Healthy Research Rewards
ResearchHub is incentivizing healthy research behavior. At this time, first authors of open access papers are eligible for rewards. Visit the publications tab to view your eligible publications.
Got it
WG
Wei Gai
Author with expertise in Pathophysiology of Parkinson's Disease
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
5
(100% Open Access)
Cited by:
1,771
h-index:
33
/
i10-index:
51
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Phosphorylation of Ser-129 Is the Dominant Pathological Modification of α-Synuclein in Familial and Sporadic Lewy Body Disease

John Anderson et al.Jul 18, 2006
A comprehensive, unbiased inventory of synuclein forms present in Lewy bodies from patients with dementia with Lewy bodies was carried out using two-dimensional immunoblot analysis, novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assays with modification-specific synuclein antibodies, and mass spectroscopy. The predominant modification of α-synuclein in Lewy bodies is a single phosphorylation at Ser-129. In addition, there is a set of characteristic modifications that are present to a lesser extent, including ubiquitination at Lys residues 12, 21, and 23 and specific truncations at Asp-115, Asp-119, Asn-122, Tyr-133, and Asp-135. No other modifications are detectable by tandem mass spectrometry mapping, except for a ubiquitous N-terminal acetylation. Small amounts of Ser-129 phosphorylated and Asp-119-truncated α-synuclein are present in the soluble fraction of both normal and disease brains, suggesting that these Lewy body-associated forms are produced during normal metabolism of α-synuclein. In contrast, ubiquitination is only detected in Lewy bodies and is primarily present on phosphorylated synuclein; it therefore likely occurs after phosphorylated synuclein has deposited into Lewy bodies. This invariant pattern of specific phosphorylation, truncation, and ubiquitination is also present in the detergent-insoluble fraction of brain from patients with familial Parkinson's disease (synuclein A53T mutation) as well as multiple system atrophy, suggesting a common pathogenic pathway for both genetic and sporadic Lewy body diseases. These observations are most consistent with a model in which preferential accumulation of normally produced Ser-129 phosphorylated α-synuclein is the key event responsible for the formation of Lewy bodies in various Lewy body diseases. A comprehensive, unbiased inventory of synuclein forms present in Lewy bodies from patients with dementia with Lewy bodies was carried out using two-dimensional immunoblot analysis, novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assays with modification-specific synuclein antibodies, and mass spectroscopy. The predominant modification of α-synuclein in Lewy bodies is a single phosphorylation at Ser-129. In addition, there is a set of characteristic modifications that are present to a lesser extent, including ubiquitination at Lys residues 12, 21, and 23 and specific truncations at Asp-115, Asp-119, Asn-122, Tyr-133, and Asp-135. No other modifications are detectable by tandem mass spectrometry mapping, except for a ubiquitous N-terminal acetylation. Small amounts of Ser-129 phosphorylated and Asp-119-truncated α-synuclein are present in the soluble fraction of both normal and disease brains, suggesting that these Lewy body-associated forms are produced during normal metabolism of α-synuclein. In contrast, ubiquitination is only detected in Lewy bodies and is primarily present on phosphorylated synuclein; it therefore likely occurs after phosphorylated synuclein has deposited into Lewy bodies. This invariant pattern of specific phosphorylation, truncation, and ubiquitination is also present in the detergent-insoluble fraction of brain from patients with familial Parkinson's disease (synuclein A53T mutation) as well as multiple system atrophy, suggesting a common pathogenic pathway for both genetic and sporadic Lewy body diseases. These observations are most consistent with a model in which preferential accumulation of normally produced Ser-129 phosphorylated α-synuclein is the key event responsible for the formation of Lewy bodies in various Lewy body diseases. A number of neurodegenerative diseases, including Parkinson disease (PD), 4The abbreviations used are: PD, Parkinson disease; LB, Lewy body; LN, Lewy neurite; DLB, dementia with Lewy bodies; MSA, multiple system atrophy; MS, mass spectrometry; LC, liquid chromatography; IEF, isoelectric focusing; HRP, horseradish peroxidase; XCorr, cross correlation score; P-S129, phosphorylated Ser-129; synuclein-D115, synuclein truncated at Asp-115; synuclein-D119, synuclein truncated at Asp-119; synuclein-N122, synuclein truncated at Asn-122; synuclein-Y133, synuclein truncated at Tyr-133; synuclein-D135, synuclein truncated at Asp-135; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; ESI, electrospray ionization; HPLC, high performance liquid chromatography. 