The start-up of the Linac Coherent Light Source (LCLS), the new femtosecond hard X-ray laser facility in Stanford, California, has brought high expectations of a new era for biological imaging. The intense, ultrashort X-ray pulses allow diffraction imaging of small structures before radiation damage occurs. Two papers in this issue of Nature present proof-of-concept experiments showing the LCLS in action. Chapman et al. tackle structure determination from nanocrystals of macromolecules that cannot be grown in large crystals. They obtain more than three million diffraction patterns from a stream of nanocrystals of the membrane protein photosystem I, and assemble a three-dimensional data set for this protein. Seibert et al. obtain images of a non-crystalline biological sample, mimivirus, by injecting a beam of cooled mimivirus particles into the X-ray beam. The start-up of the new femtosecond hard X-ray laser facility in Stanford, the Linac Coherent Light Source, has brought high expectations for a new era for biological imaging. The intense, ultrashort X-ray pulses allow diffraction imaging of small structures before radiation damage occurs. This new capability is tested for the problem of imaging a non-crystalline biological sample. Images of mimivirus are obtained, the largest known virus with a total diameter of about 0.75 micrometres, by injecting a beam of cooled mimivirus particles into the X-ray beam. The measurements indicate no damage during imaging and prove the concept of this imaging technique. X-ray lasers offer new capabilities in understanding the structure of biological systems, complex materials and matter under extreme conditions1,2,3,4. Very short and extremely bright, coherent X-ray pulses can be used to outrun key damage processes and obtain a single diffraction pattern from a large macromolecule, a virus or a cell before the sample explodes and turns into plasma1. The continuous diffraction pattern of non-crystalline objects permits oversampling and direct phase retrieval2. Here we show that high-quality diffraction data can be obtained with a single X-ray pulse from a non-crystalline biological sample, a single mimivirus particle, which was injected into the pulsed beam of a hard-X-ray free-electron laser, the Linac Coherent Light Source5. Calculations indicate that the energy deposited into the virus by the pulse heated the particle to over 100,000 K after the pulse had left the sample. The reconstructed exit wavefront (image) yielded 32-nm full-period resolution in a single exposure and showed no measurable damage. The reconstruction indicates inhomogeneous arrangement of dense material inside the virion. We expect that significantly higher resolutions will be achieved in such experiments with shorter and brighter photon pulses focused to a smaller area. The resolution in such experiments can be further extended for samples available in multiple identical copies.

Size Matters Less X-ray crystallography is a central research tool for uncovering the structures of proteins and other macromolecules. However, its applicability typically requires growth of large crystals, in part because a sufficient number of molecules must be present in the lattice for the sample to withstand x-ray—induced damage. Boutet et al. (p. 362 , published online 31 May) now demonstrate that the intense x-ray pulses emitted by a free-electron laser source can yield data in few enough exposures to uncover the high-resolution structure of microcrystals.

In order to address the specific needs of the emerging technique of `serial femtosecond crystallography', in which structural information is obtained from small crystals illuminated by an X-ray free-electron laser, a new software suite has been created. The constituent programs deal with viewing, indexing, integrating, merging and evaluating the quality of the data, and also simulating patterns. The specific challenges addressed chiefly concern the indexing and integration of large numbers of diffraction patterns in an automated manner, and so the software is designed to be fast and to make use of multi-core hardware. Other constituent programs deal with the merging and scaling of large numbers of intensities from randomly oriented snapshot diffraction patterns. The suite uses a generalized representation of a detector to ease the use of more complicated geometries than those familiar in conventional crystallography. The suite is written in C with supporting Perl and shell scripts, and is available as source code under version 3 or later of the GNU General Public License.

