We examined the role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in preventing apoptosis in primary human umbilical vein endothelial (HUVE) cells. VEGF was capable of preventing serum starvation-induced apoptosis at concentrations between 10 and 100 ng/ml. The addition of VEGF to serum-starved HUVE cells led to a 5.2-fold induction of Bcl-2 after 36 h and to a transient, 2.4-fold induction of A1 after a 7-h incubation, as quantitated by real time reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis. Western blot analysis demonstrated a 2–3-fold induction of Bcl-2 protein after 18–36 h of exposure to VEGF and a transient induction of A1 after 7 h of VEGF stimulation. Moreover, overexpression of Bcl-2 by means of transient biolistic transfection experiments of HUVE cells was sufficient to prevent endothelial cells from apoptotic cell death in the absence of VEGF. These findings indicate that Bcl-2 plays an important role in mediating the survival activity of VEGF on endothelial cells. We examined the role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in preventing apoptosis in primary human umbilical vein endothelial (HUVE) cells. VEGF was capable of preventing serum starvation-induced apoptosis at concentrations between 10 and 100 ng/ml. The addition of VEGF to serum-starved HUVE cells led to a 5.2-fold induction of Bcl-2 after 36 h and to a transient, 2.4-fold induction of A1 after a 7-h incubation, as quantitated by real time reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis. Western blot analysis demonstrated a 2–3-fold induction of Bcl-2 protein after 18–36 h of exposure to VEGF and a transient induction of A1 after 7 h of VEGF stimulation. Moreover, overexpression of Bcl-2 by means of transient biolistic transfection experiments of HUVE cells was sufficient to prevent endothelial cells from apoptotic cell death in the absence of VEGF. These findings indicate that Bcl-2 plays an important role in mediating the survival activity of VEGF on endothelial cells. Bcl-2 belongs to a growing family of apoptosis regulatory gene products, which may either be death antagonists (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, and A1) or death agonists (Bax, Bak, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, and Hrk; for review, see Ref. 1Kroemer G. Nat. Med. 1997; 3: 614-620Crossref PubMed Scopus (1701) Google Scholar). Bcl-2 is an intracellular protein that localizes to mitochondria, endoplasmic reticulum, and the nuclear envelope (2Monaghan P. Robertson D. Amos T.A.S. Dyer M.J.S. Mason D.Y. Greaves M.F. J. Histochem. Cytochem. 1992; 40: 1819-1825Crossref PubMed Scopus (335) Google Scholar, 3Krajewski S. Tanaka S. Takayama S. Schibler M.J. Fenton W. Reed J.C. Cancer Res. 1993; 53: 4701-4714PubMed Google Scholar) and has been shown to block apoptosis without inducing cellular proliferation (4Hockenbery D. Nunez G. Milliman C. Schreiber R.D. Korsmeyer S.J. Nature. 1990; 348: 334-336Crossref PubMed Scopus (3514) Google Scholar, 5Vaux D.L. Cory S. Adams J.M. Nature. 1988; 335: 440-442Crossref PubMed Scopus (2701) Google Scholar). In vitro, many growth factors and cytokines have been shown to promote survival in different cell lines tested by activation of the Ras–Raf–mitogen-activated protein kinase module (for review, see Refs. 6Cobb M.H. Goldsmith E.J. J. Biol. Chem. 1995; 270: 14843-14846Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1653) Google Scholar and 7Hemmings B.A. Science. 1997; 275: 628-630Crossref PubMed Scopus (434) Google Scholar). However, the mechanisms by which growth factors control proliferation and regression of endothelial cells remain poorly understood. In human umbilical vein endothelial (HUVE) cells, 1The abbreviations used are: HUVE cells, human umbilical vein endothelial cells; VEGF, vascular endothelial growth factor; RT-PCR, reverse transcriptase-polymerase chain reaction; GFP, green fluorescent protein.1The abbreviations used are: HUVE cells, human umbilical vein endothelial cells; VEGF, vascular endothelial growth factor; RT-PCR, reverse transcriptase-polymerase chain reaction; GFP, green fluorescent protein. increased levels of apoptosis and necrosis were observed when cells were incubated with lipopolysaccharide. Vitamins C and E reduced the levels of apoptosis, which was paralleled by an increase in Bcl-2 expression and a decrease in Bax protein levels (8Haendeler J. Zeiher A.M. Dimmeler S. Eur. J. Pharmacol. 