Although multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry holds considerable promise for quantifying candidate protein biomarkers in blood, transferability of MRM assays between laboratories has never been shown. Addona et al. assess the reproducibility, dynamic range and limits of detection and quantification of MRM across multiple sites. Verification of candidate biomarkers relies upon specific, quantitative assays optimized for selective detection of target proteins, and is increasingly viewed as a critical step in the discovery pipeline that bridges unbiased biomarker discovery to preclinical validation. Although individual laboratories have demonstrated that multiple reaction monitoring (MRM) coupled with isotope dilution mass spectrometry can quantify candidate protein biomarkers in plasma, reproducibility and transferability of these assays between laboratories have not been demonstrated. We describe a multilaboratory study to assess reproducibility, recovery, linear dynamic range and limits of detection and quantification of multiplexed, MRM-based assays, conducted by NCI-CPTAC. Using common materials and standardized protocols, we demonstrate that these assays can be highly reproducible within and across laboratories and instrument platforms, and are sensitive to low μg/ml protein concentrations in unfractionated plasma. We provide data and benchmarks against which individual laboratories can compare their performance and evaluate new technologies for biomarker verification in plasma.

The complexity of proteomic instrumentation for LC-MS/MS introduces many possible sources of variability. Data-dependent sampling of peptides constitutes a stochastic element at the heart of discovery proteomics. Although this variation impacts the identification of peptides, proteomic identifications are far from completely random. In this study, we analyzed interlaboratory data sets from the NCI Clinical Proteomic Technology Assessment for Cancer to examine repeatability and reproducibility in peptide and protein identifications. Included data spanned 144 LC-MS/MS experiments on four Thermo LTQ and four Orbitrap instruments. Samples included yeast lysate, the NCI-20 defined dynamic range protein mix, and the Sigma UPS 1 defined equimolar protein mix. Some of our findings reinforced conventional wisdom, such as repeatability and reproducibility being higher for proteins than for peptides. Most lessons from the data, however, were more subtle. Orbitraps proved capable of higher repeatability and reproducibility, but aberrant performance occasionally erased these gains. Even the simplest protein digestions yielded more peptide ions than LC-MS/MS could identify during a single experiment. We observed that peptide lists from pairs of technical replicates overlapped by 35−60%, giving a range for peptide-level repeatability in these experiments. Sample complexity did not appear to affect peptide identification repeatability, even as numbers of identified spectra changed by an order of magnitude. Statistical analysis of protein spectral counts revealed greater stability across technical replicates for Orbitraps, making them superior to LTQ instruments for biomarker candidate discovery. The most repeatable peptides were those corresponding to conventional tryptic cleavage sites, those that produced intense MS signals, and those that resulted from proteins generating many distinct peptides. Reproducibility among different instruments of the same type lagged behind repeatability of technical replicates on a single instrument by several percent. These findings reinforce the importance of evaluating repeatability as a fundamental characteristic of analytical technologies.