A new, fluorescent, highly selective Ca2+ indicator , "quin2", has been trapped inside intact mouse and pig lymphocytes, to measure and manipulate cytoplasmic free Ca2+ concentrations, [Ca2+]i. Quin2 is a tetracarboxylic acid which binds Ca2+ with 1:1 stoichiometry and an effective dissociation constant of 115 nM in a cationic background mimicking cytoplasm. Its fluorescence signal (excitation 339 nm, emission 492 nm) increases about fivefold going from Ca-free to CA-saturated forms. Cells are loaded with quin2 by incubation with its acetoxymethyl ester, which readily permeates the membrane and is hydrolyzed in the cytoplasm, thus trapping the impermeant quin2 there. The intracellular quin2 appears to be free in cytoplasm, not bound to membranes and not sequestered inside organelles. The fluorescence signal from resting cells indicates a [Ca2+]i of near 120 nM. The millimolar loadings of quin2 needed for accurately calibrated signals do not seem to perturb steady-state [Ca2+]i, but do somewhat slow or blunt [Ca2+]i transients. Loadings of up to 2mM are without serious toxic effects, though above this level some lowering of cellular ATP is observed. [Ca2+]i was well stabilized in the face of large changes in external Ca2+. Alterations of Na+ gradients, membrane potential, or intracellular pH had little effect. Mitochondrial poisons produced a small increase in [Ca2+]i, probably due mostly to the effects of severe ATP depletion on the plasma membrane. Thus intracellulary trapped chelators like quin2 offer a method to measure or buffer [Ca2+]i in hitherto intractable cell types.

The spatial relation between mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) in living HeLa cells was analyzed at high resolution in three dimensions with two differently colored, specifically targeted green fluorescent proteins. Numerous close contacts were observed between these organelles, and mitochondria in situ formed a largely interconnected, dynamic network. A Ca 2+ -sensitive photoprotein targeted to the outer face of the inner mitochondrial membrane showed that, upon opening of the inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 )–gated channels of the ER, the mitochondrial surface was exposed to a higher concentration of Ca 2+ than was the bulk cytosol. These results emphasize the importance of cell architecture and the distribution of organelles in regulation of Ca 2+ signaling.

BAX and BAK are "multidomain" proapoptotic proteins that initiate mitochondrial dysfunction but also localize to the endoplasmic reticulum (ER). Mouse embryonic fibroblasts deficient for BAX and BAK (DKO cells) were found to have a reduced resting concentration of calcium in the ER ([Ca2+]er) that results in decreased uptake of Ca2+ by mitochondria after Ca2+ release from the ER. Expression of SERCA (sarcoplasmic-endoplasmic reticulum Ca2+ adenosine triphosphatase) corrected [Ca2+]er and mitochondrial Ca2+ uptake in DKO cells, restoring apoptotic death in response to agents that release Ca2+ from intracellular stores (such as arachidonic acid, C2-ceramide, and oxidative stress). In contrast, targeting of BAX to mitochondria selectively restored apoptosis to "BH3-only" signals. A third set of stimuli, including many intrinsic signals, required both ER-released Ca2+ and the presence of mitochondrial BAX or BAK to fully restore apoptosis. Thus, BAX and BAK operate in both the ER and mitochondria as an essential gateway for selected apoptotic signals.

Microdomains of high intracellular calcium ion concentration, [Ca 2+ ] i , have been hypothesized to occur in living cells exposed to stimuli that generate inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3 ). Mitochondrially targeted recombinant aequorin was used to show that IP 3 -induced Ca 2+ mobilization from intracellular stores caused increases of mitochondrial Ca 2+ concentration, [Ca 2+ ] m , the speed and amplitude of which are not accounted for by the relatively small increases in mean [Ca 2+ ] i . A similar response was obtained by the addition of IP 3 to permeabilized cells but not by perfusion of cells with Ca 2+ at concentrations similar to those measured in intact cells. It is concluded that in vivo, domains of high [Ca 2+ ] i are transiently generated close to IP 3 -gated channels and sensed by nearby mitochondria; this may provide an efficient mechanism for optimizing mitochondrial activity upon cell stimulation.

Measurements have been made of cytoplasmic pH, (pHi) and free Mg2+ concentration, ( [Mg2+]i), in pig and mouse lymphocytes. pHi was measured in four ways: by a digitonin null-point technique; by direct measurement of the pH of freeze-thawed cell pellets; from the 31P nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum of intracellular inorganic phosphate; and by the use of a newly synthesized, intracellularly-trappable fluorescent pH indicator. In HEPES buffered physiological saline with pH 7.4 at 37 degrees C, pHi was close to 7.0. Addition of physiological levels of HCO3- and CO2 transiently acidified the cells by approximately 0.1 U. Mitogenic concentrations of concanavalin A (Con A) had no measurable effect on pH in the first hour. [Mg2+]i was assessed in three ways: (a) from the external Mg2+ null-point at which the ionophore A23187 produced no net movement of Mg2+ or H+; (b) by Mg-sensitive electrode measurements in freeze-thawed pellets; and (c) from the 31P nuclear magnetic resonance spectrum of the gamma-phosphate of intracellular ATP. Total cell Mg2+ was approximately 12 mmol per liter cell water. The NMR data indicated [Mg2+]i greater than 0.5 mM. The null-point method gave [Mg2+]i approximately 0.9 nM. The electrode measurements gave 1.35 mM, which was thought to be an overestimate. Exposure to mitogenic doses of Con A for 1 h gave no detectable change in total or free Mg2+.

Fast excitatory neurotransmission is mediated by activation of synaptic ionotropic glutamate receptors. In hippocampal slices, we report that stimulation of Schaffer collaterals evokes in CA1 neurons delayed inward currents with slow kinetics, in addition to fast excitatory postsynaptic currents. Similar slow events also occur spontaneously, can still be observed when neuronal activity and synaptic glutamate release are blocked, and are found to be mediated by glutamate released from astrocytes acting preferentially on extrasynaptic NMDA receptors. The slow currents can be triggered by stimuli that evoke Ca2+ oscillations in astrocytes, including photolysis of caged Ca2+ in single astrocytes. As revealed by paired recording and Ca2+ imaging, a striking feature of this NMDA receptor response is that it occurs synchronously in multiple CA1 neurons. Our results reveal a distinct mechanism for neuronal excitation and synchrony and highlight a functional link between astrocytic glutamate and extrasynaptic NMDA receptors.