It is a challenge to identify patients who, after undergoing potentially curative treatment for hepatocellular carcinoma, are at greatest risk for recurrence. Such high-risk patients could receive novel interventional measures. An obstacle to the development of genome-based predictors of outcome in patients with hepatocellular carcinoma has been the lack of a means to carry out genomewide expression profiling of fixed, as opposed to frozen, tissue.We aimed to demonstrate the feasibility of gene-expression profiling of more than 6000 human genes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. We applied the method to tissues from 307 patients with hepatocellular carcinoma, from four series of patients, to discover and validate a gene-expression signature associated with survival.The expression-profiling method for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue was highly effective: samples from 90% of the patients yielded data of high quality, including samples that had been archived for more than 24 years. Gene-expression profiles of tumor tissue failed to yield a significant association with survival. In contrast, profiles of the surrounding nontumoral liver tissue were highly correlated with survival in a training set of tissue samples from 82 Japanese patients, and the signature was validated in tissues from an independent group of 225 patients from the United States and Europe (P=0.04).We have demonstrated the feasibility of genomewide expression profiling of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and have shown that a reproducible gene-expression signature correlated with survival is present in liver tissue adjacent to the tumor in patients with hepatocellular carcinoma.

Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly heterogeneous disease, and prior attempts to develop genomic-based classification for HCC have yielded highly divergent results, indicating difficulty in identifying unified molecular anatomy. We performed a meta-analysis of gene expression profiles in data sets from eight independent patient cohorts across the world. In addition, aiming to establish the real world applicability of a classification system, we profiled 118 formalin-fixed, paraffin-embedded tissues from an additional patient cohort. A total of 603 patients were analyzed, representing the major etiologies of HCC (hepatitis B and C) collected from Western and Eastern countries. We observed three robust HCC subclasses (termed S1, S2, and S3), each correlated with clinical parameters such as tumor size, extent of cellular differentiation, and serum α-fetoprotein levels. An analysis of the components of the signatures indicated that S1 reflected aberrant activation of the WNT signaling pathway, S2 was characterized by proliferation as well as MYC and AKT activation, and S3 was associated with hepatocyte differentiation. Functional studies indicated that the WNT pathway activation signature characteristic of S1 tumors was not simply the result of β-catenin mutation but rather was the result of transforming growth factor-β activation, thus representing a new mechanism of WNT pathway activation in HCC. These experiments establish the first consensus classification framework for HCC based on gene expression profiles and highlight the power of integrating multiple data sets to define a robust molecular taxonomy of the disease. [Cancer Res 2009;69(18):7385–92]

PURPOSE The immunomodulatory effect of lenvatinib (a multikinase inhibitor) on tumor microenvironments may contribute to antitumor activity when combined with programmed death receptor-1 (PD-1) signaling inhibitors in hepatocellular carcinoma (HCC). We report results from a phase Ib study of lenvatinib plus pembrolizumab (an anti–PD-1 antibody) in unresectable HCC (uHCC). PATIENTS AND METHODS In this open-label multicenter study, patients with uHCC received lenvatinib (bodyweight ≥ 60 kg, 12 mg; < 60 kg, 8 mg) orally daily and pembrolizumab 200 mg intravenously on day 1 of a 21-day cycle. The study included a dose-limiting toxicity (DLT) phase and an expansion phase (first-line patients). Primary objectives were safety/tolerability (DLT phase), and objective response rate (ORR) and duration of response (DOR) by modified RECIST (mRECIST) and RECIST version 1.1 (v1.1) per independent imaging review (IIR; expansion phase). RESULTS A total of 104 patients were enrolled. No DLTs were reported (n = 6) in the DLT phase; 100 patients (expansion phase; included n = 2 from DLT phase) had received no prior systemic therapy and had Barcelona Clinic Liver Cancer stage B (n = 29) or C disease (n = 71). At data cutoff, 37% of patients remained on treatment. Median duration of follow-up was 10.6 months (95% CI, 9.2 to 11.5 months). Confirmed ORRs by IIR were 46.0% (95% CI, 36.0% to 56.3%) per mRECIST and 36.0% (95% CI, 26.6% to 46.2%) per RECIST v1.1. Median DORs by IIR were 8.6 months (95% CI, 6.9 months to not estimable [NE]) per mRECIST and 12.6 months (95% CI, 6.9 months to NE) per RECIST v1.1. Median progression-free survival by IIR was 9.3 months per mRECIST and 8.6 months per RECIST v1.1. Median overall survival was 22 months. Grade ≥ 3 treatment-related adverse events occurred in 67% (grade 5, 3%) of patients. No new safety signals were identified. CONCLUSION Lenvatinib plus pembrolizumab has promising antitumor activity in uHCC. Toxicities were manageable, with no unexpected safety signals.

