDNA3.1-FLAG-β-catenin S552A, S552D, or S675A were made using the QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA). pcDNA3.1 HA-AKT1 DD, HA-AKT2 DD, and HA-AKT1 AAA have been described previously (29Kuo M.T. Liu Z. Wei Y. Lin-Lee Y.C. Tatebe S. Mills G.B. Unate H. Oncogene. 2002; 21: 1945-1954Crossref PubMed Google Scholar). Purification of Recombinant Proteins—The wild-type (WT) and mutants of His-β-catenin protein were expressed in bacteria and purified, as described previously (30Lu Z. Xu S. Joazeiro C. Cobb M.H. Hunter T. Mol. Cell. 2002; 9: 945-956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (272) Google Scholar). In Vitro Invasion Assay—Cell invasion was assessed by the invasion of the cells through Matrigel-coated Transwell inserts. Briefly, Transwell inserts with a 12-μm pore size were coated with 100 μl of a final concentration of 0.78 mg/ml Matrigel in cold serum-free medium. Cells were trypsinized, and cell suspension (500 μl; 1 × 106 cells/ml) was added in triplicate wells. After a 24-h incubation, cells that invaded the Matrigel and passed through the filter were stained with crystal violet and photographed using a digital camera mounted onto a microscope with ×50 magnification. The membranes were dissolved in 4% deoxycholic acid and read colorimetrically at 590 nm. In Vitro Kinase Assays—The kinase reactions were done by mixing purified His-β-catenin with or without purified active AKT or PKA in kinase assay buffer containing 10 μCi of [γ-32P]ATP, 10 mm Tris-HCl (pH 7.4), 5 mm MnCl2, 1 mm dithiothreitol, and 20 μm ATP for 20 min at 30 °C. Reactions were stopped by adding an equal volume of 2× SDS-PAGE sample buffer and boiling for 5 min. Samples were then separated by 6% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membranes for exposing to x-ray film. Luciferase Reporter Gene Assay—To measure the transcriptional activity of TCF/LEF-1, CHO cells were seeded in 24-well plates at 1.5 × 104 cells/well. Twenty-four h after seeding, TCF/LEF-1 reporter (pTOP-FLASH) or control vector (pFOP-FLASH) were transiently transfected with 0.2 μg of WT or mutants of β-catenin together with or without 0.2 μg of AKT1 DD, 0.2 μg of 14-3-3ζ, or 0.2 μg of pEGFR. Twelve h after transfection, the medium was replaced with 0.1% serum for another 12–24 h, and EGF (100 ng/ml) was added 6 h before harvesting. Ten μl out of the 100-μl cell extract were used for measuring luciferase activity. Immunofluorescence Analysis—Cells were fixed and incubated with primary antibodies, Alexa Fluor dye-conjugated secondary antibodies, and Hoechst 33342, according to standard protocols. Cells were examined using a deconvolutional microscope (Zeiss, Thornwood, NY) with a 63-Å oil immersion objective. Axio Vision software from Zeiss was used to deconvolute Z-series images. Mass Spectrometry Analysis—The GelCode Blue-stained gel band was digested in-gel with 200 ng of modified trypsin (sequencing grade, Promega) at 37 °C for 24 h. Resulting peptides were analyzed by Nano-liquid chromatography-coupled ion trap mass spectrometry with on-line desalting on a system consisting of a Famos® autosampler, an Ultimate® Nano-LC module, and a Switchos® pre-column switching device (Dionex Corp., Sunnyvale CA) on a 75-μm × 150-mm C-18 column (Dionex Corp.). Electrospray ion trap mass spectrometry was performed on an LTQ linear ion-trap mass spectrometer (Thermo, San Jose, CA). A portion of the digest was desalted (C18-ZipTip, Millipore, MA) and analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(Voyager DE-STR, Applied Biosystems, Framingham, MA). Proteins were identified by data base search of the fragment spectra against the National Center for Biotechnology Information (NCBI) non-redundant protein data base using Mascot (Matrix Science, London, UK) and Sequest (Thermo, San Jose, CA). Isolation of Nuclei, Cytosol, and Membrane—Nuclei, cytosol, and membrane of cells were isolated using the nuclear extract kit from Active Motif North America (Carlsbad, CA) and the ProteoExtract® subcellular proteome extraction kit from Calbiochem. Pulse-Chase Analysis—293T cells transfected with FLAG-tagged WT or mutants of β-catenin for 2 days were incubated in the absence of methionine for 20 min, pulse-labeled for 1 h with 250 μCi/ml [35S] methionine, washed twice, and incubated in medium containing excess unlabeled methionine for 0, 24, 36, or 48 h. Proteins were immunoprecipitated with anti-FLAG antibodies. Samples were then separated on 6% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes