A hybrid receptor was constructed that contained the extracellular binding domain of the human growth hormone (hGH) receptor linked to the transmembrane and intracellular domains of the murine granulocyte colony-stimulating factor receptor. Addition of hGH to a myeloid leukemia cell line (FDC-P1) that expressed the hybrid receptor caused proliferation of these cells. The mechanism for signal transduction of the hybrid receptor required dimerization because monoclonal antibodies to the hGH receptor were agonists whereas their monovalent fragments were not. Receptor dimerization occurs sequentially--a receptor binds to site 1 on hGH, and then a second receptor molecule binds to site 2 on hGH. On the basis of this sequential mechanism, which may occur in many other cytokine receptors, inactive hGH analogs were designed that were potent antagonists to hGH-induced cell proliferation. Such antagonists could be useful for treating clinical conditions of hGH excess, such as acromegaly.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a homodimeric hormone that induces proliferation of endothelial cells through binding to the kinase domain receptor and the Fms-like tyrosine kinase receptor (Flt-1), the extracellular portions of which consist of seven immunoglobulin domains. We show that the second and third domains of Flt-1 are necessary and sufficient for binding VEGF with near-native affinity, and that domain 2 alone binds only 60-fold less tightly than wild-type. The crystal structure of the complex between VEGF and the second domain of Flt-1 shows domain 2 in a predominantly hydrophobic interaction with the "poles" of the VEGF dimer. Based on this structure and on mutational data, we present a model of VEGF bound to the first four domains of Flt-1.

The Fab portion of a humanized antibody (Fab-12; IgG form known as rhuMAb VEGF) to vascular endothelial growth factor (VEGF) has been affinity-matured through complementarity-determining region (CDR) mutation, followed by affinity selection using monovalent phage display. After stringent binding selections at 37 degrees C, with dissociation (off-rate) selection periods of several days, high affinity variants were isolated from CDR-H1, H2, and H3 libraries. Mutations were combined to obtain cumulatively tighter-binding variants. The final variant identified here, Y0317, contained six mutations from the parental antibody. In vitro cell-based assays show that four mutations yielded an improvement of about 100-fold in potency for inhibition of VEGF-dependent cell proliferation by this variant, consistent with the equilibrium binding constant determined from kinetics experiments at 37 degrees C. Using X-ray crystallography, we determined a high-resolution structure of the complex between VEGF and the affinity-matured Fab fragment. The overall features of the binding interface seen previously with wild-type are preserved, and many contact residues are maintained in precise alignment in the superimposed structures. However, locally, we see evidence for improved contacts between antibody and antigen, and two mutations result in increased van der Waals contact and improved hydrogen bonding. Site-directed mutants confirm that the most favorable improvements as judged by examination of the complex structure, in fact, have the greatest impact on free energy of binding. In general, the final antibody has improved affinity for several VEGF variants as compared with the parental antibody; however, some contact residues on VEGF differ in their contribution to the energetics of Fab binding. The results show that small changes even in a large protein-protein binding interface can have significant effects on the energetics of interaction.

Formation of a complex between Apo2L (also called TRAIL) and its signaling receptors, DR4 and DR5, triggers apoptosis by inducing the oligomerization of intracellular death domains. We report the crystal structure of the complex between Apo2L and the ectodomain of DR5. The structure shows three elongated receptors snuggled into long crevices between pairs of monomers of the homotrimeric ligand. The interface is divided into two distinct patches, one near the bottom of the complex close to the receptor cell surface and one near the top. Both patches contain residues that are critical for high-affinity binding. A comparison to the structure of the lymphotoxin-receptor complex suggests general principles of binding and specificity for ligand recognition in the TNF receptor superfamily.

The interface between antibody and antigen is often depicted as a lock and key, suggesting that an antibody surface can accommodate only one antigen. Here, we describe an antibody with an antigen binding site that binds two distinct proteins with high affinity. We isolated a variant of Herceptin, a therapeutic monoclonal antibody that binds the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), on the basis of its ability to simultaneously interact with vascular endothelial growth factor (VEGF). Crystallographic and mutagenesis studies revealed that distinct amino acids of this antibody, called bH1, engage HER2 and VEGF energetically, but there is extensive overlap between the antibody surface areas contacting the two antigens. An affinity-improved version of bH1 inhibits both HER2- and VEGF-mediated cell proliferation in vitro and tumor progression in mouse models. Such “two-in-one” antibodies challenge the monoclonal antibody paradigm of one binding site, one antigen. They could also provide new opportunities for antibody-based therapy.