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection leads to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Antiviral agents are thought to reduce HCC development, but agents such as lamivudine (LAM) have a high rate of drug resistance. We compared the incidence of HCC in 472 entecavir (ETV)-treated patients and 1,143 nontreated HBV patients (control group). Propensity score matching eliminated the baseline differences, resulting in a sample size of 316 patients per cohort. The drug mutation resistance was 0.8% (4/472) in the ETV group. The cumulative HCC incidence rates at 5 years were 3.7% and 13.7% for the ETV and control groups, respectively (P < 0.001). Cox proportional hazard regression analysis, adjusted for a number of known HCC risk factors, showed that patients in the ETV group were less likely to develop HCC than those in the control group (hazard ratio: 0.37; 95% confidence interval: 0.15-0.91; P = 0.030). Both cohorts were applied in three previously reported risk scales and risk scores were generated based on age, gender, cirrhosis status, levels of alanine aminotransferase, hepatitis B e antigen, baseline HBV DNA, albumin, and bilirubin. The greatest HCC risk reduction occurred in high-risk patients who scored higher on respective risk scales. In sub analyses, we compared treatment effect between nucleos(t)ide analogs, which included matched LAM-treated patients without rescue therapy (n = 182). We found HCC suppression effect greater in ETV-treated (P < 0.001) than nonrescued LAM-treated (P = 0.019) cirrhosis patients when they were compared with the control group. Conclusion: Long-term ETV treatment may reduce the incidence of HCC in HBV-infected patients. The treatment effect was greater in patients at higher risk of HCC. (HEPATOLOGY 2013)

The activity of interferon (IFN) is not elucidated from the viewpoint of cancer prevention in chronic hepatitis C patients en masse . The hepatocellular carcinogenesis rate was analyzed statistically in 1,643 patients with chronic hepatitis C: 1,191 patients with IFN therapy and 452 without IFN therapy. Hepatocellular carcinogenesis rates in the treated and untreated groups were 2.1% and 4.8% at the end of the 5th year, and 7.6% and 12.4% at the 10th year, respectively ( P = .0036). Multivariate analysis showed that IFN slightly decreased the risk of carcinogenesis by 33%, compared with that of untreated patients ( P = .14), adjusting for the confounding effects of age, fibrotic stage, gender, and γ–glutamyl transpeptidase (GGTP) value. Among 1,191 patients with IFN, 461 patients attained persistent loss of hepatitis C virus (HCV) RNA, and the other 145 patients retained normal alanine transaminase (ALT) values without loss of HCV RNA. The hazard of carcinogenesis in these 606 patients with persistent normal ALT with or without HCV–RNA clearance was significantly lower than that of untreated patients (hazard ratio: 0.32; P = .012) and that of the abnormal aminotransferase group. Among patients with chronic hepatitis C, IFN significantly decreased the hepatocellular carcinogenesis rate in those patients with normal or persistent low ALT values

The aim of this study was to elucidate the rate of development to cirrhosis and the rate of appearance of hepatocellular carcinoma in chronic viral hepatitis and to assess the risk factors for the development of disease in 2215 consecutive patients with viral hepatitis who were prospectively studied for a median observation period of 4.1 years.The rates of development to cirrhosis were 7.6%, 21.7%, and 32.2%, at the 5th, 10th, and 15th year, respectively. The carcinogenesis rates were 3.4%, 10.5%, and 22.4% at the 5th, 10th, and 15th year, respectively. The appearance rates of cancer in 645 patients with only hepatitis B surface antigen and in 1500 patients with only anti-hepatitis C virus antibodies were 2.1% and 4.8% at the 5th year, 4.9% and 13.6% at the 10th year, and 18.8% and 26.0% at the 15th year, respectively. The proportional hazard model identified that the amount of alcohol intake (p= 0.0002) and the indocyanine green retention rate (p= 0.022) were independently associated with carcinogenesis in hepatitis type B; and stage of hepatitis (p<0.0001), gamma-glutamyl transpeptidase (p= 0.0046), history of blood transfusion (p=0.0093), albumin (p=0.012), and amount of alcohol intake (p= 0.031) were independently associated with the carcinogenesis rate in hepatitis type C. Although the severity of portal fibrosis was closely correlated with the future disease development and carcinogenesis in chronic hepatitis C, it was not a good predictor in chronic hepatitis B.These epidemiological results suggest that there are some differences in the activity and modes of disease progression and cancer promotion between hepatitis B virus infection and hepatitis C virus infection.

