Recent advances in statistical mechanical theory can be used to solve a fundamental problem in experimental thermodynamics. In 1997, Jarzynski proved an equality relating the irreversible work to the equilibrium free energy difference, Δ G . This remarkable theoretical result states that it is possible to obtain equilibrium thermodynamic parameters from processes carried out arbitrarily far from equilibrium. We test Jarzynski's equality by mechanically stretching a single molecule of RNA reversibly and irreversibly between two conformations. Application of this equality to the irreversible work trajectories recovers the Δ G profile of the stretching process to within k B T /2 (half the thermal energy) of its best independent estimate, the mean work of reversible stretching. The implementation and test of Jarzynski's equality provides the first example of its use as a bridge between the statistical mechanics of equilibrium and nonequilibrium systems. This work also extends the thermodynamic analysis of single molecule manipulation data beyond the context of equilibrium experiments.

The description of nonequilibrium processes in nano-sized objects, where the typical energies involved are a few times, is increasingly becoming central to disciplines as diverse as condensed-matter physics, materials science, and biophysics. Major recent developments towards a unified treatment of arbitrarily large fluctuations in small systems are described by fluctuation theorems that relate the probabilities of a system absorbing from or releasing to the bath a given amount of energy in a nonequilibrium process. Here we experimentally verify the Crooks Fluctuation Theorem (CFT) under weak and strong nonequilibrium conditions by using optical tweezers to measure the irreversible mechanical work during the unfolding and refolding of a small RNA hairpin and an RNA three-helix junction. We also show that the CFT provides a powerful way to obtain folding free energies in biomolecules by determining the crossing between the unfolding and refolding irreversible work distributions. The method makes it possible to obtain folding free energies in nonequilibrium processes that dissipate up to of the average total work exerted, thereby paving the way for reconstructing free energy landscapes along reaction coordinates in nonequilibrium single-molecule experiments.

Here we use mechanical force to induce the unfolding and refolding of single RNA molecules: a simple RNA hairpin, a molecule containing a three-helix junction, and the P5abc domain of the Tetrahymena thermophila ribozyme. All three molecules (P5abc only in the absence of Mg2+) can be mechanically unfolded at equilibrium, and when kept at constant force within a critical force range, are bi-stable and hop between folded and unfolded states. We determine the force-dependent equilibrium constants for folding/unfolding these single RNA molecules and the positions of their transition states along the reaction coordinate.

[Figure: see text] ▪ Abstract The Watson-Crick double helix of DNA was first revealed in 1953. Since then a wide range of physical chemical methods have been applied to DNA and to its more versatile relative RNA to determine their structures and functions. My major goal is to predict the folded structure of any RNA from its sequence. We have used bulk and single-molecule measurements of thermodynamics and kinetics, plus various spectroscopic methods (UV absorption, optical rotation, circular dichroism, circular intensity differential scattering, fluorescence, NMR) to approach this goal.

The hypochromicity, as a function of temperature for 19 oligoribonucleotides capable of forming perfectly base-paired double helices, is used to extract thermodynamic parameters of helix formation. The data are analyzed by an all or none model of helix melting which permits assignment of ΔG, ΔH, and ΔS of formation to each of the ten possible Watson-Crick base-paired nearest-neighbor sequences. Helix stability is found to have a striking dependence on sequence, and formulae are provided to predict the Tm of any RNA double helix of known sequence.

Publisher Summary This chapter discusses the experimental methods needed to acquire a melting curve and the analysis and interpretation of the data. Any standard commercial UV spectrophotometer can be equipped to measure melting curves. A useful instrument is a single-beam Gilford (Oberlin, OH) spectrophotometer (Model 2530) with an automated reference compensator that allows melting curves to be obtained on three separate samples simultaneously. One major advantage of using UV spectroscopy is the high sensitivity of the method. Normally, the absorbance of the sample used should be between 0.2 and 2.0. Sample preparation for UV melting studies is straightforward. The RNA stock solution is prepared by dialysis against the desired buffer and different concentrations are made by dilution. The high salt concentration is chosen to minimize electrostatic repulsion between strands and to avoid divalent ions, which catalyze hydrolysis of RNA and favor triple-strand formation. This solvent provides a standard condition for measuring melting curves and for comparing results with previously published data.

ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVArticleNEXTHypochromism in Polynucleotides1Ignacio Tinoco Jr.Cite this: J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 18, 4785–4790Publication Date (Print):September 1, 1960Publication History Published online1 May 2002Published inissue 1 September 1960https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ja01503a007https://doi.org/10.1021/ja01503a007research-articleACS PublicationsRequest reuse permissionsArticle Views1461Altmetric-Citations457LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail Other access optionsGet e-Alertsclose Get e-Alerts

Estimates have been made of the main contributions of the heterocyclic bases of DNA to the free energies of the two configurations in solution, the two-stranded helix and the single-strand random coil. The magnitude and directions of the dipole moments of the adenine, thymine, guanine and cytosine base groups have been calculated by a semi-empirical molecular orbital treatment. Dipole—dipole, dipole—induced-dipole and London force interactions among the bases in the helix are large, and make the free energy of the helix depend on the base composition and sequence. The helix stability (helix negative free energy) is proportional to the guanine + cytosine content. A comparison of calculated base-pair interactions with the nearest-neighbor base frequency data of Josse, Kaiser & Kornberg (1961) suggests that the base sequence in natural DNA may be influenced by the free energy. The free energy of the coil is difficult to estimate ; it tends to be more negative from base—solvent interactions for a greater guanine—cytosine content. The choice of solvent determines the magnitude of these interactions and thus determines how the melting temperature of the helix will depend on the base composition. In a solvent such as water, in which significant base—base interactions exist in the coil, the coil free energy depends on the base sequence and London forces may cause stacking of the bases into ordered arrays. The hydrogen bond energy of the bases and the strain energy in the helix probably contribute little to the enthalpy change of the helix—coil transition, although they ensure specific base-pairing in the helix. The net contribution of configurational and solvent entropy changes to the free energy change of the helix—coil transition is also probably small.

We have followed individual ribosomes as they translate single messenger RNA hairpins tethered by the ends to optical tweezers. Here we reveal that translation occurs through successive translocation-and-pause cycles. The distribution of pause lengths, with a median of 2.8 s, indicates that at least two rate-determining processes control each pause. Each translocation step measures three bases—one codon—and occurs in less than 0.1 s. Analysis of the times required for translocation reveals, surprisingly, that there are three substeps in each step. Pause lengths, and thus the overall rate of translation, depend on the secondary structure of the mRNA; the applied force destabilizes secondary structure and decreases pause durations, but does not affect translocation times. Translocation and RNA unwinding are strictly coupled ribosomal functions. Recent advances in crystallography and cryo-electron microscopy have increased our current understanding of the ribosome's role in protein synthesis, the translation of the information encoded by messenger RNA code into a polypeptide. Now in a technical tour de force, Jin-Der Wen et al. have used optical tweezers to follow the translation of a single mRNA by an E. coli ribosome one codon at a time. An mRNA (yellow on the cover) is tracked as it is unwound and translated. Translation, it turns out, is not a continuous process but occurs through successive translocation-and-pause cycles. Each cycle consists of a translocation step of three nucleotides in less than 0.1 s, then a pause of a few seconds. These are the first direct real-time observations of the physical steps of the ribosome machine along the mRNA during translation. The resulting single-molecule assay can address problems in translation not accessible using traditional bulk methods, including translational gene regulation and the fidelity of translation. Graphic by Laura Lancaster and Courtney Hodges, using RIBBONS (M Carson, 1997). Use of a single-molecule approach finds that translation by the ribosome occurs through a reiterative process of translocation and pausing. A single translocation event covers three nucleotides, in which three substeps are detected, and is rapid. The pauses, which are longer and whose length depends on the mRNA's secondary structure, are rate-determining and are composed of at least two processes.