1996; 317: 407-411Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar). Upon incubation of HUVE cells with transforming growth factor-β, decreased levels of Bcl-2 correlated with increased levels of apoptotic cell death (9Tsukada T. Eguchi K. Migita K. Kawabe Y. Kawakami A. Matsuoka N. Takashima H. Mizokami A. Nagataki S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 210: 1076-1082Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar). 2-Methoxyestradiol was found to induce apoptosis of cultured bovine pulmonary endothelial cells (10Yue T.L. Wang X. Louden C.S. Gupta S. Pillarisetti K. Gu J.L. Hart T.K. Lysko P.G. Feuerstein G.Z. Mol. Pharmacol. 1997; 51: 951-962Crossref PubMed Scopus (196) Google Scholar). A1, a homolog of the Bcl-2 family of antiapoptotic proteins originally cloned from phorbol ester-stimulated endothelial cells, was shown to be induced by the inflammatory cytokines tumor necrosis factor and interleukin-1 (11Karsan A. Yee E. Harlan J.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 27201-27204Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (209) Google Scholar). Infection of microvascular endothelial cells with retroviral constructs encoding A1 led to inhibition of tumor necrosis factor-α-induced cell death in the presence of actinomycin D (11Karsan A. Yee E. Harlan J.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 27201-27204Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (209) Google Scholar). Similar findings were reported when Bcl-2 was overexpressed by means of retroviral infection of murine aortic endothelial cells. Enforced expression of Bcl-2 prevented apoptosis of these cells when cultured in fibroblast growth factor-depleted medium (12Kondo S. Yin D. Aoki T. Takahashi J.A. Morimura T. Takeuchi J. Exp. Cell Res. 1994; 213: 428-432Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar). The endothelial cell-specific mitogen vascular endothelial growth factor (VEGF) has been shown to be a key positive regulator of normal and pathological angiogenesis (13Ferrara N. Davis-Smyth T. Endocr. Rev. 1997; 18: 4-25Crossref PubMed Scopus (3668) Google Scholar). A growing body of evidence indicates that VEGF may also act as a survival factor for newly formed blood vessels. In the developing retina, vascular regression in response to hyperoxia has been correlated with inhibition of VEGF release by glial cells (14Alon T. Hemo I. Itin A. Pe'er J. Stone J. Keshet E. Nat. Med. 1995; 1: 1024-1028Crossref PubMed Scopus (1400) Google Scholar). Furthermore, administration of anti-VEGF monoclonal antibodies results in regression of established tumor-associated vasculature in xenograft models (15Yuan F. Chen Y. Dellian M. Safabakhsh N. Ferrara N. Jain R.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14765-14770Crossref PubMed Scopus (597) Google Scholar). More recently, using a tetracycline-regulated VEGF expression system in xenografted C6 glioma cells, it has been shown that decreased levels of VEGF production lead to detachment of endothelial cells from the walls of preformed vessels in the tumor (16Benjamin L.E. Keshet E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 8761-8766Crossref PubMed Scopus (439) Google Scholar). We have found recently that VEGF can counteract endothelial cell apoptosis induced upon serum starvation of HUVE cells in culture (see Fig. 3). 2H. P. Gerber, A. McMurtrey, H. Nguyen, Y. Minhong, V. Dixit, and N. Ferrara, submitted for publication.2H. P. Gerber, A. McMurtrey, H. Nguyen, Y. Minhong, V. Dixit, and N. Ferrara, submitted for publication. This survival activity was critically dependent on the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. In this report, we found increased expression of the antiapoptotic proteins A1 and Bcl-2 but not Bax or Bcl-XL upon challenging primary HUVE cells with VEGF. Thus Bcl-2 and A1 are two novel VEGF target genes. HUVE cells, human microvascular endothelial cells, and CS-C medium were purchased from Cell System (Kirkland, WA). HUVE cells are pooled primary isolates from 300 individual donor umbilical veins. Cells were maintained in CS-C complete medium containing 10% fetal bovine serum and mitogens, according to the recommendations of the supplier. 24 h before initiation of serum starvation, cells were treated with trypsin and plated to a density of 20–25 × 103 cells/cm2 on six-well dishes (reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis) or 6-cm dishes (biolistic transfection experiments). Immediately before the experiment, cells were washed twice with phosphate-buffered saline. For serum starvation, CS-C medium without serum and mitogen, complemented with 0.1% bovine serum albumin, was added for the indicated amount of time. After biolistic transfection, cells were allowed to recover for 24 h in medium containing 10% serum. After washing the cells twice with Tris-buffered saline, minimal medium (without mitogen and serum) complemented with 0.1% bovine serum albumin was added, and the levels of apoptosis were analyzed 24 h after induction of serum starvation. HUVE cells were initially expanded for 8–10 days in the presence of completed medium. Routinely, cells between passages 4 and 10 were used in the different experimental procedures. 