4The abbreviations used are: PD, Parkinson disease; LB, Lewy body; LN, Lewy neurite; DLB, dementia with Lewy bodies; MSA, multiple system atrophy; MS, mass spectrometry; LC, liquid chromatography; IEF, isoelectric focusing; HRP, horseradish peroxidase; XCorr, cross correlation score; P-S129, phosphorylated Ser-129; synuclein-D115, synuclein truncated at Asp-115; synuclein-D119, synuclein truncated at Asp-119; synuclein-N122, synuclein truncated at Asn-122; synuclein-Y133, synuclein truncated at Tyr-133; synuclein-D135, synuclein truncated at Asp-135; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; ESI, electrospray ionization; HPLC, high performance liquid chromatography. dementia with Lewy bodies (DLB), and multiple system atrophy (MSA) are defined histologically by the presence of Lewy bodies (LBs), intracellular protein aggregates that have a range of morphologies, from cytoplasmic spheres to neuritic threads also referred to as Lewy neurites (LNs). A number of proteins have been identified in LBs largely by immunohistochemical staining of brain, although the two most common are ubiquitin and α-synuclein (1Kuzuhara S. Mori H. Izumiyama N. Yoshimura M. Ihara Y. Acta Neuropathol. 1988; 75: 345-353Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar, 2Pollanen M.S. Dickson D.W. Bergeron C. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1993; 52: 183-191Crossref PubMed Scopus (385) Google Scholar, 3Spillantini M.G. Schmidt M.L. Lee V.M. Trojanowski J.Q. Jakes R. Goedert M. Nature. 1997; 388: 839-840Crossref PubMed Scopus (6037) Google Scholar, 4Sampathu D.M. Giasson B.I. Pawlyk A.C. Trojanowski J.Q. Lee V.M.-Y. Am. J. Pathol. 2003; 163: 91-100Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (107) Google Scholar). The invariable presence of α-synuclein in LBs suggests that it plays a key role in the etiology of such diseases ("synucleinopathies"). Point mutations in the synuclein gene as well as multiplication of the gene in familial cases of PD lead to autosomally dominant familial forms of PD (5Polymeropoulos M.H. Lavedan C. Leroy E. Ide S.E. Dehejia A. Dutra A. Pike P. Root H. Rubenstein J. Boyer R. Stenroos E.S. Chandrasekharappa S. Athanassiadou A. Paparpetrpoulos T. Johnson W.G. Lazzarini A.M. Duvoisin R.C. Di Iorio G. Golbe L.I. Nussbaum R.L. Science. 1997; 276: 2045-2047Crossref PubMed Scopus (6556) Google Scholar, 6Krueger R. Kuhn W. Muller T. Woitalla D. Graeber M. Kosel S. Przuntek H. Epplen J.T. Schlos L. Riess O. Nat. Gen. 1998; 18: 106-108Crossref PubMed Scopus (3280) Google Scholar, 7Singleton A.B. Farrer M. Johnson J. Singleton A. Hague S. Kachergus J. Hulihan M. Peuralinna T. Dutra A. Nussbaum R. Lincoln S. Crawley A. Hanson M. Maraganore D. Adler C. Cookson M.R. Muenter M. Baptista M. Miller D. Blancato J. Hardy J. Gwinn-Hardy K. Science. 2003; 302: 841Crossref PubMed Scopus (3445) Google Scholar, 8Chartier-Harlin M.C. Kachergus J. Roumier C. Mouroux V. Douay X. Lincoln S. Levecque C. Larvor L. Andrieux J. Hulihan M. Waucquier N. Defebvre L. Amouyel P. Farrer M. Destee A. Lancet. 2004; 364: 1167-1169Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1558) Google Scholar, 9Ibanez P. Bonnet A.M. Debarges B. Lohmann E. Tison F. Pollak P. Agid Y. Durr A. Brice A. Lancet. 2004; 364: 1169-1171Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (841) Google Scholar). As in sporadic PD, LBs are also found in the brains of individuals with familial PD suggesting that clues about the pathogenic role of synuclein lie within the LB. Because α-synuclein is a relatively abundant neuronal protein, and LBs are found in diseased brain, we hypothesized that the formation of the abnormal LB structures results from specific modifications to this protein. We therefore analyzed the specific forms of α-synuclein that are found in LBs isolated from patients with DLB using a combination of two-dimensional immunoblots, immunoaffinity purification, and LC-MS/MS. We found that a single phosphorylation at Ser-129 (10Fujiwara H. Hasegawa M. Dohmae N. Kawashima A. Masliah E. Goldberg M.S. Shen J. Takio K. Iwatsubo T. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 160-164Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar) of otherwise unmodified α-synuclein is the most abundant modification of the synuclein in LBs. Smaller amounts of ubiquitinated phosphorylated synuclein, as well as synuclein truncated at Asp-119 were also present in every case. In addition, novel truncations at Asp-115, Tyr-133, and Asp-135 were detected. LB-enriched fractions from a member of the Contursi kindred, a family with an A53T mutation in α-synuclein that co-segregates with an autosomally dominant familial form of PD, and glial cell inclusions (GCIs) from an MSA patient had the same profile of modifications as did the DLB cases, thus suggesting a common pathway to pathogenesis in both sporadic and familial synucleinopathies. Small amounts of phosphorylated Ser-129 (P-S129) synuclein were found in the soluble fraction of both control and disease brain. This normally produced, cytosolic form of α-synuclein may thus be the precursor to the predominant pathogenic form of synuclein in LBs. Synuclein truncated at Asp-119 is also found outside of the LBs, in both normal and disease brain, suggesting that this is a normal metabolite of α-synuclein. In contrast, ubiquitinated synuclein, predominantly phosphorylated at Ser-129, was only found in LBs, and therefore most likely occurs after deposition of P-S129 synuclein into LBs. Recombinant α-Synuclein—Clones of full-length and C-terminally truncated (terminating at amino acid 119 or 122) human α-synuclein in pET21d vectors were transformed into the BL21(DE3) strain of Escherichia coli. All clones were verified by sequencing. Synuclein expression was induced with 1 mm isopropyl 1-thio-β-d-galactopyranoside, and bacteria were harvested 2 h post-induction by spinning at 6500 × g for 15 min. The E. coli pellet was lysed by sonication for 3.5 min in 50 mm Tris, pH 7.5, 0.1 mm dithiothreitol, and Complete protease inhibitor mixture (Roche Diagnostics). Cellular debris was pelleted by spinning at 38,000 × g for 20 min. The resulting supernatant was supplemented with an additional 10 mm dithiothreitol and then placed in a boiling water bath for 10 min. Samples were centrifuged as above, and the supernatant containing the α-synuclein was applied to a HiTrap Q-Sepharose column (Amersham Biosciences) equilibrated in lysis buffer. Synuclein was eluted with a linear NaCl gradient (10–700 mm). α-Synuclein preparations were >95% pure as measured by SDS-PAGE. Protein concentration was measured by the BCA assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) and confirmed by amino acid analysis (AAA Laboratory, Mercer Island, WA). MS analysis of the purified samples established that the full-length synuclein was intact and that the truncated synuclein terminated with either Asp-119 or Asn-122. In Vitro Phosphorylation of α-Synuclein at Ser-129—Recombinant α-synuclein (1 mg/ml) was incubated overnight at 30 °C with 3 milliunits/μl casein kinase 2 (Upstate) in 20 mm Tris, pH 8, 4 mm MgCl2, 130 mm KCl, 5 ng/μl poly-l-Lys (Sigma) and 800 μm ATP (Sigma). Phosphorylation of Ser-129 was confirmed by LC-MS/MS, and the P-S129-specific antibody 11A5. Phosphorylation at other sites was not detected by LC-MS/MS. Antibodies—Monoclonal antibodies 1H7 and 9E4 were generated in mice injected with purified recombinant α-synuclein expressed in and purified from E. coli. α-Synuclein purified from bovine brain according to a modified procedure of Jakes et al. (11Jakes R. Spillantini M.G. Goedert M. FEBS Lett. 1994; 345: 27-32Crossref PubMed Scopus (891) Google Scholar) was used as the antigen for production of the mouse monoclonal antibodies 5C12 and 8A5. The antigen for the P-S129-specific antibody 11A5 was the peptide CAYEMPSEEGYQ with a phosphorylated Ser. This peptide corresponds to amino acids 124–134 of α-synuclein with a Cys residue added at the N terminus for coupling and is identical to that described by Fujiwara et al. (10Fujiwara H. Hasegawa M. Dohmae N. Kawashima A. Masliah E. Goldberg M.S. Shen J. Takio K. Iwatsubo T. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 160-164Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). A clonal cell line producing the phospho-specific antibody was obtained by counter-screening against the non-phosphorylated peptide. The rabbit polyclonal antibodies EL43, EL47, and EL48 were prepared to synthetic peptides (AnaSpec, San Jose, CA) corresponding, respectively, to amino acids 1–12, 115–122, and 131–140 of α-synuclein with a GGC linker on the C terminus of each peptide. The neo-epitope polyclonal antibody EL101 was generated by immunizing rabbits with peptides corresponding to amino acids 115–119 (DMPVD) with a CGG linker on the N terminus. All peptides for