Osteoclasts, the multinucleated cells that resorb bone, develop from hematopoietic cells of monocyte/macrophage lineage. Osteoclast-like cells (OCLs) are formed by coculturing spleen cells with osteoblasts or bone marrow stromal cells in the presence of bone-resorbing factors. The cell-to-cell interaction between osteoblasts/stromal cells and osteoclast progenitors is essential for OCL formation. Recently, we purified and molecularly cloned osteoclastogenesis-inhibitory factor (OCIF), which was identical to osteoprotegerin (OPG). OPG/OCIF is a secreted member of the tumor necrosis factor receptor family and inhibits osteoclastogenesis by interrupting the cell-to-cell interaction. Here we report the expression cloning of a ligand for OPG/OCIF from a complementary DNA library of mouse stromal cells. The protein was found to be a member of the membrane-associated tumor necrosis factor ligand family and induced OCL formation from osteoclast progenitors. A genetically engineered soluble form containing the extracellular domain of the protein induced OCL formation from spleen cells in the absence of osteoblasts/stromal cells. OPG/OCIF abolished the OCL formation induced by the protein. Expression of its gene in osteoblasts/stromal cells was up-regulated by bone-resorbing factors. We conclude that the membrane-bound protein is osteoclast differentiation factor (ODF), a long-sought ligand mediating an essential signal to osteoclast progenitors for their differentiation into osteoclasts. ODF was found to be identical to TRANCE/RANKL, which enhances T-cell growth and dendritic-cell function. ODF seems to be an important regulator in not only osteoclastogenesis but also immune system.

Osteoclast differentiation factor (ODF, also called RANKL/TRANCE/OPGL) stimulates the differentiation of osteoclast progenitors of the monocyte/macrophage lineage into osteoclasts in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF, also called CSF-1). When mouse bone marrow cells were cultured with M-CSF, M-CSF–dependent bone marrow macrophages (M-BMMφ) appeared within 3 d. Tartrate-resistant acid phosphatase–positive osteoclasts were also formed when M-BMMφ were further cultured for 3 d with mouse tumor necrosis factor α (TNF-α) in the presence of M-CSF. Osteoclast formation induced by TNF-α was inhibited by the addition of respective antibodies against TNF receptor 1 (TNFR1) or TNFR2, but not by osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF, also called OPG, a decoy receptor of ODF/RANKL), nor the Fab fragment of anti–RANK (ODF/RANKL receptor) antibody. Experiments using M-BMMφ prepared from TNFR1- or TNFR2-deficient mice showed that both TNFR1- and TNFR2-induced signals were important for osteoclast formation induced by TNF-α. Osteoclasts induced by TNF-α formed resorption pits on dentine slices only in the presence of IL-1α. These results demonstrate that TNF-α stimulates osteoclast differentiation in the presence of M-CSF through a mechanism independent of the ODF/RANKL–RANK system. TNF-α together with IL-1α may play an important role in bone resorption of inflammatory bone diseases.

We developed a co-culture system with mouse spleen cells and osteoblastic cells to examine the role of osteoblasts in osteoclast formation. When mouse spleen cells and osteoblastic cells isolated from fetal mouse calvariae were co-cultured in the presence of 10 nM 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 [1 alpha,25(OH)2D3], numerous tartrate-resistant acid phosphate (TRACP)-positive mononuclear and multinucleated cells were formed within 8 days. Neither the same co-cultures without the vitamin nor separate cultures of either spleen cells or osteoblastic cells with the vitamin produced TRACP-positive cells. Salmon calcitonin (CT) markedly increased cAMP production in the co-cultures treated with 1 alpha,25(OH)2D3. Autoradiographic studies clearly demonstrated that [125I]-CT specifically bound to the TRACP-positive cells formed in the co-cultures with the vitamin. When spleen cells and osteoblastic cells were co-cultured on dentine slices in the presence of 1 alpha,25(OH)2D3, numerous resorption lacunae were formed on the slices. Neither co-cultures of alveolar macrophages and osteoblastic cells nor those of spleen cells and mouse skin-derived fibroblasts induced TRACP-positive cells even in the presence of 1 alpha,25(OH)2D3. When spleen cells and osteoblastic cells were cultured separately from each other by a membrane filter (0.45 micron), no TRACP-positive cells were formed. These results indicate that osteoblastic cells are required for the differentiation of osteoclast progenitors in splenic tissues into multinucleated osteoclasts.