To fully assess the role of VEGF-A in tumor angiogenesis, antibodies that can block all sources of vascular endothelial growth factor (VEGF) are desired. Selectively targeting tumor-derived VEGF overlooks the contribution of host stromal VEGF. Other strategies, such as targeting VEGF receptors directly or using receptor decoys, result in inhibiting not only VEGF-A but also VEGF homologues (e.g. placental growth factor, VEGF-B, and VEGF-C), which may play a role in angiogenesis. Here we report the identification of novel anti-VEGF antibodies, B20 and G6, from synthetic antibody phage libraries, which block both human and murine VEGF action in vitro. Their affinity-improved variants completely inhibit three human tumor xenografts in mice of skeletal muscle, colorectal, and pancreatic origins (A673, HM-7, and HPAC). Avastin, which only inhibits the tumor-derived human VEGF, is ∼90% effective at inhibiting HM-7 and A673 growth but is <50% effective at inhibiting HPAC growth. Indeed, HPAC tumors contain more host stroma invasion and stroma-derived VEGF than other tumors. Thus, the functional contribution of stromal VEGF varies greatly among tumors, and systemic blockade of both tumor and stroma-derived VEGF is sufficient for inhibiting the growth of tumor xenografts. To fully assess the role of VEGF-A in tumor angiogenesis, antibodies that can block all sources of vascular endothelial growth factor (VEGF) are desired. Selectively targeting tumor-derived VEGF overlooks the contribution of host stromal VEGF. Other strategies, such as targeting VEGF receptors directly or using receptor decoys, result in inhibiting not only VEGF-A but also VEGF homologues (e.g. placental growth factor, VEGF-B, and VEGF-C), which may play a role in angiogenesis. Here we report the identification of novel anti-VEGF antibodies, B20 and G6, from synthetic antibody phage libraries, which block both human and murine VEGF action in vitro. Their affinity-improved variants completely inhibit three human tumor xenografts in mice of skeletal muscle, colorectal, and pancreatic origins (A673, HM-7, and HPAC). Avastin, which only inhibits the tumor-derived human VEGF, is ∼90% effective at inhibiting HM-7 and A673 growth but is <50% effective at inhibiting HPAC growth. Indeed, HPAC tumors contain more host stroma invasion and stroma-derived VEGF than other tumors. Thus, the functional contribution of stromal VEGF varies greatly among tumors, and systemic blockade of both tumor and stroma-derived VEGF is sufficient for inhibiting the growth of tumor xenografts. Targeting angiogenesis, the process of new blood vessel formation, has been validated as an effective approach for cancer therapy by the recent Food and Drug Administration approval of bevacizumab (Avastin™ antibody), a blocking antibody against vascular endothelial growth factor A (VEGF-A or VEGF), 5The abbreviations used are: VEGFvascular endothelial growth factorh-VEGFhuman VEGFm-VEGFmurine VEGFVEGFRVEGF receptorPlGFplacental growth factorFabantigen binding fragmentELISAenzyme-linked immunosorbent assayECDextracellular domainBSAbovine serum albuminHRPhorseradish peroxidasePBSphosphate-buffered salineCHAPS3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acidHUVEChuman umbilical vein endothelial cellsCDRcomplementarity determining region. for the treatment of metastatic colorectal cancer (1Hurwitz H. Fehrenbacher L. Novotny W. Cartwright T. Hainsworth J. Heim W. Berlin J. Baron A. Griffing S. Holmgren E. Ferrara N. Fyfe G. Rogers B. Ross R. Kabbinavar F. N. Engl. J. Med. 2004; 350: 2335-2342Crossref PubMed Scopus (9270) Google Scholar, 2Ferrara N. Hillan K.J. Gerber H.P. Novotny W. Nat. Rev. Drug Discov. 2004; 3: 391-401Crossref PubMed Scopus (2132) Google Scholar). Although many pro- or anti-angiogenic factors have been implicated in tumor angiogenesis (3Hanahan D. Christofori G. Naik P. Arbeit J. Eur. J. Cancer. 1996; 32: 2386-2393Abstract Full Text PDF Scopus (220) Google Scholar, 4Yancopoulos G.D. Davis S. Gale N.W. Rudge J.S. Wiegand S.J. Holash J. Nature. 2000; 407: 242-248Crossref PubMed Scopus (3298) Google Scholar), the efficacy of a specific blocking antibody against VEGF in suppressing cancer progression emphasizes the key role of VEGF. However, as VEGF is a member of a family that also includes VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, and placental growth factor (PlGF) with overlapping activities in three tyrosine kinase receptors, VEGFR1 (Flt-1), VEGFR2 (KDR, or Flk-1 in mouse), and VEGFR3 (5Shibuya M. Ito A. Claesson Welsh L. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999; 237: 59-83PubMed Google Scholar, 6Ferrara N. Endocr. Rev. 2004; 25: 581-611Crossref PubMed Scopus (3009) Google Scholar), the questions whether VEGF-A has a nonredundant role in tumor angiogenesis and whether blocking VEGF-A is sufficient to inhibit tumor growth are fundamental. vascular endothelial growth factor human VEGF murine VEGF VEGF receptor placental growth factor antigen binding fragment enzyme-linked immunosorbent assay extracellular domain bovine serum albumin horseradish peroxidase phosphate-buffered saline 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid human umbilical vein endothelial cells complementarity determining region. Systemic blockade using specific blocking antibodies against tumor-derived VEGF (7Kim K.J. Li B. Winer J. Armanini M. Gillett N. Phillips H.S. Ferrara N. Nature. 1993; 362: 841-844Crossref PubMed Scopus (3363) Google Scholar) or genetic deletion of VEGF in tumor cells (8Shi Y.P. Ferrara N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 254: 480-483Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 9Grunstein J. Roberts W.G. Mathieu-Costello O. Hanahan D. Johnson R.S. Cancer Res. 1999; 59: 1592-1598PubMed Google Scholar, 10Inoue M. Hager J.H. Ferrara N. Gerber H.P. Hanahan D. Cancer Cell. 2002; 1: 193-202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (336) Google Scholar) severely suppressed tumor growth in mouse models. However, residual growth or resistance of human tumor xenografts in nude mice treated with antibodies against human VEGF has been reported (7Kim K.J. Li B. Winer J. Armanini M. Gillett N. Phillips H.S. Ferrara N. Nature. 1993; 362: 841-844Crossref PubMed Scopus (3363) Google Scholar, 11Gerber H.P. Kowalski J. Sherman D. Eberhard D.A. Ferrara N. Cancer Res. 2000; 60: 6253-6258PubMed Google Scholar). One possibility is that residual tumor angiogenesis and growth are supported by murine VEGF, which is produced by host stromal cells recruited into the tumor (11Gerber H.P. Kowalski J. Sherman D. Eberhard D.A. Ferrara N. Cancer Res. 2000; 60: 6253-6258PubMed Google Scholar). Significant VEGF expression has been demonstrated by fibroblast and immune cells that surround and invade the tumor mass (12Hlatky L. Tsionou C. Hahnfeldt P. Coleman C. Cancer Res. 1994; 54: 6083-6086PubMed Google Scholar, 13Fukumura D. Xavier R. Sugiura T. Chen Y. Park E.C. Lu N. Selig M. Nielsen G. Taksir T. Jain R.K. Seed B. Cell. 1998; 94: 715-725Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (847) Google Scholar, 14Kishimoto J. Ehama R. Ge Y. Kobayashi T. Nishiyama T. Detmar M. Burgeson R.E. Am. J. Pathol. 2000; 157: 103-110Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar, 15Coussens L.M. Raymond W.W. Bergers G. Laig-Webster M. Behrendtsen O. Werb Z. Caughey G.H. Hanahan D. Genes Dev. 1999; 13: 1382-1397Crossref PubMed Scopus (808) Google Scholar, 16Barbera-Guillem E. Nyhus J.K. Wolford C.C. Friece C.R. Sampsel J.W. Cancer Res. 2002; 62: 7042-7049PubMed Google Scholar), although the significance and extent of the contribution of such stroma-derived VEGF to tumor growth remain unclear. Other possible explanations for incomplete tumor growth inhibition following treatment with anti-VEGF antibodies include the following: insufficient binding affinity or tumor penetration; VEGF-related molecules (e.g. PlGF and VEGF-C) that may act independently or in concert with VEGF-A in promoting angiogenesis (17Autiero M. Waltenberger J. Communi D. Kranz A. Moons L. Lambrechts D. Kroll J. Plaisance S. De Mol M. Bono F. Kliche S. Fellbrich G. Ballmer-Hofer K. Maglione D. Mayr-Beyrle U. Dewerchin M. Dombrowski S. Stanimirovic D. Van Hummelen P. Dehio C. Hicklin D.J. Persico G. Herbert J.M. Shibuya M. Collen D. Conway E.M. Carmeliet P. Nat. Med. 2003; 9: 936-943Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar); VEGF-independent angiogenesis pathways; and “vascular mimicry” by tumor cells (18Hendrix M.J. Seftor E.A. Hess A.R. Seftor R.E. Nat. Rev. Cancer. 