for exposure to x-ray film. AKT Phosphorylates β-Catenin at Ser552 in Vitro and in Vivo—We previously showed that EGF stimulation results in translocation of β-catenin into the nucleus and increased transcriptional activity without altering its stability and phosphorylation level by GSK-3β (16Lu Z. Ghosh S. Wang Z. Hunter T. Cancer Cell. 2003; 4: 499-515Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (564) Google Scholar). To examine whether the increased transcriptional activity of β-catenin is due to a possible unknown posttranslational modification, we analyzed a tryptic digest of β-catenin immunoprecipitated from EGF-stimulated A431 cells with mass spectrometry. One candidate phosphopeptide spanning amino acids 550–565 was detected by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry. Ser552 was then identified as a phosphorylation site in this β-catenin peptide by liquid chromatography-coupled ion trap mass spectrometry (LC-MS/MS) (Fig. 1A) (the presence of Arg at the N terminus of the peptide is due to the known inefficient tryptic digestion of the RX bond in RXpS). The 547TQRRTS552 sequence of β-catenin is closely related to the AKT phosphorylation motif RXRXX(S/T) (31Alessi D.R. Caudwell F.B. Andjelkovic M. Hemmings B.A. Cohen P. FEBS Lett. 1996; 399: 333-338Crossref PubMed Scopus (550) Google Scholar) and the PKA phosphorylation consensus sequence (R/K)2X(S/T) (32Pinna L.A. Ruzzene M. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1314: 191-225Crossref PubMed Scopus (408) Google Scholar). Furthermore, this sequence was also recognized as an AKT or PKA-putative phosphorylation site by using the motif-based profile-scanning ScanSite program. To identify the kinase-phosphorylating β-catenin at Ser552, we performed in vitro kinase assays with purified active AKT1, AKT2, or PKA mixed with purified WT His-β-catenin, His-β-catenin S552A, or His-β-catenin S675A, in which the known PKA phosphorylation residue was mutated to Ala (33Taurin S. Sandbo N. Qin Y. Browning D. Dulin N.O. J. Biol. Chem. 2006; 281: 9971-9976Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (352) Google Scholar, 34Hino S. Tanji C. Nakayama K.I. Kikuchi A. Mol. Cell. Biol. 2005; 25: 9063-9072Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar). As expected, and consistent with previous publications (33Taurin S. Sandbo N. Qin Y. Browning D. Dulin N.O. J. Biol. Chem. 2006; 281: 9971-9976Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (352) Google Scholar, 34Hino S. Tanji C. Nakayama K.I. Kikuchi A. Mol. Cell. Biol. 2005; 25: 9063-9072Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar), PKA phosphorylated β-catenin, and this phosphorylation was largely abrogated by mutation at Ser675 but not at Ser552 (Fig. 1B). In contrast, both active AKT1 and active AKT2 were able to phosphorylate β-catenin, and incubation with AKT inhibitor IV (35Kau T.R. Schroeder F. Ramaswamy S. Wojciechowski C.L. Zhao J.J. Roberts T.M. Clardy J. Sellers W.R. Silver P.A. Cancer Cell. 2003; 4: 463-476Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (314) Google Scholar) or mutation at Ser552 but not at Ser675 abolished these effects. Furthermore, phosphorylated WT β-catenin and β-catenin S675A, but not β-catenin S552A, could be detected by a commercial antibody recognizing phosphorylated RRX(S/T) peptide, indicating that this antibody can specifically detect phosphorylated β-catenin at Ser552. (This antibody did not recognize PKA-phosphorylated Ser675 (data not shown). These results indicate that AKT, but not PKA, phosphorylates β-catenin at Ser552 in vitro. To test whether AKT phosphorylates β-catenin in vivo, constitutively active AKT1 DD (T308D/S473D) was co-transfected with FLAG-tagged WT β-catenin, β-catenin S552A, or β-catenin S675A into 293T cells. Immunoblotting of immunoprecipitated FLAG-tagged protein with the phospho-β-catenin Ser552 antibody showed that active AKT1 induces phosphorylation of WT β-catenin and β-catenin S675A but not the β-catenin S552A mutant (Fig. 1C). Similarly, constitutively active AKT2 DD (T309D/S474D) was capable of inducing phosphorylation of WT β-catenin but not the β-catenin S552A mutant. These results indicate that β-catenin was phosphorylated by AKT at Ser552 but not Ser675 in vivo. EGF treatment activates AKT (36Henson E.S. Gibson S.B. Cell. Signal. 