The pleiotropic lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P) can act intracellularly independently of its cell surface receptors through unknown mechanisms. Sphingosine kinase 2 (SphK2), one of the isoenzymes that generates S1P, was associated with histone H3 and produced S1P that regulated histone acetylation. S1P specifically bound to the histone deacetylases HDAC1 and HDAC2 and inhibited their enzymatic activity, preventing the removal of acetyl groups from lysine residues within histone tails. SphK2 associated with HDAC1 and HDAC2 in repressor complexes and was selectively enriched at the promoters of the genes encoding the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 or the transcriptional regulator c-fos, where it enhanced local histone H3 acetylation and transcription. Thus, HDACs are direct intracellular targets of S1P and link nuclear S1P to epigenetic regulation of gene expression.

TRAF2 (tumour-necrosis factor receptor-associated factor 2), a component of the NF-κB activation pathway important in inflammatory, anti-apoptotic, and immune processes, is shown to be a target of sphingosine kinase 1, one of the isoenzymes that generates the pro-survival lipid mediator sphingosine-1-phosphate inside cells. In addition, sphingosine kinase 1 is revealed as the 'missing' cofactor for TRAF2 E3 ubiquitin ligase activity. These findings provide a mechanistic explanation for the numerous observations of the importance of SphK1 in inflammatory, anti-apoptotic and immune processes. Engagement of the tumour-necrosis factor (TNF) receptor results in the assembly of multi-component signalling complexes by adaptor proteins that include TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2). Genetic evidence indicates that TRAF2 is needed for the polyubiquitination of receptor interacting protein 1 (RIP1), but direct evidence has been lacking. Here it is shown that the lipid sphingosine-1-phosphate is a co-factor needed for this ubiquitination activity of TRAF2. Tumour-necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 2 (TRAF2) is a key component in NF-κB signalling triggered by TNF-α1,2. Genetic evidence indicates that TRAF2 is necessary for the polyubiquitination of receptor interacting protein 1 (RIP1)3 that then serves as a platform for recruitment and stimulation of IκB kinase, leading to activation of the transcription factor NF-κB. Although TRAF2 is a RING domain ubiquitin ligase, direct evidence that TRAF2 catalyses the ubiquitination of RIP1 is lacking. TRAF2 binds to sphingosine kinase 1 (SphK1)4, one of the isoenzymes that generates the pro-survival lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P) inside cells. Here we show that SphK1 and the production of S1P is necessary for lysine-63-linked polyubiquitination of RIP1, phosphorylation of IκB kinase and IκBα, and IκBα degradation, leading to NF-κB activation. These responses were mediated by intracellular S1P independently of its cell surface G-protein-coupled receptors. S1P specifically binds to TRAF2 at the amino-terminal RING domain and stimulates its E3 ligase activity. S1P, but not dihydro-S1P, markedly increased recombinant TRAF2-catalysed lysine-63-linked, but not lysine-48-linked, polyubiquitination of RIP1 in vitro in the presence of the ubiquitin conjugating enzymes (E2) UbcH13 or UbcH5a. Our data show that TRAF2 is a novel intracellular target of S1P, and that S1P is the missing cofactor for TRAF2 E3 ubiquitin ligase activity, indicating a new paradigm for the regulation of lysine-63-linked polyubiquitination. These results also highlight the key role of SphK1 and its product S1P in TNF-α signalling and the canonical NF-κB activation pathway important in inflammatory, antiapoptotic and immune processes.