2003; 3: 411-421Crossref PubMed Scopus (710) Google Scholar). To address these issues, some of us (11Gerber H.P. Kowalski J. Sherman D. Eberhard D.A. Ferrara N. Cancer Res. 2000; 60: 6253-6258PubMed Google Scholar) and others (19Kim E.S. Serur A. Huang J. Manley C.A. McCrudden K.W. Frischer J.S. Soffer S. Ring L. New T. Zabski S. Rudge J.S. Holash J. Yancopoulos G.D. Kandel J.J. Yamashiro D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 11399-11404Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar) have used the soluble VEGF receptor extracellular domain (ECD) fragment, such as VEGFR1 Ig domain 1-3 Fc fusion (VEGFR1D1-3-Fc) or VEGF trap (VEGFR1D2-VEGFR2D3-Fc), and showed more complete inhibition of human xenografts relative to antibodies against tumor-derived VEGF. It was reasoned that these receptor decoys can block both human and murine VEGF (11Gerber H.P. Kowalski J. Sherman D. Eberhard D.A. Ferrara N. Cancer Res. 2000; 60: 6253-6258PubMed Google Scholar) or that the receptor fragments have higher affinity than the available anti-h-VEGF antibody (19Kim E.S. Serur A. Huang J. Manley C.A. McCrudden K.W. Frischer J.S. Soffer S. Ring L. New T. Zabski S. Rudge J.S. Holash J. Yancopoulos G.D. Kandel J.J. Yamashiro D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 11399-11404Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar). However, these receptor fragments may also block other VEGF family members, i.e. VEGF-B and PlGF. Although gene deletion of VEGF-B (20Bellomo D. Headrick J.P. Silins G.U. Paterson C.A. Thomas P.S. Gartside M. Mould A. Cathill M.M. Tonks I.D. Grimmond S.M. Townson S. Wells C. Little M. Cummings M.C. Hayward N. Kay G.F. Circ. Res. 2000; 86: 29-35Crossref PubMed Google Scholar) or PlGF (21Carmeliet P. Moons L. Luttun A. Vincenti V. Compernolle V. De Mol M. Wu Y. Bono F. Devy L. Beck H. Scholz D. Acker T. DiPalma T. Dewerchin M. Noel A. Stalmans I. Barra A. Blacher S. Vandendriessche T. Ponten A. Eriksson U. Plate K.H. Foidart J.M. Schaper W. Charnock-Jones D.S. Hicklin D.J. Herbert J.M. Collen D. Persico M.G. Nat. Med. 2001; 7: 575-583Crossref PubMed Scopus (1403) Google Scholar) was well tolerated in embryonic and postnatal developments, suggesting that these factors are not essential for developmental angiogenesis, recent studies have shown that both VEGF-B and PlGF can contribute to pathological angiogenesis (21Carmeliet P. Moons L. Luttun A. Vincenti V. Compernolle V. De Mol M. Wu Y. Bono F. Devy L. Beck H. Scholz D. Acker T. DiPalma T. Dewerchin M. Noel A. Stalmans I. Barra A. Blacher S. Vandendriessche T. Ponten A. Eriksson U. Plate K.H. Foidart J.M. Schaper W. Charnock-Jones D.S. Hicklin D.J. Herbert J.M. Collen D. Persico M.G. Nat. Med. 2001; 7: 575-583Crossref PubMed Scopus (1403) Google Scholar). Therefore, the specific contribution of VEGF-A cannot be defined by using these receptor decoys. As for affinity, direct comparison of anti-VEGF antibody with receptor decoy was not meaningful because of their different specificities. Other inhibitors such as inhibitors against VEGFR2 also cannot reveal the specific role of VEGF-A because VEGF-C and VEGF-D can also activate VEGFR2. To clarify these issues, antibodies that can directly and specifically block VEGF of both tumor and stromal sources would be the tool to examine whether blocking VEGF alone is sufficient for complete inhibition of tumor growth or whether the binding affinity of the antibody affects the potency and efficacy. Furthermore, a comparison between cross-reactive antibodies and antibodies that block only tumor-derived VEGF may reveal the level of dependence on stromal VEGF for tumor growth. VEGF-A is a member of the homodimeric cysteine knot protein family growth factor (6Ferrara N. Endocr. Rev. 2004; 25: 581-611Crossref PubMed Scopus (3009) Google Scholar). Two tyrosine kinase receptors mediate the signal activity of VEGF, VEGFR1 (Flt-1) and VEGFR2 (KDR), with the latter as the main receptor mediating most of the endothelial cell action as clearly demonstrated by VEGF variant and homologues that only can bind VEGFR2 (22Gille H. Kowalski J. Li B. LeCouter J. Moffat B. Zioncheck T.F. Pelletier N. Ferrara N. J. Biol. Chem. 2001; 276: 3222-3230Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (550) Google Scholar, 23Meyer M. Clauss M. Lepple-Wienhues A. Waltenberger J. Augustin H.G. Ziche M. Lanz C. Buttner M. Rzihaand H.-J. Dehio C. EMBO J. 1999; 18: 363-374Crossref PubMed Scopus (413) Google Scholar). The role of VEGFR1 is less clear, but it has high affinity for VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, with the latter two being VEGFR1-specific ligands. Structural and functional studies of VEGF receptor binding domain in complex with Avastin Fab (Fab-12) (24Muller Y.A. Li B. Christinger H.W. Wells J.A. Cunningham B.C. de Vos A.