polyclonal antibody production were coupled through the Cys residue to Imject SuperCarrier Immune Modulator (Pierce), whereas peptides used for monoclonal antibody production were prepared by coupling the Cys on the peptide to sheep anti-mouse IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) using sulfo-EMCS (Molecular Biosciences, Boulder CO). Monoclonal antibodies were purified by anionexchange chromatography or on a Protein A-Sepharose column, and rabbit polyclonal antibodies were affinity purified on Sulfolink gel (Pierce Biotechnology) conjugated to the appropriate peptide antigen. Antibodies were epitope-mapped as described below and tested for their specificity to α-versus β-synuclein using recombinant protein. Commercial antibodies used for immunoblot analysis include Syn-1 (BD Transduction Laboratories), an anti-ubiquitin antibody (Z0458, DAKO), and the HRP-labeled secondary antibodies, donkey anti-rabbit and goat anti-mouse (Amersham Biosciences). Epitope Mapping of Synuclein Antibodies—Monoclonal and polyclonal antibodies generated against α-synuclein and the monoclonal antibody Syn-1 were epitope-mapped using a series of overlapping, linear peptides covering the full-length of the α-synuclein sequence (Mimotopes, Melbourne, Australia). The 15-amino acid-long peptides overlapped by 12 amino acids with 3 amino acid steps. All peptides were biotinylated at the C terminus; however, the last 3 peptides in the series were repeated with biotinylation at the N terminus to allow for the detection of C-terminal-specific antibodies. Peptides (5 nm) were captured on streptavidin-coated ELISA plates (Pierce), which were washed and then incubated with purified antibody (2 μg/ml) for 1 h. Antibody binding to peptide was detected by a colorimetric ELISA assay using HRP-conjugated anti-mouse antibody. Epitopes were mapped with a resolution of three amino acid residues. The polyclonals EL43 and EL48 were mapped, respectively, to amino acids 1–3 and 131–138 of α-synuclein. The monoclonal 1H7 was mapped to amino acids 91–99. Other antibodies used in this study and their epitope-mapped sites are cited in Table 1.TABLE 1C-terminally truncated α-synuclein speciesMolecular massC terminusEstimated cleavage siteImmunoreactivity with synuclein antibodiesSyn 1 (91-96)5C12 (109-120)EL47 (118-123)9E4 (118-126)11A5 (P-Ser-129)8A5 (C terminus)kDa16Full-length140 (intact)++++++15Asp-135129-140+++++-Tyr-133aNot resolved from synuclein-Asp-135 on 2D gels.13.5Glu-126—Ser-129bPosition not yet identified by MS/MS mapping; cleavage site estimated from mobility on SDS-PAGE and antibody reactivity.126-129++++--12.5Asn-122123-126+++---12Asp-119120-123++----11.5Asp-11596-120+-----10Lys-96—Glu-105bPosition not yet identified by MS/MS mapping; cleavage site estimated from mobility on SDS-PAGE and antibody reactivity.96-105+-----a Not resolved from synuclein-Asp-135 on 2D gels.b Position not yet identified by MS/MS mapping; cleavage site estimated from mobility on SDS-PAGE and antibody reactivity. Open table in a new tab Synuclein ELISA Assays—Total and P-S129 α-synuclein levels were quantitated by sandwich ELISAs utilizing 1H7 as the capture antibody and either 5C12 or 11A5 as the reporter antibody, respectively. All steps were carried out at room temperature. Both ELISAs were performed on 4HBX ultra high binding plates (Immulon) coated overnight at 4 °C with 10 μg/ml of 1H7. Plates were blocked for 1 h with casein blocking solution (0.25% casein in phosphate-buffered saline, 0.05% sodium azide). Samples to be assayed were extracted for 1 h with 5 m guanidine plus Complete protease inhibitor mixture. Both samples and standards (recombinant α-synuclein with or without in vitro phosphorylation) were diluted to 0.5 m guanidine in casein blocking solution and were applied in triplicate in 100-μl aliquots to the coated, blocked plates. Following an overnight incubation at 4 °C, plates were brought to room temperature, washed four times with 400 μl of TBST (150 mm sodium chloride, 50 mm Tris, pH 7.5, 0.1% Tween 20) per wash and then incubated for 1 h at room temperature with biotinylated 5C12 or 11A5 (2 μg/ml). After washing, plates were incubated for 1 h with HRP-labeled avidin D (Vector Laboratories, Burlingame, CA) or avidin (Amersham Biosciences) diluted 1:7,500 and 1:10,000, respectively, in specimen diluent (0.6% globulin-free bovine serum albumin, 1.5 mm monobasic sodium phosphate, 8 mm dibasic sodium phosphate, 145 mm sodium chloride, 0.05% Triton X-405 with 0.05% thimerosal). Plates were washed and incubated with TMB1 Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) for 