24 h before serum starvation, cells were split and seeded in complete medium at a density of 200,000 cells/well in six-well plates, following the procedures recommended by the manufacturer. Cells were washed for 5 min before adding Cell System basic medium complemented with 0.1% bovine serum albumin. After incubations of various duration, cells were harvested by the STAT 60 method (TEL-TEST “B”, Inc., Friendswood, TX), and total RNA was prepared according to the manufacturer's recommendations. The RNA was dissolved in 50 μl of H2O, and the concentration was determined by spectrophotometer (A 260/280 nm). To monitor gene expression we used real time RT-PCR analysis. This novel approach has been described previously (18Gerber H.-P. Condorelli F. Park J. Ferrara N. J. Biol. Chem. 1997; 272: 23659-23667Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (670) Google Scholar). Briefly, 100 ng of total RNA was added to a 50-μl RT-PCR (PCR-Access, Promega). The reaction master mix was prepared according to the manufacturer's protocol to give final concentrations of 1 × avian myeloblastosis virus/Tfl reaction buffer, 0.2 mm dNTPs, 1.5 mm MgSO4, 0.1 unit/ml avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, 0.1 unit/μl Tfl DNA polymerase, a 250 nm concentration of the primers, and a 200 nm concentration of the corresponding probe. Primers and probes for real time PCR analysis Bcl-2, A1,Bax, and Bad genes were designed by the Primer Express Program according to Heid et al. (19Heid C.A. Stevens J. Livak K.J. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 986-994Crossref PubMed Scopus (4940) Google Scholar). For sequence information of all oligonucleotides, see TableI. The primers for the humanBcl-2 gene were HUMBCL-2 555.F and HUMBCL-2 639.R, and the probe was HUMBCL-2 598.FP. For A1 analysis, the following primers were used: HUMA1 14.F and HUMA1 131.R; the probe was HUMA1 59.FP. For Bcl-XL analysis we used HSBCLXL 408.F and HSBCLXL 851.R primers, the probe was HSBCLXL 585.FP. For Bax-Aanalysis, we used HUMBAXA 155.F and HUMBAXA 301.R as primers and HUMBAXA 235.FP as probe. Primers and probes were synthesized at Genentech using conventional nucleic acid synthesis chemistry. The β-actin primer and probe (TaqMan β-actin detection reagents) were purchased from Perkin-Elmer.Table ISequences of oligonucleotide primers and real time RT-PCR probesHUMBCL-2 598.FP5′(FAM)-TGT GCG CGC GTA TAA ATT GCC GA-(TAMRA)p3′HUMBCL-2 555.FAAG CGG TCC CGT GGA TAG AHUMBCL-2 639.RTCC GGT ATT CGC AGA AGT CCHSBCLXL 585.FP5′(FAM)-TGC GTG GAA AGC GTA GAC AAG GAG ATG C-(TAMRA)p3′HSBCLXL 408.FGAG GCA GGC GAC GAG TTT GAAHSBCLXL 851.RGGG GTG GGA GGG TAG AGT GGAHUMA1 59.FP5′(FAM)-TGC TCT CCA CCA GGC AGA AGA TGA CA-(TAMRA)p3′HUMA1 14.FCAG CAC ATT GCC TCA ACA GCHUMA1 131.RTGC AGA TAG TCC TGA GCC AGCHUMBAXA 235.FP5′(FAM)-ATG ATT GCC GCC GTG GAC ACA GAC TCC-(TAMRA)p3′HSBAXA 155.FAGG ATG CGT CCA CCA AGA AGHSBAXA 301.RCCA GTT GAA GTT GCC GTC AGA Open table in a new tab RT-PCRs and the resulting relative increase in reporter fluorescent dye emission were monitored in real time by the 7700 sequence detector (Perkin-Elmer). Signals were analyzed by the sequence detector 1.6 program (Perkin-Elmer). Conditions were as follows: one cycle at 48 °C for 45 min; one cycle at 94 °C for 2 min; 40 cycles at 94 °C for 30 s, 60 °C for 1 min, and 68 °C for 2 min. Data were generated as indicated in the legend to Fig.1. Cells cultured in 10-cm dishes were washed twice in Tris-buffered saline, and 0.6 ml of RIPA buffer (1 × phosphate-buffered saline, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 30 μl/ml aprotinin, and 1 μm sodium orthovanadate) containing freshly added protease inhibitors was added. Mouse monoclonal antibody directed against human Bcl-2 (Bcl-2(100)) was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Affinity-purified goat polyclonal antibody against human A1 (A1(N-20)) was from the same manufacturer. The secondary antibody to Bcl-2(100) was goat anti-mouse Ig (biotin-labeled) from Southern Biotechnologies (Birmingham, AL). The secondary antibody to A1(N-20) was biotinylated anti-goat IgG from Vector Laboratories (Burlingame, CA). Total endothelial cell extract, polyacrylamide gel electrophoresis, blotting, and immunodetection were performed according to the Santa Cruz Biotechnology protocol. 