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 7192-7197Crossref PubMed Scopus (368) Google Scholar, 25Muller Y.A. Chen Y. Christinger H.W. Li B. Cunningham B.C. Lowman H.B. de Vos A.M. Structure (Lond.). 1998; 6: 1153-1167Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (246) Google Scholar) and affinity-improved Avastin, Y0317 (26Chen Y. Wiesmann C. Fuh G. Li B. Christinger H.W. McKay P. de Vos A.M. Lowman H.B. J. Mol. Biol. 1999; 293: 865-881Crossref PubMed Scopus (400) Google Scholar), and the primary binding domain of VEGFR1, the second Ig domain (VEGFR1D2) (27Wiesmann C. Fuh G. Christinger H.W. Eigenbrot C. Wells J.A. de Vos A.M. Cell. 1997; 91: 695-704Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (417) Google Scholar), revealed that the VEGF epitope for Avastin and for VEGFR1 or VEGFR2 have sufficient overlap for mutual exclusion. Human and murine VEGFs are 85% identical in sequence. More than 10 hybridoma antibodies against human VEGF were generated, but none can bind murine VEGF, which is expected as mice remove self-reactive antibodies. The high homology of murine VEGF with rat or hamster VEGF also made it difficult to generate the desired monoclonal antibodies in these animals. To identify antibodies that cross-react with murine and human VEGFs, we employed phage-displayed synthetic antibody libraries, which were generated by randomizing the complementarity determining regions (CDRs) of heavy chain in the humanized anti-ErbB2 antibody 4D5 (h4D5-8) template in a manner that mimicked the diversity of natural human antibodies (28Lee C.V. Liang W.-C. Dennis M.S. Eigenbrot C. Sidhu S.S. Fuh G. J. Mol. Biol. 2004; 340: 1073-1093Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar). Humanized 4D5-8 contains the commonly used framework (VH-3/Vk-1); thus antibodies isolated from the libraries would mimic natural human antibodies. Another main advantage of antibody generation with phage libraries is its in vitro selection process that should be indifferent to the cross-species conservation (29Winter G. Griffiths A.D. Hawkins R.E. Hoogenboom H.R. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 433-455Crossref PubMed Scopus (1393) Google Scholar, 30Hoogenboom H.R. Methods Mol. Biol. 2002; 178: 1-37PubMed Google Scholar). In this study, we report the identification of cross-human and murine VEGF binding clones, G6 and B20. We examined the affinity-improved G6 and B20 variants for their binding affinities, specificities, and VEGF blocking activities in comparison to the hybridoma-derived anti-h-VEGF antibody, A4.6.1 (or the humanized version, Avastin), and we identified variants suitable for in vivo studies, G6-31 and B20-4.1. In inhibiting h-VEGF action in vitro, B20-4.1 was equipotent to Avastin, and G6-31 was equipotent to Y0317. The cross-species anti-VEGF antibodies examined the specific role of VEGF in the tumor progression using mouse models. Binding Specificity of G6 and B20—Competitive ELISAs were used to determine the relative binding affinity of phage clones displaying anti-VEGF Fab to h-VEGF and m-VEGF as described (28Lee C.V. Liang W.-C. Dennis M.S. Eigenbrot C. Sidhu S.S. Fuh G. J. Mol. Biol. 2004; 340: 1073-1093Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar). Briefly, Fab phage were incubated with serial dilutions of h-VEGF or m-VEGF in PBS with 0.5% BSA and 0.05% Tween 20 (PBT) for 2 h, and then unbound Fab phage were captured with VEGF-coated 96-well Maxisorp ELISA plate (Nunc, Roskilde, Denmark) and detected by anti-M13 phage antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) (Amersham Biosciences) followed by substrate. EC50 values, the concentrations of VEGF incubated with Fab phage in solution that were effective in binding 50% of Fab phage to block their binding to immobilized VEGF were reported. Fab protein was prepared from Escherichia coli harboring the plasmid of the G6 Fab expression construct under the promoter of alkaline phosphatase and secretion leader sequence stII and was purified with the protein G affinity column as described (28Lee C.V. Liang W.