5 min to initiate the colorimetric reaction, which was stopped with 450 mm STOP Reagent (BioFx Laboratories). Plates were read at 450 nm. Isolation of LBs and GCIs—Individuals with DLB and MSA as well as control patients whose brains were used in this study are described in supplemental Table S1. LBs, together with LNs, were isolated as described by Jensen et al. (12Jensen P.H. Islam K. Kenney J. Nielsen M.S. Power J. Gai W.P. J. Biol. Chem. 2000; 275: 21500-21507Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (119) Google Scholar) from the cingulate, temporal, and frontal gray matter of individuals diagnosed with DLB. A mock LB preparation was performed with human brain tissue from control individuals (91/290 and 91/204). GCIs were prepared from an MSA brain (P28) as described by Gai et al. (13Gai W.P. Power J.H.T. Blumbergs P.C. Culvenor J.G. Jensen P.H. J. Neurochem. 1999; 73: 2093-2100PubMed Google Scholar). All preparations were solubilized by two sequential extractions with UTC buffer (7 m urea, 2 m thiourea, 4% CHAPS) with 30 mm Tris, pH 7.5, for 1–3 h at room temperature and 10 min of bath sonication. Preparation of Soluble and Particulate Human Brain Fractions—Cortical gray matter was homogenized in 4 volumes of 0.32 m sucrose, 50 mm Tris, pH 7.4, 5 mm EDTA with protease inhibitors (1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml pepstatin, 17.4 μg/ml phenylmethanesulfonyl fluoride) as described by Jensen et al. (12Jensen P.H. Islam K. Kenney J. Nielsen M.S. Power J. Gai W.P. J. Biol. Chem. 2000; 275: 21500-21507Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (119) Google Scholar) and was subsequently centrifuged at 1,000 × g for 10 min. The resulting postnuclear supernatant was centrifuged at 150,000 × g for 30 min producing a soluble and particulate fraction. The particulate fraction was solubilized in UTC buffer or in Laemmli sample buffer for analysis by two-dimensional or one-dimensional PAGE, respectively. Synuclein Purification from Human Brain—α-Synuclein was purified from 35 g of hippocampal, temporal, cingulate, and prefrontal cortical gray matter combined from individuals (patients AD22 and P52, supplemental Table S1) with DLB. Brain material was Dounce-homogenized in 4 volumes (ml /g) of sucrose buffer (50 mm Tris, pH 7.5, 250 mm sucrose, 5 mm EDTA, 5 mm dithiothreitol) plus Complete protease inhibitor mixture and centrifuged at 100,000 × g to sediment LBs. The pellet was extracted in 200 ml of UTC (7 m urea, 2 m thiourea, 4% CHAPS) for 2 h at 25 °C. The resulting extract was clarified by centrifugation and filtration and then applied to a 16/10 Q-Sepharose column (Amersham Biosciences) equilibrated in anion-exchange buffer (50 mm Tris, pH 7.5, 5 m urea, 5 mm EDTA, 5 mm dithiothreitol). Twenty column volumes of anion-exchange buffer with a 10 to 700 mm NaCl gradient was applied, and α-synuclein was found to elute between 200 and 300 mm NaCl. Fractions were probed on Western blots for α-synuclein immunoreactivity and were pooled into aliquots enriched in either truncated α-synuclein (pools 1 and 2/3) or P-S129 α-synuclein (pool 4). Pools were diluted with sucrose buffer to a final concentration of 0.5 m urea and further purified by immunoaffinity chromatography using the α-synuclein-specific monoclonal antibody 5C12 or the P-S129-specific antibody 11A5 conjugated to N-hydroxysuccinimide-activated Sepharose 4 Fast Flow (3–5 mg of antibody/ml of resin). The resin was washed with 50 mm Tris, pH 7.5, 100 mm NaCl, and α-synuclein was eluted with 200 mm glycine, pH 2.8, 500 mm NaCl. Extraction of Contursi Brain—A temporal lobe cortex specimen from the brain of a 57-year-old woman with a heterozygous A53T α-synuclein mutation (Contursi kindred member IX/56 (14Golbe L.I. Di Iorio G. Sanges G. Lazzarini A.M. La Sala S. Bonavita V. Duvoisin R.C. Ann. Neurol. 1996; 40: 767-775Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar)) was obtained from Drs. D. Dickson and L. Golbe. A specimen of control brain from a 59-year-old female who died of chronic obstructive pulmonary disease (postmortem interval, 15 h) was obtained from Dr. Jennifer A. Chan. Temporal cortex specimens were homogenized in parallel in 3 volumes (ml/g) of 50 mm Tris, pH 7.5, 50 mm NaCl, 2 mm EDTA, 0.2% Nonidet P-40, and Complete protease inhibitor mixture, as described by Schlossmacher and Shimura (15Schlossmacher M.G. Shimura H. Methods Mol. Biol. 2005; 301: 351-369PubMed Google Scholar) and then centrifuged at 100,000 × g for 30 min at 4 °C. The pellet was extracted with the homogenization buffer containing 1% Triton X-100 substituted