The potent sphingolipid metabolite sphingosine 1-phosphate is produced by phosphorylation of sphingosine catalyzed by sphingosine kinase (SphK) types 1 and 2. In contrast to pro-survival SphK1, the putative BH3-only protein SphK2 inhibits cell growth and enhances apoptosis. Here we show that SphK2 catalytic activity also contributes to its ability to induce apoptosis. Overexpressed SphK2 also increased cytosolic free calcium induced by serum starvation. Transfer of calcium to mitochondria was required for SphK2-induced apoptosis, as cell death and cytochrome c release was abrogated by inhibition of the mitochondrial Ca2+ transporter. Serum starvation increased the proportion of SphK2 in the endoplasmic reticulum and targeting SphK1 to the endoplasmic reticulum converted it from anti-apoptotic to pro-apoptotic. Overexpression of SphK2 increased incorporation of [3H]palmitate, a substrate for both serine palmitoyltransferase and ceramide synthase, into C16-ceramide, whereas SphK1 decreased it. Electrospray ionizationmass spectrometry/mass spectrometry also revealed an opposite effect on ceramide mass levels. Importantly, specific down-regulation of SphK2 reduced conversion of sphingosine to ceramide in the recycling pathway and conversely, down-regulation of SphK1 increased it. Our results demonstrate that SphK1 and SphK2 have opposing roles in the regulation of ceramide biosynthesis and suggest that the location of sphingosine 1-phosphate production dictates its functions. The potent sphingolipid metabolite sphingosine 1-phosphate is produced by phosphorylation of sphingosine catalyzed by sphingosine kinase (SphK) types 1 and 2. In contrast to pro-survival SphK1, the putative BH3-only protein SphK2 inhibits cell growth and enhances apoptosis. Here we show that SphK2 catalytic activity also contributes to its ability to induce apoptosis. Overexpressed SphK2 also increased cytosolic free calcium induced by serum starvation. Transfer of calcium to mitochondria was required for SphK2-induced apoptosis, as cell death and cytochrome c release was abrogated by inhibition of the mitochondrial Ca2+ transporter. Serum starvation increased the proportion of SphK2 in the endoplasmic reticulum and targeting SphK1 to the endoplasmic reticulum converted it from anti-apoptotic to pro-apoptotic. Overexpression of SphK2 increased incorporation of [3H]palmitate, a substrate for both serine palmitoyltransferase and ceramide synthase, into C16-ceramide, whereas SphK1 decreased it. Electrospray ionizationmass spectrometry/mass spectrometry also revealed an opposite effect on ceramide mass levels. Importantly, specific down-regulation of SphK2 reduced conversion of sphingosine to ceramide in the recycling pathway and conversely, down-regulation of SphK1 increased it. Our results demonstrate that SphK1 and SphK2 have opposing roles in the regulation of ceramide biosynthesis and suggest that the location of sphingosine 1-phosphate production dictates its functions. The sphingolipid metabolite, sphingosine 1-phosphate (S1P), 3The abbreviations used are:S1Psphingosine 1-phosphateBAPTA-AM1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis-acetoxymethyl esterBH3Bcl-2 homology domain 3DKOdouble knock-outESI-MS/MSelectrospray tandem mass spectrometrySMsphingomyelinSphKsphingosine kinaseERendoplasmic reticulumERKextracellular signal-regulated kinaseHAhemagglutininPBSphosphate-buffered saline. a ligand for a family of five specific G protein-coupled receptors, and regulates many important cellular processes including growth, survival, differentiation, cytoskeleton rearrangements, motility, angiogenesis, and immunity (reviewed in Refs. 1Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1768) Google Scholar, 2Saba J.D. Hla T. Circ. Res. 2004; 94: 724-734Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar, 3Anliker B. Chun J. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20555-20558Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (251) Google Scholar). Although there is no doubt that S1P acts extracellularly, several studies suggest that this potent lipid, like its precursors sphingosine (4Suzuki E. Handa K. Toledo M.S. Hakomori S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 14788-14793Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar) and ceramide (N-acylsphingosine) (5Futerman A.H. Hannun Y.A. EMBO Rep. 2004; 5: 777-782Crossref PubMed Scopus (541) Google Scholar, 6Ogretmen B. Hannun Y.A. Nat. Rev. Cancer. 2004; 4: 604-616Crossref PubMed Scopus (1012) Google Scholar, 7Kolesnick R. Fuks Z. Oncogene. 