-C. Dennis M.S. Eigenbrot C. Sidhu S.S. Fuh G. J. Mol. Biol. 2004; 340: 1073-1093Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar). IgGs were generated with mammalian cell transfection and purified with protein A affinity column. For examining binding specificities, VEGF and various homologues were first coated on an ELISA plate at 2 μg/ml in PBS and blocked with 0.5% BSA and 0.05% Tween 20. Serial dilutions of Fabs or IgGs were then incubated in VEGF variant-coated wells for 1 h and measured with anti-human antibody HRP diluted in PBT buffer. The VEGF homologues, mouse and human PlGF-2, human VEGF-C, mouse VEGF-D, human and mouse VEGF-B, were purchased from R & D Systems (Minneapolis, MN). Solution binding assays were also carried out in case some protein became unfunctional upon coating on the plate. Fabs or IgG (0.5 nm) were incubated with VEGF homologues at different concentrations for 1-2 h, and the unbound antibodies were captured with m-VEGF-coated ELISA wells and detected as above. The results were consistent with the direct binding ELISA format. VEGF Receptor Blocking Assay—Initial blocking assays were performed by phage ELISA. Murine VEGF-coated ELISA wells were first incubated with increasing concentrations of receptor fragments for 30 min, and phage displaying Fabs were then added. Bound phage were measured as described above. Purified Fabs and IgGs were then used to confirm receptor blocking activities. VEGF receptor-immobilized plates were prepared by capturing VEGFR2 ECD (Ig domain 1-7) as Fcγ fusion with goat anti-human IgG Fcγ (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) on the ELISA plate, whereas VEGFR1 ECD fragment (Ig domains 1-5) (VEGFR1D1-5) was coated directly. Biotinylated h-VEGF165 or m-VEGF164 (∼2 nm) was first incubated with 3-fold serially diluted anti-VEGF antibodies in PBT. After 1-2 h of incubation at room temperature, the mixtures were transferred to a VEGF receptor-immobilized plate and incubated for 10 min. The unblocked VEGF-A was captured with VEGF receptor-coated wells and detected by streptavidin-HRP conjugates as described above. Anti-VEGF Antibodies Binding Affinities—For binding affinity measurements, surface plasmon resonance measurements with BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) were employed. Carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIAcore, Inc.) were activated with N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide according to the supplier's instructions. Human or murine VEGF was immobilized to achieve ∼60 response units. 2-Fold serial dilutions of Fab or IgG (0.78-500 nm) were injected in PBS with 0.05% Tween 20 (PBST) at 37 or 25 °C (data not shown) at a flow rate of 25 μl/min. Association rates (kon) and dissociation rates (koff) were calculated using one-to-one Langmuir binding model (BIAcore evaluation software version 3.2). The equilibrium dissociation constant (Kd) was derived as the ratio koff/kon. HUVEC Assay of VEGF Inhibition—Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Clontech) were grown and assayed as described (31Fuh G. Li B. Crowley C. Cunningham B. Wells J.A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11197-11204Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (238) Google Scholar). Approximately 4000 HUVECs were plated in each well of the 96-well cell culture plate and incubated in Dulbecco's modified Eagle's/F-12 medium (1:1) supplemented with 1.5% (v/v) fetal bovine serum (assay medium) for 18 h. Fresh assay medium with fixed amounts of VEGF (∼0.15 nm final concentration), which was first titrated as a level of VEGF that can stimulate submaximal DNA synthesis, and increasing concentrations of anti-VEGF antibodies were then added to the cells. After incubation at 37 °C for 18 h, cells were pulsed with 0.5 μCi/well of [3H]thymidine for 24 h and harvested for counting with TopCount Microplate Scintillation counter. Tumor Implantation and in Vivo Treatments—HM-7, A673, and HPAC cells (American Type Culture Collection) were maintained in culture with Dulbecco's modified Eagle's/F-12 medium, supplemented with 10% fetal bovine serum. Cells were grown at 37 °C in 5% CO2 until confluent and then harvested and resuspended in sterile Matrigel at a concentration of 25 × 106 cells/ml. Xenografts were established in 6-8-week-old female Beige Nude XID mice by dorsal flank subcutaneous injection of 5 × 106 cells/mouse and allowed to grow. When tumors reached a volume of 500 mm3 for HM-7 and 150-200 mm3 for A673 and HPAC (48 h), a cohort was randomly selected (n = 10) as day 0 controls. The remaining mice were divided into groups of 10, and antibodies were administered intraperitoneally at the same dose for each group. Tumor sizes and weights were measured as described (11Gerber H.P. Kowalski J. Sherman D. Eberhard D.A. Ferrara N. Cancer Res. 2000; 60: 6253-6258PubMed Google Scholar). All statistical analyses used Student's t test. Histology and Staining—Tumor were fixed in 10% neutral buffered formalin for 12-16 h prior to paraffin embedding. Histologic sections of 4-5 μm thickness were stained with hematoxylin and eosin as described previously (32Gerber H.P. Hillan K.J. Ryan A.M. Kowalski J. Keller G.A. Rangell L. Wright B.D. Radtke F. Aguet M. Ferrara N. Development (Camb.). 