in place of Nonidet P-40, extracted for 2 h with intermittent vortexing, and spun as above. The pellet was then homogenized in 20 mm Tris, pH 7.5, 0.32 m sucrose, 1 mm magnesium sulfate with Complete protease inhibitors, and centrifuged at 500 × g for 15 min at 4 °C to generate a supernatant (Tris-buffered sucrose extract) and pellet. The pellet was sequentially extracted with 4 volumes of 50 mm Tris, pH 7.5, 8 m urea, 1 mm EDTA, and 1 mm EGTA plus protease inhibitors (urea extract) followed by the same buffer containing 1% SDS (SDS extract). Extracts were spun at 100,000 × g for 30 min. PAGE and Immunoblotting—For two-dimensional analysis, 50–100 μg of LB protein or 100–200 μg of protein from the soluble fraction of brain were focused on 24-cm Immobiline DryStrip gels (Amersham Biosciences) with either a pH 4–7 or pH 3–10 gradient. Strips were run on DALT gels (25 × 21 cm, 12.5% acrylamide). One-dimensional analysis was performed using Tricine-buffered 10–20% acrylamide gels (Invitrogen). One-dimensional gels were blotted onto polyvinylidene difluoride (Millipore) or nitrocellulose (Invitrogen) membranes at 1 amp for 1.5 h using Laemmli transfer buffer. Two-dimensional gels and some one-dimensional gels were blotted onto polyvinylidene difluoride for 1 h and 15 min at 0.8 V/cm2 using a Multiphor semi-dry blotting apparatus with a discontinuous buffer system as specified by the manufacturer. All membranes were placed in boiling phosphate-buffered saline for 3 min prior to blocking with either 5% milk or 10% newborn calf sera (Sigma) in Tris-buffered saline (50 mm Tris, pH 7.5, 150 mm sodium chloride). Immunoreactivity was detected using ECL or ECL Plus (Amersham Biosciences). The apparent molecular weights of synuclein species were extrapolated from the migration of either Bio-Rad Precision or Amersham Biosciences Rainbow molecular weight markers on one-dimensional gels. For reprobing a blot with additional antibodies, the blot was stripped by incubation in 5 m guanidine hydrochloride for at least 30 min, followed by two 5-min washes in Tris-buffered saline and blocking. Complete stripping was verified by reprobing with the appropriate secondary antibody. The pI values noted on each blot were estimated from calibration curves supplied by the manufacturer of the isoelectric focusing strips. Nanospray ESI-MS/MS Analysis—Plugs were removed from one-dimensional SDS-PAGE gels using an Ettan Spotpicker (GE Healthcare/Amersham Biosciences), then equilibrated in 25 mm ammonium bicarbonate and 50% acetonitrile, dehydrated in acetonitrile, and rehydrated in 10 ng/μl trypsin (Promega) in 25 mm ammonium bicarbonate. Samples were acidified to pH 2 with 10% trifluoroacetic acid and sonicated to extract the peptides from the gel plugs. Protein samples in solution were enzymatically digested with 1 ng of trypsin (Promega, Madison, WI) suspended in 25 mm ammonium bicarbonate. Digestions were limited to 1 h at room temperature, with partial proteolysis preferred to allow overlapping peptide sequence coverage by LC-MS/MS. Nanospray high-performance liquid chromatography (HPLC) separation was performed using a Michrom Magic 2002 capillary HPLC (Michrom Bioresources, Auburn, CA) equipped with a 75-μm × 5-cm Proteopep2 C18 reversed-phase nanospray column (New Objective, Cambridge, MA). Peptides were eluted with a linear gradient of 5–50% acetonitrile and 0.01% trifluoroacetic acid in 45 min with a flow rate of 200 nl/min. Peptides were analyzed by MS/MS using an LCQ DecaXP ion-trap mass spectrometer (ThermoElectron Corp., San Jose, CA) with spray voltage set at 2.1 kV and collision energy at 35%. Mass scanning ranges varied accordingly to detect peptides of interest. The mass acquisition method consisted of one full MS survey scan followed by four MS/MS scans of the most abundant precursor ions from the survey scan. Dynamic exclusion of MS/MS spectra was set to 30 s. Data Base Searching and Filtering of Results—MS/MS spectra were searched using the Turbosequest algorithm within the Bioworks 3.2 software suite (ThermoElectron). Data files were searched using a customized data base designed to detect serial C-terminal truncations of the α-synuclein protein and also with the SWISS-PROT data base (Release 46) from Expasy. The mass tolerance of the intact precursor and fragment ions was set at 2 and 1 Da, respectively. Therefore, the intact peptide and peptide fragments were within ±1 and 0.5 Da, respectively, of that of the assigned peptides. The MS/MS data files were searched specifying cleavage by trypsin and allowing up to four missed cleavages. Results were