2006; 18: 2089-2097Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar). To test the effect of EGF stimulation on β-catenin phosphorylation, A431 cells were treated with EGF for 30 min. As shown in Fig. 1D, EGF induced phosphorylation of endogenous β-catenin at Ser552, which was blocked by pretreatment with AKT inhibitor IV. This is consistent with β-catenin phosphorylation at Ser552 in response to EGF treatment, as detected by mass spectrometry. β-Catenin Phosphorylated by AKT Disassociates from Cell Contacts and Translocates into the Cytosol and Nucleus—β-Catenin localized in different cellular compartments forms distinct complexes and executes differential cellular functions. To examine whether β-catenin phosphorylation by AKT affects its subcellular distribution, a constitutively active AKT1 DD or an AKT1 AAA (K179A/T308A/S473A) kinase-dead mutant was transfected into A431 cells. Expression of AKT1 DD, but not AKT1 AAA, resulted in translocation of a portion of β-catenin from cell-cell contacts into the cytosol and nucleus (Fig. 2A). Similar data were also observed following expression of AKT2 DD and AKT2 AAA (data not shown). Furthermore, a phosphorylation-mimic β-catenin S552D mutant, in which Ser was mutated into Asp, showed significantly increased cytosolic and nuclear localization in contrast to WT or S552A mutant of β-catenin that was primarily localized in cell-cell contacts (Fig. 2B). Consistently, immunoblotting experiments detected an increase in cytosolic and nuclear β-catenin S552D mutant in contrast to its WT, whereas the nuclear accumulation of β-catenin S552A mutant was reduced (Fig. 2C). Moreover, the amount of the nuclear protein lamin B remained unchanged (Fig. 2C), and we did not detect any E-cadherin in the nuclear fractions, indicating that the nuclear preparations were free of cytosolic contaminants (data not shown). Correlating with the differential redistribution of β-catenin S552D and S552A mutants in the cytosol and nuclei, reduced membrane-bound β-catenin S552D and increased membrane-bound β-catenin S552A were detected in contrast to WT β-catenin (Fig. 2C). To test whether the differential distribution of the WT and mutants of β-catenin affected their phosphorylation by GSK-3β, which leads to proteasomal degradation of β-catenin, immunoprecipitated FLAG-tagged WT β-catenin, β-catenin S552A, and β-catenin S552D were immunoblotted with phospho-β-catenin (S33/S37) antibody. As shown in Fig. 2D, β-catenin S552A and β-catenin S552D have comparable phosphorylation by GSK-3β to WT β-catenin. Furthermore, pulse-chase analyses revealed that transiently expressed FLAG-tagged β-catenin S552A and β-catenin S552D had a comparable half-life to WT β-catenin (quantified by scanning densitometry) (Fig. 2E). These data indicate that β-catenin phosphorylation by AKT leads to its disassociation from cell-cell contacts without altering its phosphorylation by GSK-3β. β-Catenin Phosphorylated by AKT Increases Its Association with 14-3-3ζ—14-3-3 proteins function as key regulators of signal transduction by binding to specific phospho-Ser/Thr-containing sequence motifs within a wide range of target proteins (37Yaffe M.B. FEBS Lett. 2002; 513: 53-57Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar). It has been shown that 14-3-3ζ is a β-catenin-associated protein and can facilitate β-catenin transactivation by AKT (38Tian Q. Feetham M.C. Tao W.A. He X.C. Li L. Aebersold R. Hood L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 15370-15375Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar). 14-3-3 binding motif RX1–2pS/pTX2–3, in which a Ser or a Thr at position –1 and/or –2 with respect to phosphoserine is found in many 14-3-3-binding proteins (39Fu H. Subramanian R.R. Masters S.C. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000; 40: 617-647Crossref PubMed Scopus (1328) Google Scholar), and (R/K)(X)XXp(S/T)XP (37Yaffe M.B. FEBS Lett. 2002; 513: 53-57Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar) is closely related to 549RRTSMG554 of β-catenin. To examine the effect of β-catenin phosphorylated by AKT on its association with 14-3-3ζ, FLAG-tagged WT β-catenin was co-transfected with and without a kinase-dead AKT1 AAA mutant or AKT1 DD into 293T cells. Immunoblotting of immunoprecipitated 14-3-3ζ with anti-FLAG antibody showed that expression of constitutively active AKT1, in contrast to its kinase-dead mutant, significantly increased the interaction between 14-3-3ζ and β-catenin (Fig. 3A). Consistent with the activity of AKT in facilitating this association, the β-catenin S552A mutant, in contrast to WTβ-catenin, was reduced in its binding to 14-3-3ζ, whereas the phosphorylation-mimic β-catenin S552D mutant bound more 