We developed a mouse bone marrow culture system to examine the process of osteoclast-like multinucleated cell formation from its progenitors. When mouse marrow cells were cultured for 8 days with la,25-dihydroxyvitamin D3 [1α,25- (OH)2D3, 10-10 to 10-7 M] or human PTH (1-34) (25–100 ng/ml), tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP)-positive multinucleated cells formed. No TRACP-positive multinucleated cells appeared in the absence of these hormones. 1α,25-(OH)2D3 and PTH also increased the number of the clusters of TRACPpositive mononuclear cells. Time course studies showed that these TRACP-positive mononuclear cell clusters appeared before the formation of TRACP-positive multinucleated cells, suggesting that the TRACP-positive mononuclear cells are precursors of the multinucleated cells. Salmon calcitonin markedly inhibited the formation of TRACP-positive multinucleated cells but not TRACP-positive mononuclear cell clusters induced by 1α,25-(OH)2D3 or PTH. TRACP-positive mononuclear cells and multinucleated cells were rarely stained for nonspecific esterase, but some mononuclear cells were positively stained for both nonspecific esterase and TRACP. More that 90% of the TRACPpositive mononuclear cell clusters and multinucleated cells were found near colonies of alkaline phosphatase-positive mononuclear cells (possibly osteoblasts). When marrow mononuclear cells were cultured on sperm whale dentine slices in the presence of 1α,25-(OH)2D3 or PTH, numerous resorption lacunae were formed. These results suggest that 1) TRACP-positive multinucleated cells formed in response to osteotropic hormones in mouse marrow cultures satisfy most of the criteria of osteoclasts, and 2) osteoblasts may play an important role in osteoclast formation. (Endocrinology122: 1373–1382, 1988)

Abstract Chronic immune responses and inflammatory reactions in rheumatoid arthritis (RA) often cause severe destruction of cartilage and bone, but its mechanism is still a matter of controversy. We reported that interleukin-6 (IL-6) alone does not induce osteoclast formation, but soluble interleukin-6 receptors (sIL-6R) triggered the formation in the presence of IL-6 in cocultures of murine osteoblastic cells and bone marrow cells. In this study, we examined the involvement of sIL-6R and IL-6 in joint destruction in patients with RA. Although the frequency of patients having osteoclast-like multinucleated cells in synovium derived from the knee joint was not significantly different between RA (65%) and osteoarthritis (OA) patients (43%), the number of osteoclast-like cells found in the synovium was greater in the former than in the latter. Multinucleated cells obtained from RA synovium expressed the osteoclast-specific phenotype such as tartrate-resistant acid phosphatase, carbonic anhydrase II, vacuolar proton-ATPase and vitronectin receptors at similar levels to those from a human giant cell tumor of bone. The concentration of both IL-6 and sIL-6R was significantly higher in the synovial fluids from patients with RA than with OA. The concentration of IL-6 and sIL-6R correlated well with the roentgenologic grades of joint destruction. Dose-response curves for human IL-6 and human sIL-6R in inducing osteoclast-like cell formation in cocultures indicated that the RA synovial fluids contained sufficient IL-6 and sIL-6R to induce osteoclastogenesis. When synovial fluids from RA and OA patients were added to the cocultures, some of the RA synovial fluids containing high levels of IL-6 and sIL-6R stimulated osteoclast-like cell formation, which was strikingly inhibited by adding anti-IL-6R antibody simultaneously. These results suggest that IL-6 in the RA synovial fluids is at least in part responsible for joint destruction in the presence of sIL-6R through osteoclastogenesis.

After our previous report that osteoclast-like multinucleated cells (MNCs) were formed in response to 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 [1 alpha,25-(OH)2D3] in cocultures of mouse spleen cells and osteoblast-rich populations freshly isolated from fetal mouse calvariae, we examined whether such primary osteoblast-like cells can be replaced by established cell lines in inducing osteoclast-like cell formation. We first used two clonal cell lines simultaneously established from newborn mouse calvariae. One was the osteoblastic cell line MC3T3-E1, and the other was the preadipose cell line MC3T3-G2/PA6. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP; a marker enzyme of osteoclasts)-positive mononuclear cells and MNCs were formed in the cocultures of spleen cells and MC3T3-G2/PA6 cells in the presence of 1 alpha,25-(OH)2D3. Dexamethasone greatly potentiated TRACP-positive MNC formation induced by 1 alpha,25-(OH)2D3, whereas the glucocorticoid alone had no effect on it. In contrast, osteoblastic MC3T3-E1 cells failed to induce TRACP-positive cells in the cocultures. Another bone marrow-derived stromal cell line ST2 also induced TRACP-positive MNC formation in the cocultures in response to 1 alpha,25-(OH)2D3 and dexamethasone. Salmon calcitonin enhanced cAMP production in the cocultures only when TRACP-positive cells were formed. Autoradiographic studies demonstrated that [125I]calcitonin specifically bound to TRACP-positive cells formed in the cocultures. When spleen cells and either MC3T3-G2/PA6 or ST2 cells were cocultured on sperm whale dentine slices in the presence of 1 alpha,25-(OH)2D3 and dexamethasone, numerous resorption lacunae were formed. These results show that the two bone marrow-derived stromal cell lines can support osteoclast-like cell differentiation in cocultures with spleen cells.