2003; 22: 5897-5906Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar), may also have intracellular functions important for calcium homeostasis (8Meyer zu Heringdorf D. Lass H. Alemany R. Laser K.T. Neumann E. Zhang C. Schmidt M. Rauen U. Jakobs K.H. van Koppen C.J. EMBO J. 1998; 17: 2830-2837Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar), cell growth (9Van Brocklyn J.R. Lee M.J. Menzeleev R. Olivera A. Edsall L. Cuvillier O. Thomas D.M. Coopman P.J. Thangada S. Hla T. Spiegel S. J. Cell Biol. 1998; 142: 229-240Crossref PubMed Scopus (448) Google Scholar, 10Olivera A. Kohama T. Edsall L.C. Nava V. Cuvillier O. Poulton S. Spiegel S. J. Cell Biol. 1999; 147: 545-558Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar), and suppression of apoptosis (11Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1357) Google Scholar, 12Morita Y. Perez G.I. Paris F. Miranda S.R. Ehleiter D. Haimovitz-Friedman A. Fuks Z. Xie Z. Reed J.C. Schuchman E.H. Kolesnick R.N. Tilly J.L. Nat. Med. 2000; 6: 1109-1114Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 13Edsall L.C. Cuvillier O. Twitty S. Spiegel S. Milstien S. J. Neurochem. 2001; 76: 1573-1584Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar, 14Olivera A. Rosenfeldt H.M. Bektas M. Wang F. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 46452-46460Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar). sphingosine 1-phosphate 1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis-acetoxymethyl ester Bcl-2 homology domain 3 double knock-out electrospray tandem mass spectrometry sphingomyelin sphingosine kinase endoplasmic reticulum extracellular signal-regulated kinase hemagglutinin phosphate-buffered saline. Like other lipid mediators, S1P levels are tightly regulated by the balance between synthesis, catalyzed by sphingosine kinase (SphK), irreversible cleavage by S1P lyase, and reversible dephosphorylation to sphingosine by specific S1P phosphatases. Two distinct SphK isoforms, SphK1 and SphK2, have been cloned and characterized (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (474) Google Scholar, 16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar). Diverse external stimuli, particularly growth and survival factors, stimulate SphK1 and intracellularly generated S1P has been implicated in their mitogenic and anti-apoptotic effects (10Olivera A. Kohama T. Edsall L.C. Nava V. Cuvillier O. Poulton S. Spiegel S. J. Cell Biol. 1999; 147: 545-558Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 13Edsall L.C. Cuvillier O. Twitty S. Spiegel S. Milstien S. J. Neurochem. 2001; 76: 1573-1584Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar, 17Xia P. Gamble J.R. Wang L. Pitson S.M. Moretti P.A. Wattenberg B.W. D'Andrea R.J. Vadas M.A. Curr. Biol. 2000; 10: 1527-1530Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (359) Google Scholar, 18Nava V.E. Hobson J.P. Murthy S. Milstien S. Spiegel S. Exp. Cell Res. 2002; 281: 115-127Crossref PubMed Scopus (200) Google Scholar, 19Shu X. Wu W. Mosteller R.D. Broek D. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 7758-7768Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar, 20Xia P. Wang L. Moretti P.A. Albanese N. Chai F. Pitson S.M. D'Andrea R.J. Gamble J.R. Vadas M.A. J. Biol. Chem. 2002; 277: 7996-8003Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (263) Google Scholar, 21Wu W. Shu X. Hovsepyan H. Mosteller R.D. Broek D. Oncogene. 2003; 22: 3361-3370Crossref PubMed Scopus (142) Google Scholar, 22French K.J. Schrecengost R.S. Lee B.D. Zhuang Y. Smith S.N. Eberly J.L. Yun J.K. Smith C.D. Cancer Res. 2003; 63: 5962-5969PubMed Google Scholar, 23Pitson S.M. Moretti P.A. Zebol J.R. Lynn H.E. Xia P. Vadas M.A. Wattenberg B.W. EMBO J. 2003; 22: 5491-5500Crossref PubMed Scopus (463) Google Scholar, 24Taha T.A. Osta W. Kozhaya L. Bielawski J. Johnson K.R. Gillanders W.E. Dbaibo G.S. Hannun Y.A. Obeid L.M. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20546-20554Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). Expression of SphK1 enhanced proliferation and growth in soft agar, promoted the G1-S transition, protected cells from apoptosis (10Olivera A. Kohama T. Edsall L.C. Nava V. Cuvillier O. Poulton S. Spiegel S. J. Cell Biol. 1999; 147: 545-558Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 14Olivera A. Rosenfeldt H.M. Bektas M. Wang F. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 46452-46460Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar, 17Xia P. Gamble J.R. Wang L. Pitson S.M. Moretti P.A. Wattenberg B.W. D'Andrea R.J. Vadas M.A. Curr. Biol. 2000; 10: 1527-1530Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (359) Google Scholar), and induced tumor formation in mice (17Xia P. Gamble J.R. Wang L. Pitson S.M. Moretti P.A. Wattenberg B.W. D'Andrea R.J. Vadas M.A. Curr. Biol. 2000; 10: 1527-1530Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (359) Google Scholar, 18Nava V.E. Hobson J.P. Murthy S. Milstien S. Spiegel S. Exp. Cell Res. 2002; 281: 115-127Crossref PubMed Scopus (200) Google Scholar). However, although SphK1 and intracellularly generated S1P can signal “inside-out” to regulate cytoskeletal rearrangements and cell movement, remarkably, cell growth stimulation and suppression of apoptosis induced by SphK1 are not mediated by S1P receptors (14Olivera A. Rosenfeldt H.M. Bektas M. Wang F. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 46452-46460Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar). In contrast to SphK1, much less is known about SphK2. Although highly similar in amino acid sequence and possessing five evolutionarily conserved domains found in all SphKs (25Liu H. Chakravarty D. Maceyka M. Milstien S. Spiegel S. Prog. Nucleic Acids Res. 2002; 71: 493-511Crossref PubMed Google Scholar), SphK2 diverges in its amino terminus and central region. These two isoenzymes have different kinetic properties and also differ in developmental and tissue expression (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar), implying that they may have distinct physiological functions. Indeed, rather than promoting growth and survival, SphK2 suppressed growth and enhanced apoptosis that was preceded by cytochrome c release and activation of caspase-3 (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 27Igarashi N. Okada T. Hayashi S. Fujita T. Jahangeer S. Nakamura S.I. J. Biol. Chem. 2003; 278: 46832-46839Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (348) Google Scholar). Moreover, SphK2-induced apoptosis was independent of activation of S1P receptors (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). Sequence analysis revealed that SphK2 contains a 9-amino acid motif similar to that present in Bcl2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, a proapoptotic subgroup of the Bcl-2 family. As with other BH3-only proteins, co-immunoprecipitation demonstrated that SphK2 interacted with Bcl-xL (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). However, mutation of the conserved leucine residue present in all BH3 domains (28Huang D.C. Strasser A. Cell. 2000; 103: 839-842Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (902) Google Scholar) only partially reduced apoptosis induced by SphK2 (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar), suggesting that the SphK2 protein possesses additional determinants important for this function. In this study, we found that the catalytic activity of SphK2 and its localization to the ER during stress contribute to its apoptosis-inducing properties. Our results provide clues to how SphK1 and SphK2, two very closely related enzymes that use the same substrate and produce the same product, have opposite effects on cell survival and reveal their opposing functions in regulation of sphingolipid metabolism. Materials—[γ-32P]ATP, [3H]palmitic acid, and l-3-[3H]serine were purchased from Amersham Biosciences. S1P and sphingosine were obtained from Biomol (Plymouth Meeting, PA). The internal standards for quantitation of the sphingolipids by ESI-MS/MS were obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Serum and medium were from BioFluids (Rockville, MD). G418 was from Invitrogen. Monoclonal anti-HA antibody (3F10) was from Roche (Indianapolis, IN). Antibodies to myc (9E10), cytochrome c, ERK2, and HA (rabbit) were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antibody to mitochondrial pyruvate dehydrogenase E1α was from Molecular Probes (Eugene, OR). Polyclonal rabbit antibodies to SphK2 were raised against a unique peptide sequence (QALHIQRLRPKPEARPR) as previously described (29Jolly P.S. Bektas M. Olivera A. Gonzalez-Espinosa C. Proia R.L. Rivera J. Milstien S. Spiegel S. J. Exp. Med. 2004; 199: 959-970Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar). Caspase-12 antibody was kindly provided by Dr. J. Yuan (30Nakagawa T. Zhu H. Morishima N. Li E. Xu J. Yankner B.A. Yuan J. Nature. 2000; 403: 98-103Crossref PubMed Scopus (2966) Google Scholar). Horseradish peroxidase-conjugated and highly cross-adsorbed fluorophore conjugated anti-rat, mouse, and rabbit secondary antibodies were from Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Antibodies to calreticulin and calnexin were from Stressgen Biotechnologies (San Diego, CA). Cells and Plasmids—NIH 3T3 fibroblasts, HEK 293 cells, and wild type and bax-/-/bak-/- mouse embryonic fibroblasts (a kind gift of Dr. H. Harada) were cultured and transfected as described (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). Mammalian expression constructs for SphK1, SphK1-G82D, SphK2, and SphK2-L219A were described previously (10Olivera A. Kohama T. Edsall L.C. Nava V. Cuvillier O. Poulton S. Spiegel S. J. Cell Biol. 1999; 147: 545-558Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 31Toman R.E. Payne S.G. Watterson K. Maceyka M. Lee N.H. Milstien S. Bigbee J.W. Spiegel S. J. Cell Biol. 2004; 166: 381-392Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar, 32Hait N.C. Sarkar S. Le Stunff H. Mikami A. Maceyka M. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2005; 280: 29462-29469Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (133) Google Scholar). The QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) was used to prepare the G213-L219A SphK2 double mutant with the G213 primers using SphK2-L219A as template. SphK1 and SphK1-G82D were cloned into pCMV/myc/ER (Invitrogen) to generate constructs with ER targeting sequences. Sequences of all constructs were confirmed by direct DNA sequencing. Reverse Transcriptase-PCR—Total RNA was isolated with TRIzol reagent (Invitrogen) and was reverse transcribed with Superscript II (Invitrogen). Real-time PCR was performed with pre-mixed primerprobe sets obtained from Applied Biosystems (Foster City, CA). Sphingosine Kinase Activity—SphK2 activity in cytosol and 100,000 × g membrane fractions was determined in the presence of sphingosine complexed with 4 mg/ml bovine serum albumin and [γ-32P]ATP in buffer containing 1 m KCl as previously described (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar), a condition in which SphK2 activity is optimal and SphK1 is inhibited. Specific activity is expressed as picomoles of S1P formed per min/mg of protein. Intracellular Calcium Measurements—Cells plated on glass coverslips were loaded with 1 μm Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2AM; Molecular Probes) in buffer containing 116.8 mm NaCl, 1.8 mm CaCl2,5 mm KCl, 2 mm MgCl2, 11.1 mm glucose, and 10 mm HEPES (pH 7.4) for 20 min at 37 °C (41Mattie M. Brooker G. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1994; 269: 3181-3188Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Coverslips were broken, shards placed in a perfusion chamber of an inverted fluorescence microscope (IX-50, Olympus), and perfused at ∼1 ml/min with the same buffer. The ratio of fluorescence emission (510 nm) of Ca2+-bound Fura-2 (excitation at 340 nm) to unbound Fura-2 (excitation at 380 nm) was measured in at least 25 fields of 1-5 cells each using a xenon arc excitation source, a galvanometer-driven mirror to select between 340 and 380 nm, a photomultiplier, and a photon counter (IonOptix, Milton, MA). Data were acquired and analyzed with Ionwizard software and [Ca2+]i was calculated from a cell-free calibration curve. In some experiments, [Ca2+]i was also measured with a SLM/Aminco fluorescence spectrophotometer (model AB2). Immunoblotting Analysis—Unless otherwise indicated, cells were washed with ice-cold PBS and scraped in 500 μl of buffer containing 50 mm HEPES (pH 7.4), 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% Triton X-100, 2 mm sodium orthovanadate, 4 mm sodium pyrophosphate, 100 mm NaF, 1:500 protease inhibitor mixture (Sigma). For analysis of cytochrome c, cytosolic fractions were prepared by resuspending cells in lysis buffer containing 75 mm NaCl, 1 mm NaH2PO4, 8 mm Na2HPO4, 1 mm EDTA, 250 mm sucrose, and 700 μg/ml digitonin. Lysates were then centrifuged at 14,000 × g for 15 min. Equal amounts (20 μg) of proteins were separated by SDS-PAGE, transblotted to nitrocellulose, and immunopositive bands visualized by enhanced chemiluminescence (Pierce Chemical Co). Where indicated, blots were scanned and densitometric analysis was performed with AlphaEaseFC software (Alpha Innotec, San Leandro, CA). Apoptosis Assays—Apoptosis was measured by staining nuclei with the Hoechst dye bisbenzimide and apoptotic cells were distinguished by condensed, fragmented nuclear regions exactly as described (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). Alternatively, apoptosis was measured with the Cell Death Detection ELISAPLUS kit (Roche Applied Science) that determines cytoplasmic histone-associated DNA fragments. Immunofluorescence and Confocal Microscopy—Transfectants grown on glass coverslips were treated as indicated in the figure legends. Cells were washed with PBS, fixed for 20 min at room temperature with 3.7% formalin, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 3 min. Alternatively, cells were fixed in methanol at -20 °C for 5 min, then blocked for 1 h with 4% bovine serum albumin. After washing, cells were incubated for 30-45 min with primary antibodies in PBS containing 1% bovine serum albumin, then for 30 min with the corresponding secondary antibodies. As the calreticulin antibody stained poorly after methanol fixation, calnexin was used instead as a marker for the ER in these experiments. Coverslips were mounted on glass slides, and images were collected either on a Nikon TE300 fluorescence microscope with a ×60 objective and a CoolSnap CCD run with MetaMorph software or on a Zeiss LSM 510 laser confocal microscope. There was no fluorescence crossover between the channels, and images were collected separately using the appropriate laser excitation and then merged. Subcellular Fractionation—Cells were suspended in buffer containing 20 mm HEPES (pH 7.4), 10 mm KCl, 2 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 10 μg/ml each of aprotinin and leupeptin, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.25 m sucrose. Subcellular fractionation was performed by sequential centrifugation, essentially as described (32Hait N.C. Sarkar S. Le Stunff H. Mikami A. Maceyka M. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2005; 280: 29462-29469Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (133) Google Scholar). The postnuclear supernatants were centrifuged for 10 min at 5,000 × g to generate the heavy membrane mitochondria fraction. The supernatants were then centrifuged at 17,000 × g for 15 min to obtain the light membrane fraction containing ER and Golgi. Alternatively, postnuclear supernatants were directly centrifuged at 17,000 × g for 15 min to obtain the intracellular membrane fraction containing mitochondria, ER, and Golgi. The remaining supernatants were centrifuged at 100,000 × g for 1 h to obtain cytosol (S) and pelleted plasma membrane fractions. Labeling with l-3-[3H]Serine and [3H]Palmitic Acid—Cells were serum starved for 18 h and then incubated without or with sphingosine (5 μm) in the presence of [3H]palmitic acid (10 μCi/ml) or l-3-[3H]serine (30 μCi/ml). 6 h later, cells were scraped in 2 × 600 μl of methanol/concentrated HCl (200:2, v/v). Extracts were sonicated, 600 μl of chloroform and 500 μl of H2O were added and vortexed, and phases were separated by addition of 600 μl of 2 m KCl and 600 μl of chloroform with vigorous vortexing. For determination of ceramide, aliquots of the organic phases (corresponding to 5 × 106 cpm) were separated by TLC on silica gel plates developed in chloroform/acetic acid (9:1, v/v) (33Le Stunff H. Galve-Roperh I. Peterson C. Milstien S. Spiegel S. J. Cell Biol. 2002; 158: 1039-1049Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Labeled sphingolipids were visualized by autoradiography after spraying with En3Hance (DuPont), and ceramides were quantified with a Bioscan 2000 radiochromatogram scanner. Labeled phospholipids were also resolved by TLC with chloroform, methanol, 20 mm CaCl2 (60:20:4, v/v) as the developing solvent. To analyze sphingolipids, an aliquot of the lipid extract (5 × 106 cpm) was subjected to alkaline hydrolysis in 0.2 m KOH in methanol for 2 h at 37 °C to degrade glycerolipids prior to TLC analysis. Mass Spectrometry of Sphingolipids and Metabolites—Cells were serum-starved for 18 h and incubated without or with sphingosine (5 μm) for 6 h. Cells were then washed extensively with PBS and released by trypsinization. An aliquot of cells was taken for protein and total lipid phosphate measurements. To the rest, internal standards were added, lipids extracted, and individual ceramide acyl chain species were quantified by liquid chromatography, electrospray ionization-tandem mass spectrometry as described previously (34Sullards M.C. Merrill A.H. Science STKE 2001. 2001; : L1Google Scholar). Statistical Analysis—Experiments were repeated at least three times with consistent results. For each experiment, data from triplicate samples were calculated and expressed as the mean ± S.D. Statistics were performed using SigmaStat statistical software version 2.0. Apoptosis Induced by SphK2 Requires Its Catalytic Activity—Many studies have shown that SphK1 promotes cell growth and inhibits apoptosis (10Olivera A. Kohama T. Edsall L.C. Nava V. Cuvillier O. Poulton S. Spiegel S. J. Cell Biol. 1999; 147: 545-558Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 17Xia P. Gamble J.R. Wang L. Pitson S.M. Moretti P.A. Wattenberg B.W. D'Andrea R.J. Vadas M.A. Curr. Biol. 2000; 10: 1527-1530Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (359) Google Scholar, 19Shu X. Wu W. Mosteller R.D. Broek D. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 7758-7768Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar, 20Xia P. Wang L. Moretti P.A. Albanese N. Chai F. Pitson S.M. D'Andrea R.J. Gamble J.R. Vadas M.A. J. Biol. Chem. 2002; 277: 7996-8003Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (263) Google Scholar, 22French K.J. Schrecengost R.S. Lee B.D. Zhuang Y. Smith S.N. Eberly J.L. Yun J.K. Smith C.D. Cancer Res. 2003; 63: 5962-5969PubMed Google Scholar, 23Pitson S.M. Moretti P.A. Zebol J.R. Lynn H.E. Xia P. Vadas M.A. Wattenberg B.W. EMBO J. 2003; 22: 5491-5500Crossref PubMed Scopus (463) Google Scholar, 24Taha T.A. Osta W. Kozhaya L. Bielawski J. Johnson K.R. Gillanders W.E. Dbaibo G.S. Hannun Y.A. Obeid L.M. J. Biol. Chem. 2004; 279: 20546-20554Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). In stark contrast, overexpression of SphK2 does the opposite, suppressing cell growth and inducing apoptosis (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 27Igarashi N. Okada T. Hayashi S. Fujita T. Jahangeer S. Nakamura S.I. J. Biol. Chem. 2003; 278: 46832-46839Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (348) Google Scholar). Previously we have shown that mutation of leucine 219 in its putative BH3 domain, a highly conserved leucine present in all BH3 domains (28Huang D.C. Strasser A. Cell. 2000; 103: 839-842Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (902) Google Scholar), reduced its ability to induce apoptosis (26Liu H. Toman R.E. Goparaju S. Maceyka M. Nava V.E. Sankala H. Payne S.G. Bektas M. Ishii I. Chun J. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 40330-40336Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar) (Fig. 1D). Because SphK2-L219A with a mutated BH3 domain also had residual SphK activity (Fig. 1, A and B), we examined whether its enzymatic activity and formation of S1P was also important for its apoptotic effects. All members of the SphK superfamily have the ATP binding sequence (SGDGX17-21K(R)) present within the conserved C2 domain (35Pitson S.M. Moretti P.A. Zebol J.R. Zareie R. Derian C.K. Darrow A.L. Qi J. D'Andrea R.J. Bagley C.J. Vadas M.A. Wattenberg B.W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49545-49553Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar) and a single point mutation of the second conserved glycine residue to aspartate has been used to prepare a catalytically inactive SphK1 (35Pitson S.M. Moretti P.A. Zebol J.R. Zareie R. Derian C.K. Darrow A.L. Qi J. D'Andrea R.J. Bagley C.J. Vadas M.A. Wattenberg B.W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49545-49553Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar, 36Johnson K.R. Becker K.P. Facchinetti M.M. Hannun Y.A. Obeid L.M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 35257-35262Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (262) Google Scholar). Similarly, site-directed mutagenesis of the equivalent residue in SphK2 (G213E) resulted in a complete loss of sphingosine phosphorylating activity (Fig. 1, A and B). This catalytically inactive mutant slightly enhanced apoptosis in serum-starved NIH 3T3 fibroblasts, albeit much less than wild type SphK2 (Fig. 1D). The double G213E/L219A mutation not only eliminated the enzymatic activity of SphK2 (Fig. 1, A and B), it totally abrogated its apoptotic activity (Fig. 1D). These effects did not result from differential expression, as the levels of the mutant SphK2 proteins were essentially the same as the wild-type enzyme (Fig. 1C). Serum Starvation Increases SphK2 in the ER—Although SphK1 and SphK2 have opposite effects on apoptosis, surprisingly, when overexpressed, the enzymatic activities were mainly cytosolic (10Olivera A. Kohama T. Edsall L.C. Nava V. Cuvillier O. Poulton S. Spiegel S. J. Cell Biol. 1999; 147: 545-558Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar). Confocal microscopy revealed that, similar to SphK1, epitope-tagged SphK2 is distributed diffusely throughout the cytoplasm of NIH 3T3 fibroblasts cultured in the presence of serum (Fig. 2A). However, we noticed that in the absence of serum, a fraction of SphK2 appeared to co-localize with the ER marker, calnexin (Fig. 2B), but not the mitochondria marker pyruvate dehydrogenase E1α. The catalytically inactive mutant SphK2-G213E also was cytosolic when cells were cultured in the presence of serum (Fig. 3A) and co-localization with calnexin was enhanced upon serum withdrawal (Fig. 3B), suggesting that the catalytic activity of SphK2 was dispensable for translocation to the ER. Moreover, SphK2-L219A also appeared to co-localize with the ER marker after serum starvation (Fig. 3D), albeit to a lesser extent than wild-type SphK2. This suggests that SphK2 can be localized to the ER in BH3-dependent and independent manners. This is not so surprising as SphK2 also contains numerous putative t

Inflammatory bowel disease is an important risk factor for colorectal cancer. We show that sphingosine-1-phosphate (S1P) produced by upregulation of sphingosine kinase 1 (SphK1) links chronic intestinal inflammation to colitis-associated cancer (CAC) and both are exacerbated by deletion of Sphk2. S1P is essential for production of the multifunctional NF-κB-regulated cytokine IL-6, persistent activation of the transcription factor STAT3, and consequent upregulation of the S1P receptor, S1PR1. The prodrug FTY720 decreased SphK1 and S1PR1 expression and eliminated the NF-κB/IL-6/STAT3 amplification cascade and development of CAC, even in Sphk2−/− mice, and may be useful in treating colon cancer in individuals with ulcerative colitis. Thus, the SphK1/S1P/S1PR1 axis is at the nexus between NF-κB and STAT3 and connects chronic inflammation and CAC.