filtered using two independent measures for the accuracy of matches: p values and a cross correlation (XCorr) score, a value based on the number and intensity of ions matched in the data base. The minimum acceptable Xcorr values for assigning peptides, 1.8 (+1), 2.5 (+2), and 3.0 (+3), are within the standard cutoffs typically used for MS data base matches and were selected to screen out all but the most stringent matches. XCorr cutoff values were reduced to 2.5 for matching of (+3) phosphate-containing peptides due to poor fragmentation patterns. Only peptide matches with p values <0.05, i.e. >95% confidence, were accepted in assigning peptides. Differential modifications were specified as Met oxidation (16 Da) and acetylation (42 Da), and Ser, Thr, or Tyr phosphorylation (80 Da). For determination of sites of ubiquitination, a differential modification of 114 Da was specified for Lys residues. This corresponds to the mass of the diglycine modification left behind after tryptic digestion of the ubiquitinated protein. Deconvolution of Intact Protein ESI-MS Spectrum—The charge envelope generated by ESI-MS of the intact P-S129 α-synuclein was acquired over a mass/charge range of 600–1800 m/z and deconvoluted using Bioworks 3.2 (ThermoElectron) with a specified mass range of 5,000–20,000 Da. Immunohistochemistry of Human Brain—Immunohistochemical analysis was conducted on brain samples from pathologically confirmed cases of DLB (n = 6), age-matched controls (n = 6), and individuals with an A53T α-synuclein mutation (n = 2). The patients with the synuclein mutation, II-5 and II-6, were part of an Australian family of Greek origin (16Spira P.J. Sharpe D.M. Halliday G. Cavanagh J. Nicholson G.A. Ann. Neurol. 2001; 49: 313-319Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Brains from the control and DLB patients were bisected with one half fixed by immersion in buffered 4% formaldehyde and the other half frozen at –70 °C for biochemical studies (17Gai W.P. Yuan H.X. Li X.Q. Power T.H. Blumbergs P.C. Jensen P.H. Exp. Neurol. 2000; 166: 324-333Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar). Free-floating sections (50 μm) were prepared from brain regions known to contain LBs (cingulate, frontal, and temporal cortices and brainstem). Sections were incubated with primary antibodies overnight, followed by biotinylated donkey anti-rabbit or anti-mouse IgG (1:100, Jackson ImmunoResearch Laboratories). Sections were incubated with an avidin-biotinylated peroxidase complex (1:200, Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) and developed with 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride and hydrogen peroxide. Primary antibodies used included EL48 and EL101, each used at 1 μg/ml. To test the neo-epitope specificity of EL101 on brain sections, EL101 was preincubated with recombinant α-synuclein (100 μg/ml) or with the peptide antigen (20 μg/ml) prior to staining. α-Synuc
0
Citation1,244
0
Save
0

Phosphorylation at S87 Is Enhanced in Synucleinopathies, Inhibits α-Synuclein Oligomerization, and Influences Synuclein-Membrane Interactions

Katerina Paleologou et al.Mar 3, 2010
Increasing evidence suggests that phosphorylation may play an important role in the oligomerization, fibrillogenesis, Lewy body (LB) formation, and neurotoxicity of α-synuclein (α-syn) in Parkinson disease. Herein we demonstrate that α-syn is phosphorylated at S87 in vivo and within LBs. The levels of S87-P are increased in brains of transgenic (TG) models of synucleinopathies and human brains from Alzheimer disease (AD), LB disease (LBD), and multiple system atrophy (MSA) patients. Using antibodies against phosphorylated α-syn (S129-P and S87-P), a significant amount of immunoreactivity was detected in the membrane in the LBD, MSA, and AD cases but not in normal controls. In brain homogenates from diseased human brains and TG animals, the majority of S87-P α-syn was detected in the membrane fractions. A battery of biophysical methods were used to dissect the effect of S87 phosphorylation on the structure, aggregation, and membrane-binding properties of monomeric α-syn. These studies demonstrated that phosphorylation at S87 expands the structure of α-syn, increases its conformational flexibility, and blocks its fibrillization in vitro . Furthermore, phosphorylation at S87, but not S129, results in significant reduction of α-syn binding to membranes. Together, our findings provide novel mechanistic insight into the role of phosphorylation at S87 and S129 in the pathogenesis of synucleinopathies and potential roles of phosphorylation in α-syn normal biology.