14-3-3ζ (Fig. 3B). These data indicate that phosphorylation of β-catenin at Ser552 by AKT increases the association between β-catenin and 14-3-3ζ. Phosphorylation of β-Catenin by AKT Increases Transcriptional Activity of β-Catenin and Enhances Tumor Cell Invasion—Nuclearly localized β-catenin interacts with transcription factors of the TCF/LEF-1 family, leading to the increased expression of downstream genes. β-Catenin phosphorylated by AKT translocated into the nucleus. To test the effect of β-catenin phosphorylation by AKT on TCF/LEF-1 transcriptional activity, the TCF/LEF-1 luciferase reporter TOP-FLASH or a control vector FOP-FLASH was co-transfected with and without constitutively active AKT1 DD with WT β-catenin or β-catenin S552A mutant. Expression of active AKT1 increased TCF/LEF-1 transcriptional activity (Fig. 4A). In contrast to WT β-catenin, β-catenin S552A had reduced transcriptional activity, either in the absence or in the presence of active AKT1. Furthermore, expression of β-catenin S552A reduced the 14-3-3ζ-enhancing effect of active AKT1 DD (Fig. 4B) or EGF-induced TCF/LEF-1 transcriptional activity (Fig. 4C). Consistent with the increased nuclear localization, expression of phosphorylation-mimic mutant β-catenin S552D significantly increased TCF/LEF-1 transcriptional activity, in contrast to WT β-catenin (Fig. 4D). β-Catenin transcriptional activity has been closely related to tumor development. To examine the effect of phosphorylation of β-catenin by AKT on tumor cell invasion, A431 cells were stably transfected with WT β-catenin, β-catenin S552A, or β-catenin S552D, and a Matrigel invasion assay was carried out. Although expression of β-catenin S552A moderately reduced cell invasion, in contrast to cell expression of WT β-catenin, expression of β-catenin S552D significantly enhanced tumor cell invasion (Fig. 4, E and F). These results indicate that β-catenin phosphorylation by AKT promotes tumor cell invasion. β-Catenin, functioning as a major component of both Wnt signaling and cell-cell adhesion, plays a central role in cell proliferation, differentiation, polarity, morphogenesis, and development (40Wodarz A. Nusse R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998; 14: 59-88Crossref PubMed Scopus (1737) Google Scholar, 41Cox R.T. Kirkpatrick C. Peifer M. J. Cell Biol. 1996; 134: 133-148Crossref PubMed Scopus (260) Google Scholar, 42Huelsken J. Vogel R. Brinkmann V. Erdmann B. Birchmeier C. Birchmeier W. J. Cell Biol. 2000; 148: 567-578Crossref PubMed Scopus (523) Google Scholar). β-Catenin deficiency arrests mouse embryo development at gastrulation (43Haegel H. Larue L. Ohsugi M. Fedorov L. Herrenknecht K. Kemler R. Development (Camb.). 1995; 121: 3529-3537Crossref PubMed Google Scholar). β-Catenin localized in different cellular compartments forms distant complexes that carry out differential cellular functions. We show here that β-catenin distribution can be dynamically regulated, and phosphorylation of β-catenin by AKT results in the relocalization of some β-catenin from cell-cell contracts and increase in its transcriptional activity. Activating mutations of Wnt components lead to nuclear localization of β-catenin and are involved in tumor formation and development (44Giles R.H. van Es J.H. Clevers H. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1653: 1-24Crossref PubMed Scopus (1336) Google Scholar). Wnt-independent signaling, nevertheless, is also involved in regulation of β-catenin transactivation and tumorigenesis (26Lu Z. Hunter T. Cell Cycle. 2004; 3: 571-573Crossref PubMed Google Scholar). β-Catenin-TCF/LEF-1 signaling can be activated by growth factors, such as EGF, hepatocyte growth factor/scatter factor, insulin-like growth factor-I, insulin-like growth factor-II, and insulin (15Muller T. Bain G. Wang X. Papkoff J. Exp. Cell Res. 2002; 280: 119-133Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar, 16Lu Z. Ghosh S. Wang Z. Hunter T. Cancer Cell. 2003; 4: 499-515Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (564) Google Scholar, 45Desbois-Mouthon C. Cadoret A. Blivet-Van Eggelpoel M.J. Bertrand F. Cherqui G. Perret C. Capeau J. Oncogene. 2001; 20: 252-259Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar, 46Morali O.G. Delmas V. Moore R. Jeanney C. Thiery J.P. Larue L. Oncogene. 2001; 20: 4942-4950Crossref PubMed Scopus (237) Google Scholar). In response to insulin stimulation, phosphatidylinositol 3-kinase-activated AKT phosphorylates GSK-3β at Ser9, which leads to inactivation of GSK-3β and augmentation of β-catenin-TCF/LEF-1 transcriptional activity (47Weston C.R. Davis R.J. Science. 2001; 292: 2439-2440Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar, 48Cross D.A. Alessi D.R. Cohen P. Andjelkovich M. Hemmings B.A. Nature. 1995; 378: 785-789Crossref PubMed Scopus (4376) Google Scholar). In addition to this indirect regulation, our results show that AKT phospho