1999; 126: 1149-1159Crossref PubMed Google Scholar). Vascular density was assessed in MECA-32 (anti-PLVAP)-stained histological sections of tumors, essentially as described previously (33Samson M. Peale Jr., F.V. Frantz G. Rioux-Leclercq N. Rajpert-De Meyts E. Ferrara N. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89: 4078-4088Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). For each tumor, three representative images, centered 500 μm from the tumor margin, were analyzed. ELISAs for VEGF Protein in Tumor Extract and Anti-VEGF in Mice Serum—For VEGF in tumors, 400-800 μg of excised tumor was homogenized in RIPA buffer (100 μl/μg) containing 20 mm Tris, pH 7.5, 150 mm NaCl, 2 mm EDTA, 1% deoxycholic acid, 1% Triton X-100, and 0.25% SDS, and supernatants were collected. Human VEGF ELISA of high sensitivity was performed as described (34Rodriguez C.R. Fei D.T. Keyt B. Baly D.L. J. Immunol. Methods. 1998; 219: 45-55Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Briefly, sandwich ELISA used monoclonal antibody 3.5F8 (Genentech) to h-VEGF as coat, and biotinylated A4.6.1 as detecting antibody. VEGF165 standards (1-128 pg/ml in 2-fold serial dilution) and samples were measured side by side. This ELISA does not detect m-VEGF. To measure m-VEGF, sandwiched ELISA used goat anti-m-VEGF antibody (R&D Systems) as coat and the same antibody in the biotinylated form for detection; m-VEGF standards (3.9-500 pg/ml in 2-fold serial dilutions) and tumor extract in sample buffer were measured side by side. The cross-reactivity of h-VEGF occurred when concentration was above 2000 ng/ml at <0.4%. For serum anti-VEGF (uncomplexed), ELISA plates were coated overnight with 0.5 μg/ml VEGF165 in 50 mm sodium carbonate, pH 9.6, blocked, washed, and then incubated with 2-fold serial dilutions of serum samples or anti-VEGF standards (0.20-25 ng/ml for Y0317 and Avastin, 0.39-50 ng/ml for B20-4.1, and 0.1-12.8 ng/ml for G6-31) in 0.05% BSA, 0.2% bovine γ-globulin, 0.25% CHAPS, 5 mm EDTA, 0.35 m NaCl, 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.4 (samples buffer), for 2 h. Bound antibodies were detected by appropriate anti-IgG-HRP conjugates, e.g. anti-human Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch) for Avastin, Y0317, and G6-31 as human IgG1, and anti-mouse IgG2a-HRP (Pharmingen) for B20-4.1, which had mouse IgG2a constant domains. Total antibodies (complexed and uncomplexed) were measured with ELISA plates coated with appropriate anti-IgG antibodies as above. Bound antibodies were detected with the same anti-IgG antibodies conjugated with HRP. By using the same assay for B20-4.1, we observed that serum from control nude mice with no injected antibodies contained less than 0.2 μg/ml mouse IgG2a. G6 and B20 Bind Human and Murine VEGF—G6 and B20 were among several clones isolated from a synthetic antibody phage library with humanized anti-ErbB2 antibody, h4D5, as the template by selection against m-VEGF. The binding specificity and receptor blocking activity of these phage clones displaying the antigen-binding fragment (Fab) were first examined (Fig. 1A). G6, the clone with the best apparent affinity for m-VEGF (EC50 = 0.6 nm), also showed near equivalent binding for h-VEGF at 1.4 nm (EC50). B20, however, binds m-VEGF and h-VEGF with relative affinity of 44 and 300 nm, respectively. To assess which antibody clone can block VEGF binding to its receptors, VEGFR2 ECD with seven Ig-like domains (VEGFR2D1-7) (Fig. 1B) or the second Ig domain of VEGFR1 ECD (VEGFR1D2) (Fig. 1C) was used to block the interaction of Fab-displaying phage with m-VEGF. Strong blocking was observed with G6 and B20 by both receptor fragments, suggesting that their epitopes on VEGF overlapped with the epitopes for receptor fragments. As B20 had weak and different affinity for h-VEGF and m-VEGF, it went