0

Clinical application value of simultaneous plasma and bronchoalveolar lavage fluid metagenomic next generation sequencing in patients with pneumonia-derived sepsis

Jiayan Li et al.Dec 6, 2024
Despite the increasing use of metagenomic next-generation sequencing (mNGS) in sepsis, identifying clinically relevant pathogens remains challenging. This study was aimed to evaluate the clinical utility of simultaneous plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) detection using mNGS. This retrospective study enrolled 95 patients with pneumonia-derived sepsis (PDS) admitted to the intensive care unit (ICU) between October 2021 and January 2023. Patients were divided into two groups: mNGS group (n = 60) and the non-mNGS group (n = 35), based on whether simultaneous plasma and BALF mNGS were conducted. All patients underwent conventional microbiological tests (CMT), including bacterial/fungal culture of peripheral blood and BALF, as well as sputum culture, detection of 1, 3-beta-D- glucan in BALF and RT-PCR testing. The clinical data of the enrolled patients were collected, and the detection performance and prognosis of plasma mNGS, BALF mNGS and CMT were compared. The mNGS group exhibited a lower mortality rate than the non-mNGS group (35.0% vs. 57.1%, P = 0.034). Simultaneous detection in dual-sample resulted in a higher proportion of microorganisms identified as definite causes of sepsis alert compared to detection in either plasma or BALF alone (55.6% vs. 20.8% vs. 18.8%, P<0.001). Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Candida albicans, and human mastadenovirus B were the primary strains responsible for infections in PDS patients. Patients with lower white blood cells and neutrophil indices had a greater consistency in dual-sample mNGS. Patients in the mNGS group had more antibiotic adjustments compared to the non-mNGS group (85.71% vs. 33.33%, P<0.001). The percentage of neutrophils was a risk factor for mortality in PDS patients (P = 0.002). Dual sample mNGS has the advantage of detecting and determining the pathogenicity of more pathogens and has the potential to improve the prognosis of patients with PDS.
0

A Rare Q-Fever Infection Diagnosed Using Metagenomic Next-Generation Sequencing in Liver Transplantation Patient: A Case Report and Literature Review

Xinxin Niu et al.Jan 1, 2025
Abstract: Q fever is a zoonotic disease caused by the Gram-negative bacterium Coxiella burnetii , typically transmitted through exposure to infected animal secretions. As the clinical signs of Q-fever are largely non-specific in humans, a definitive diagnosis can often be overlooked, particularly when physicians fail to consider C. burnetii on the list of differentials. This case report describes Q-fever in a male patient who had previously undergone orthotopic liver transplantation. The patient had a sudden onset of fever and received the anti-infective moxifloxacin which proved ineffective. Despite the comprehensive laboratory tests and CT imaging that were performed, the etiology remained undetermined. The patient's blood was subjected to metagenomic next-generation sequencing (mNGS), which identified C. burnetii , after which the patient was treated with doxycycline and recovered well. Eight literature articles on Q fever infection in solid organ transplant recipients were reviewed. To our knowledge, this is the first case of Q fever identified by mNGS in an organ transplantation patient. The case underscores the potential of mNGS has in aiding the rapid detection of rare pathogens in immunocompromised patients. Keywords: Q-fever, metagenomic next-generation sequencing, case report, liver transplant, Coxiella burnetii