Abstract The majority of breast cancer patients who achieve an initial therapeutic response to the human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2)–targeted antibody trastuzumab will show disease progression within 1 year. We previously reported the characterization of SKBR3-derived trastuzumab-resistant pools. In the current study, we show that HER-2 interacts with insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) uniquely in these resistant cells and not in the parental trastuzumab-sensitive cells. The occurrence of cross talk between IGF-IR and HER-2 exclusively in resistant cells is evidenced by the IGF-I stimulation resulting in increased phosphorylation of HER-2 in resistant cells, but not in parental cells, and by the inhibition of IGF-IR tyrosine kinase activity leading to decreased HER-2 phosphorylation only in resistant cells. In addition, inhibition of IGF-IR tyrosine kinase activity by I-OMe-AG538 increased sensitivity of resistant cells to trastuzumab. HER-2/IGF-IR interaction was disrupted on exposure of resistant cells to the anti–IGF-IR antibody α-IR3 and, to a lesser extent, when exposed to the anti-HER-2 antibody pertuzumab. Heterodimer disruption by α-IR3 dramatically restored sensitivity to trastuzumab and resistant cells showed a slightly increased sensitivity to pertuzumab versus parental cells. Neither α-IR3 nor pertuzumab decreased HER-2 phosphorylation, suggesting that additional sources of phosphorylation other than IGF-IR exist when HER-2 and IGF-IR are not physically bound. Our data support a unique interaction between HER-2 and IGF-IR in trastuzumab-resistant cells such that cross talk occurs between IGF-IR and HER-2. These data suggest that the IGF-IR/HER-2 heterodimer contributes to trastuzumab resistance and justify the need for further studies examining this complex as a potential therapeutic target in breast cancers that have progressed while on trastuzumab.

We describe the purification and characterization of ACF, an TP-utilizing hromatin assembly and remodeling actor. ACF is a multisubunit factor that contains ISWI protein and is distinct from NURF, another ISWI-containing factor. In chromatin assembly, purified ACF and a core histone chaperone (such as NAP-1 or CAF-1) are sufficient for the ATP-dependent formation of periodic nucleosome arrays. In chromatin remodeling, ACF is able to modulate the internucleosomal spacing of chromatin by an ATP-dependent mechanism. Moreover, ACF can mediate promoter-specific nucleosome reconfiguration by Gal4-VP16 in an ATP-dependent manner. These results suggest that ACF acts catalytically both in chromatin assembly and in the remodeling of nucleosomes that occurs during transcriptional activation.

Increased histone acetylation has been correlated with increased transcription, and regions of heterochromatin are generally hypoacetylated. In investigating the cause-and-effect relationship between histone acetylation and gene activity, we have characterized two yeast histone deacetylase complexes. Histone deacetylase-A (HDA) is an ≈350-kDa complex that is highly sensitive to the deacetylase inhibitor trichostatin A. Histone deacetylase-B (HDB) is an ≈600-kDa complex that is much less sensitive to trichostatin A. The HDA1 protein (a subunit of the HDA activity) shares sequence similarity to RPD3, a factor required for optimal transcription of certain yeast genes. RPD3 is associated with the HDB activity. HDA1 also shares similarity to three new open reading frames in yeast, designated HOS1 , HOS2 , and HOS3 . We find that both hda1 and rpd3 deletions increase acetylation levels in vivo at all sites examined in both core histones H3 and H4, with rpd3 deletions having a greater impact on histone H4 lysine positions 5 and 12. Surprisingly, both hda1 and rpd3 deletions increase repression at telomeric loci, which resemble heterochromatin with rpd3 having a greater effect. In addition, rpd3 deletions retard full induction of the PHO5 promoter fused to the reporter lacZ . These data demonstrate that histone acetylation state has a role in regulating both heterochromatic silencing and regulated gene expression.