through a first step of affinity improvement by selection in a phage-displayed library with light chain CDR residues randomized. Variant B20-4 exhibited equal apparent affinities for both h-VEGF and m-VEGF (EC50 ∼15 nm) (see supplemental Fig. 1). Next, G6 and B20-4 Fab were generated to confirm the binding specificities. G6 and B20-4 as Fabs indeed demonstrated near equal affinity for human and murine VEGF (see Table 1 for Kd values), and no detectable binding to other VEGF homologues, h- and m-PlGF, h-VEGF-B (and m-VEGF-B, not shown), h-VEGF-D (Fig. 1D), and VEGF-C (data not shown). G6 also bound rat and rabbit VEGF with similar affinity as for m-VEGF (data not shown). The receptor blocking activity of G6 or B20-4 Fab was confirmed by blocking both h- and m-VEGF binding to VEGFR2 (1-7 Ig domain ECD) (Fig. 1E) or VEGFR1 (1-5 Ig domain ECD) (m-VEGF blocking for VEGFR2 binding shown, and the rest is not shown). Avastin Fab (Fab-12), in comparison, can only block h-VEGF but not m-VEGF binding to the receptor as expected (Fig. 1E). An Avastin variant with improved affinity for h-VEGF, Y0317, showed slight m-VEGF-blocking activity at high concentrations as it acquired a weak binding affinity for m-VEGF (26Chen Y. Wiesmann C. Fuh G. Li B. Christinger H.W. McKay P. de Vos A.M. Lowman H.B. J. Mol. Biol. 1999; 293: 865-881Crossref PubMed Scopus (400) Google Scholar) (Kd = 333 nm, see below).TABLE 1The binding affinities and kinetic parameters of anti-VEGF antibodies Affinities of Fab or IgG are measured on BIAcore using sensor chip immobilized with human or murine VEGF at 37 °C (see “Materials and Methods”). Each measurement represents an average of three independent assays that vary by 20-50%. NB denotes no binding detected; ND denotes calculation not done.37 °Ckon (× 104) m-1s-1koff (× 10-4) s-1Kd (koff/kon) nmh-VEGFm-VEGFh-VEGFm-VEGFh-VEGFm-VEGFFab G624284819206.8 G6-8796527123.41.8 G6-311451261380.90.6 G6-2333723125100.70.4 B20-4.116126.0143.812 Fab-127.5NB6.4NB8.5NB Y03177.4ND0.11ND0.15NDIgG G61812116.46.25.2 G6-861416.53.91.10.9 G6-31133582.41.60.20.3 G6-232411355.53.00.20.2 B20.4.17.5111.22.21.62.0 A4.6.18.1NB1.4NB1.7NB Avastin9.2NB2.0NB2.2NB Y03178.11.20.02400.02333 Open table in a new tab The Affinity-improved G6 and B20 Variants—To improve the affinity of G6, light chain CDR residues were mutated as described (28Lee C.V. Liang W.-C. Dennis M.S. Eigenbrot C. Sidhu S.S. Fuh G. J. Mol. Biol. 2004; 340: 1073-1093Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar). Many G6 variants were isolated that differed from G6 by four or five residues in the CDR-L3, e.g. G6-8, G6-23, and G6-31. B20-4 was further improved by mutations in heavy chain CDRs to B20-4.1 (see supplemental Fig. 1). Binding affinities (Kd) of the improved variants as Fab or IgG protein were measured at 37 °C with surface plasmon resonance (BIAcore™) on immobilized human or murine VEGF in comparison to A4.6.1, Avastin (Fab-12 as Fab), and the affinity-improved version Y0317 (Table 1). The avidity advantage exhibited by the IgG reduced the apparent off-rates, but the overall ranking of these antibodies held. The improved G6 and B20 variants have similar affinities for human and murine VEGF. Compared with hybridoma-derived Avastin (or Fab-12 as Fab), B20-4.1 binds h-VEGF with similar affinity (∼4-8 nm as Fab and 2 nm as IgG) and kinetic profile of on-rate, kon, and off-rate, koff. Avastin was used interchangeably with A4.6.1 in the study as they have equivalent activities in vitro and in vivo (35Presta L.G. Chen H. O'Connor S.J. Chisholm V. Meng Y.G. Krummen L. Winkler M. Ferrara N. Cancer Res. 1997; 57: 4593-459

Extensive crosstalk among ErbB/HER receptors suggests that blocking signaling from more than one family member may be essential to effectively treat cancer and limit drug resistance. We generated a conventional IgG molecule MEHD7945A with dual HER3/EGFR specificity by phage display engineering and used structural and mutational studies to understand how a single antigen recognition surface binds two epitopes with high affinity. As a human IgG1, MEHD7945A exhibited dual action by inhibiting EGFR- and HER3-mediated signaling in vitro and in vivo and the ability to engage immune effector functions. Compared with monospecific anti-HER antibodies, MEHD7945A was more broadly efficacious in multiple tumor models, showing that combined inhibition of EGFR and HER3 with a single antibody is beneficial.