The potent lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P) regulates diverse physiological processes by binding to 5 specific GPCRs, although it also has intracellular targets. Here, we demonstrate that S1P, produced in the mitochondria mainly by sphin-gosine kinase 2 (SphK2), binds with high affinity and specificity to prohibitin 2 (PHB2), a highly conserved protein that regulates mitochondrial assembly and function. In contrast, S1P did not bind to the closely related protein PHB1, which forms large, multimeric complexes with PHB2. In mitochondria from SphK2-null mice, a new aberrant band of cytochrome-c oxidase was detected by blue native PAGE, and interaction between subunit IV of cytochrome-c oxidase and PHB2 was greatly reduced. Moreover, depletion of SphK2 or PHB2 led to a dysfunction in mitochondrial respiration through cytochrome-c oxidase. Our data point to a new action of S1P in mitochondria and suggest that interaction of S1P with homomeric PHB2 is important for cytochrome-c oxidase assembly and mitochondrial respiration.—Strub, G. M., Paillard, M., Liang, J., Gomez, L., Allegood, J. C., Hait, N. C., Maceyka, M., Price, M. M., Chen, Q., Simpson, D. C., Kordula, T., Milstien, S., Lesnefsky, E. J., Spiegel, S. Sphingosine-1-phos-phate produced by sphingosine kinase 2 in mitochondria interacts with prohibitin 2 to regulate complex IV assembly and respiration. FASEB J. 25, 600–612 (2011). www.fasebj.org

Sphingosine 1-phosphate (S1P), a potent sphingolipid mediator produced by sphingosine kinase isoenzymes (SphK1 and SphK2), regulates diverse cellular processes important for breast cancer progression acting in an autocrine and/or paracrine manner. Here we show that SphK1, but not SphK2, increased S1P export from MCF-7 cells. Whereas for both estradiol (E2) and epidermal growth factor-activated SphK1 and production of S1P, only E2 stimulated rapid release of S1P and dihydro-S1P from MCF-7 cells. E2-induced S1P and dihydro-S1P export required estrogen receptor-α, not GPR30, and was suppressed either by pharmacological inhibitors or gene silencing of ABCC1 (multidrug resistant protein 1) or ABCG2 (breast cancer resistance protein). Inhibiting these transporters also blocked E2-induced activation of ERK1/2, indicating that E2 activates ERK via downstream signaling of S1P. Taken together, our findings suggest that E2-induced export of S1P mediated by ABCC1 and ABCG2 transporters and consequent activation of S1P receptors may contribute to nongenomic signaling of E2 important for breast cancer pathophysiology. Sphingosine 1-phosphate (S1P), a potent sphingolipid mediator produced by sphingosine kinase isoenzymes (SphK1 and SphK2), regulates diverse cellular processes important for breast cancer progression acting in an autocrine and/or paracrine manner. Here we show that SphK1, but not SphK2, increased S1P export from MCF-7 cells. Whereas for both estradiol (E2) and epidermal growth factor-activated SphK1 and production of S1P, only E2 stimulated rapid release of S1P and dihydro-S1P from MCF-7 cells. E2-induced S1P and dihydro-S1P export required estrogen receptor-α, not GPR30, and was suppressed either by pharmacological inhibitors or gene silencing of ABCC1 (multidrug resistant protein 1) or ABCG2 (breast cancer resistance protein). Inhibiting these transporters also blocked E2-induced activation of ERK1/2, indicating that E2 activates ERK via downstream signaling of S1P. Taken together, our findings suggest that E2-induced export of S1P mediated by ABCC1 and ABCG2 transporters and consequent activation of S1P receptors may contribute to nongenomic signaling of E2 important for breast cancer pathophysiology.