Hepatocellular carcinoma (HCC) occurs in patients with hepatitis C virus-RNA positive chronic liver disease. It is important to prevent HCC with drug administration.A retrospective study was undertaken to evaluate the long term preventive effect of Stronger Neo-Minophagen C (SNMC) on HCC development. SNMC is a Japanese medicine that is commonly administered to patients with chronic hepatitis C to improve the serum alanine aminotransferase (ALT) level. Of 453 patients diagnosed with chronic hepatitis C retrospectively in the study hospital between January 1979 and April 1984, 84 patients (Group A) had been treated with SNMC; SNMC was given at a dose of 100 mL daily for 8 weeks, then 2-7 times a week for 2-16 years (median, 10.1 years). Another group of 109 patients (Group B) could not be treated with SNMC or interferon for a long period of time (median, 9.2 years) and were given other herbal medicine (such as vitamin K). The patients were retrospectively monitored, and the cumulative incidence of HCC and risk factors for HCC were examined.The 10th-year rates of cumulative HCC incidence for Groups A and B were 7% and 12%, respectively, and the 15th-year rates were 12% and 25%. By Cox regression analysis, the relative risk of HCC incidence in patients not treated with SNMC (Group B) was 2.49 compared with that of patients treated with SNMC (Group A).In this study, long term administration of SNMC in the treatment of chronic hepatitis C was effective in preventing liver carcinogenesis.

Background & AimsIn approximately 70% of patients with hepatocellular carcinoma (HCC) treated by resection or ablation, disease recurs within 5 years. Although gene expression signatures have been associated with outcome, there is no method to predict recurrence based on combined clinical, pathology, and genomic data (from tumor and cirrhotic tissue). We evaluated gene expression signatures associated with outcome in a large cohort of patients with early stage (Barcelona–Clinic Liver Cancer 0/A), single-nodule HCC and heterogeneity of signatures within tumor tissues.MethodsWe assessed 287 HCC patients undergoing resection and tested genome-wide expression platforms using tumor (n = 287) and adjacent nontumor, cirrhotic tissue (n = 226). We evaluated gene expression signatures with reported prognostic ability generated from tumor or cirrhotic tissue in 18 and 4 reports, respectively. In 15 additional patients, we profiled samples from the center and periphery of the tumor, to determine stability of signatures. Data analysis included Cox modeling and random survival forests to identify independent predictors of tumor recurrence.ResultsGene expression signatures that were associated with aggressive HCC were clustered, as well as those associated with tumors of progenitor cell origin and those from nontumor, adjacent, cirrhotic tissues. On multivariate analysis, the tumor-associated signature G3-proliferation (hazard ratio [HR], 1.75; P = .003) and an adjacent poor-survival signature (HR, 1.74; P = .004) were independent predictors of HCC recurrence, along with satellites (HR, 1.66; P = .04). Samples from different sites in the same tumor nodule were reproducibly classified.ConclusionsWe developed a composite prognostic model for HCC recurrence, based on gene expression patterns in tumor and adjacent tissues. These signatures predict early and overall recurrence in patients with HCC, and complement findings from clinical and pathology analyses. In approximately 70% of patients with hepatocellular carcinoma (HCC) treated by resection or ablation, disease recurs within 5 years. Although gene expression signatures have been associated with outcome, there is no method to predict recurrence based on combined clinical, pathology, and genomic data (from tumor and cirrhotic tissue). We evaluated gene expression signatures associated with outcome in a large cohort of patients with early stage (Barcelona–Clinic Liver Cancer 0/A), single-nodule HCC and heterogeneity of signatures within tumor tissues. We assessed 287 HCC patients undergoing resection and tested genome-wide expression platforms using tumor (n = 287) and adjacent nontumor, cirrhotic tissue (n = 226). We evaluated gene expression signatures with reported prognostic ability generated from tumor or cirrhotic tissue in 18 and 4 reports, respectively. In 15 additional patients, we profiled samples from the center and periphery of the tumor, to determine stability of signatures. Data analysis included Cox modeling and random survival forests to identify independent predictors of tumor recurrence. Gene expression signatures that were associated with aggressive HCC were clustered, as well as those associated with tumors of progenitor cell origin and those from nontumor, adjacent, cirrhotic tissues. On multivariate analysis, the tumor-associated signature G3-proliferation (hazard ratio [HR], 1.75; P = .003) and an adjacent poor-survival signature (HR, 1.74; P = .004) were independent predictors of HCC recurrence, along with satellites (HR, 1.66; P = .04). Samples from different sites in the same tumor nodule were reproducibly classified. We developed a composite prognostic model for HCC recurrence, based on gene expression patterns in tumor and adjacent tissues. These signatures predict early and overall recurrence in patients with HCC, and complement findings from clinical and pathology analyses.