Femtosecond X-ray pulses were used to obtain diffraction data on photosystem II, revealing conformational changes as the complex transitions from the dark S1 state to the double-pumped S3 state; the time-resolved serial femtosecond crystallography technique enables structural determination of protein conformations that are highly prone to traditional radiation damage. It has recently been shown that extremely short and intense radiation pulses from X-ray free-electron lasers can be used to obtain diffraction data on nanometre- to micrometre-sized protein crystals before the crystal suffers radiation damage. The hope is that this 'serial femtosecond crystallography' (SFX) approach will produce structures of proteins and protein complexes that do not yield well-ordered macroscopic crystals. These authors collected time-resolved SFX data on small crystals of photosystem II of photosynthesis during its transition from the 'dark' S1 state to the double-excited S3 state. At present the resolution of this technique is moderate, but it is sufficient to reveal significant conformational changes at the Mn4CaO5 cluster at the heart of the oxygen evolving complex and at the electron acceptor site. Photosynthesis, a process catalysed by plants, algae and cyanobacteria converts sunlight to energy thus sustaining all higher life on Earth. Two large membrane protein complexes, photosystem I and II (PSI and PSII), act in series to catalyse the light-driven reactions in photosynthesis. PSII catalyses the light-driven water splitting process, which maintains the Earth’s oxygenic atmosphere1. In this process, the oxygen-evolving complex (OEC) of PSII cycles through five states, S0 to S4, in which four electrons are sequentially extracted from the OEC in four light-driven charge-separation events. Here we describe time resolved experiments on PSII nano/microcrystals from Thermosynechococcus elongatus performed with the recently developed2 technique of serial femtosecond crystallography. Structures have been determined from PSII in the dark S1 state and after double laser excitation (putative S3 state) at 5 and 5.5 Å resolution, respectively. The results provide evidence that PSII undergoes significant conformational changes at the electron acceptor side and at the Mn4CaO5 core of the OEC. These include an elongation of the metal cluster, accompanied by changes in the protein environment, which could allow for binding of the second substrate water molecule between the more distant protruding Mn (referred to as the ‘dangler’ Mn) and the Mn3CaOx cubane in the S2 to S3 transition, as predicted by spectroscopic and computational studies3,4. This work shows the great potential for time-resolved serial femtosecond crystallography for investigation of catalytic processes in biomolecules.

Diffraction Before Destruction A bottleneck in x-ray crystallography is the growth of well-ordered crystals large enough to obtain high-resolution diffraction data within an exposure that limits radiation damage. Serial femtosecond crystallography promises to overcome these constraints by using short intense pulses that out-run radiation damage. A stream of crystals is flowed across the free-electron beam and for each pulse, diffraction data is recorded from a single crystal before it is destroyed. Redecke et al. (p. 227 , published online 29 November; see the Perspective by Helliwell ) used this technique to determine the structure of an enzyme from Trypanosoma brucei , the parasite that causes sleeping sickness, from micron-sized crystals grown within insect cells. The structure shows how this enzyme, which is involved in degradation of host proteins, is natively inhibited prior to activation, which could help in the development of parasite-specific inhibitors.

X-ray free-electron lasers have enabled new approaches to the structural determination of protein crystals that are too small or radiation-sensitive for conventional analysis1. For sufficiently short pulses, diffraction is collected before significant changes occur to the sample, and it has been predicted that pulses as short as 10 fs may be required to acquire atomic-resolution structural information1,2,3,4. Here, we describe a mechanism unique to ultrafast, ultra-intense X-ray experiments that allows structural information to be collected from crystalline samples using high radiation doses without the requirement for the pulse to terminate before the onset of sample damage. Instead, the diffracted X-rays are gated by a rapid loss of crystalline periodicity, producing apparent pulse lengths significantly shorter than the duration of the incident pulse. The shortest apparent pulse lengths occur at the highest resolution, and our measurements indicate that current X-ray free-electron laser technology5 should enable structural determination from submicrometre protein crystals with atomic resolution. Researchers describe a mechanism capable of compressing fast and intense X-ray pulses through the rapid loss of crystalline periodicity. It is hoped that this concept, combined with X-ray free-electron laser technology, will allow scientists to obtain structural information at atomic resolutions.

We present a proof-of-concept three-dimensional reconstruction of the giant mimivirus particle from experimentally measured diffraction patterns from an x-ray free-electron laser. Three-dimensional imaging requires the assembly of many two-dimensional patterns into an internally consistent Fourier volume. Since each particle is randomly oriented when exposed to the x-ray pulse, relative orientations have to be retrieved from the diffraction data alone. We achieve this with a modified version of the expand, maximize and compress algorithm and validate our result using new methods.Received 3 October 2014DOI:https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.114.098102© 2015 American Physical Society

We demonstrate the use of an X-ray free electron laser synchronized with an optical pump laser to obtain X-ray diffraction snapshots from the photoactivated states of large membrane protein complexes in the form of nanocrystals flowing in a liquid jet.Light-induced changes of Photosystem I-Ferredoxin co-crystals were observed at time delays of 5 to 10 µs after excitation.The result correlates with the microsecond kinetics of electron transfer from Photosystem I to ferredoxin.The undocking process that follows the electron transfer leads to large rearrangements in the crystals that will terminally lead to the disintegration of the crystals.We describe the experimental setup and obtain the first timeresolved femtosecond serial X-ray crystallography results from an