Ectopic lymphoid-like structures (ELSs) are often observed in cancer, yet their function is obscure. Although ELSs signify good prognosis in certain malignancies, we found that hepatic ELSs indicated poor prognosis for hepatocellular carcinoma (HCC). We studied an HCC mouse model that displayed abundant ELSs and found that they constituted immunopathological microniches wherein malignant hepatocyte progenitor cells appeared and thrived in a complex cellular and cytokine milieu until gaining self-sufficiency. The egress of progenitor cells and tumor formation were associated with the autocrine production of cytokines previously provided by the niche. ELSs developed via cooperation between the innate immune system and adaptive immune system, an event facilitated by activation of the transcription factor NF-κB and abolished by depletion of T cells. Such aberrant immunological foci might represent new targets for cancer therapy.

The aim of this study was to determine the incidence and risk factors of hepatocellular carcinoma (HCC), and to elucidate the utility of two non-invasive predictive procedures for liver fibrosis: the aspartate aminotransferase (AST) to platelet ratio index (APRI) and the BARD score (which includes the following three variables: body mass index, AST/alanine aminotransferase ratio, and diabetes) in the prediction of HCC in a large population of Japanese patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).This was a retrospective cohort study conducted at a public hospital. Study subjects included 6,508 patients with NAFLD diagnosed by ultrasonography. The median follow-up period was 5.6 years. The primary end point was the onset of HCC. Evaluation was performed using Kaplan-Meier methodology and Cox's proportional hazards analysis.In all, 16 (0.25%) new cases with HCC were diagnosed during the study. The cumulative rates of NAFLD-related HCC were 0.02% at year 4, 0.19% at year 8, and 0.51% at year 12. The annual rate of new HCC was 0.043%. Multivariate analysis identified serum AST level ≥40 IU/L (hazard ratio (HR): 8.20; 95% confidence interval (95% CI): 2.56-26.26; P<0.001), platelet count <150 × 10(3)/μl (HR: 7.19; 95% CI: 2.26-23.26; P=0.001), age ≥60 years (HR: 4.27; 95% CI: 1.30-14.01; P=0.017), and diabetes (HR: 3.21; 95% CI: 1.09-9.50; P=0.035) as independent risk factors for HCC. With regard to the APRI, 184 patients (2.83%) were considered to have significant fibrosis (equivalent to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) stage 3-4). The cumulative rate of HCC was significantly higher in this group (HR: 25.03; 95% CI: 9.02-69.52; P<0.001). In contrast, regarding the BARD score, 3,841 (59%) patients were considered to have advanced fibrosis (NASH stage 3-4). However, no significant associations between the BARD score and the incidence of HCC were observed (HR: 1.16; 95% CI: 0.40-3.37; P=0.780).This retrospective study indicates that the annual incidence rate of HCC among Japanese NAFLD patients is low. Elderly NAFLD patients with diabetes, elevated serum AST, and especially thrombocytopenia (suggested to be associated with advanced liver fibrosis) should be monitored carefully during follow-up that includes using the APRI to ensure early diagnosis and treatment of HCC.