60 μg of whole cell extract was loaded on each lane of a 4–16% polyacrylamide gel. The ECL reaction kit was purchased from Amersham Pharmacia Biotech, and horseradish peroxidase streptavidin from Vector Laboratories was used. Experiments were done using the Bio-Rad 500 optimization kit in the Biolistic PDS-1000/He* Particle Delivery System (Bio-Rad). In a series of pilot experiments using luciferase reporter gene DNA, conditions were established which yield the highest levels of luciferase activity in HUVE cells (data not shown). The settings used are as follows: particle size, 1.0 μm; rupture disc, 1,100 p.s.i.; bombardment chamber vacuum, 25 mmHg; and target shelf position 3 (from the top). Gold particles were prepared according to the manufacturer's recommendations and stored as 50-μl aliquots for several months at −20 °C. Aliquots were coated with DNA immediately before gene transfer following the manufacturer's recommendations. Briefly, for five samples, a 50-μl aliquot of gold particles was Vortex mixed for 3 min, and plasmid DNA (1 mg/ml) was added to a total of 10 μg. Vortexing was continued for 2 min. Thereafter, 100 μl of a 2.5m CaCl2 solution was added to the mix. After 2 min of additional vortexing, 20 μl of a freshly prepared 0.1m spermidine solution was added followed by 2 min of constant vortexing. The mixture was allowed to settle for 1 min before tubes were centrifuged for 5 s in a tabletop microcentrifuge. The supernatant was removed, and the gold pellet was washed first with 140 μl of 70% EtOH followed by 140 μl of 100% EtOH. After removing the supernatant, the gold particles were taken up in 55 μl of 100% EtOH, and 10 μl was used per biolistic transfection. Immediately after bombardment, 5 ml of complemented medium was added. To find putative VEGF target genes mediating the VEGF survival activity, we analyzed total RNA of HUVE cells treated with VEGF by quantitative RT-PCR (TaqMan). We designed primer probe sets for quantitative RT-PCR analysis of genes known to be involved in mediating antiapoptotic activities such as Bcl-2,A1, Bcl-XL, or apoptosis-inducing genes such asBax (for sequence information, see Table I). In the primary human endothelial cell types tested, umbilical vein and lung microvascular endothelial cells, we have observed induction ofBcl-2 as early as 7 h after the addition of VEGF (Fig.1 and data not shown). The levels of Bcl-2 in HUVE cells increased over time and reached 5.2-fold after 33 h of incubation with VEGF. No significant induction of A1 orBcl-2 message in response to VEGF stimulation was observed when endothelial cells were grown in the presence of 10% fetal calf serum (data not shown). Interestingly, the A1 message was transiently increased 2.4-fold after 7 h of VEGF addition and decreased after prolonged incubation time. In a previous report, Northern blots of HUVE cells did not reveal an increase in the A1 message after incubation with a mixture of VEGF and basic fibroblast growth factor for 3 h (20Karsan A. Yee E. Kaushansky K. Harlan J.M. Blood. 1996; 87: 3089-3096Crossref PubMed Google Scholar). The failure to observe increased levels for A1 message in response to VEGF may be caused by the decreased sensitivity of the Northern blot analysis, or because the cells were exposed to a mixture of basic fibroblast growth factor (4 ng/ml) and VEGF (10 ng/ml), or because of the different incubation length with VEGF (3 hversus 7 h). When we analyzed total RNA from HUVE cells for Bcl-XL andBax expression, we could not detect any significant change in their expression levels in response to VEGF under serum starvation conditions (data not shown). To verify if increased expression of A1 and Bcl-2in response to VEGF stimulation is also reflected in increased protein levels, we performed Western blot experiments with whole cell extracts of HUVE cells cultured under the same conditions as those employed for the RT-PCR analysis. We found a direct correlation between the mRNA and the protein levels (Fig. 2) of Bcl-2 and A1 in human endothelial cells in response to VEGF stimulation. These findings suggest that VEGF exerts its up-regulatory activity on the Bcl-2 and A1 genes primarily at the transcriptional level. We found decreased levels of Bcl-2 and A1 proteins in endothelial cells cultured in the absence of VEGF, suggesting that these genes may be involved in mediating survival activity of VEGF on endothelial cells (Fig.3).2 It has been shown previously that A1 levels are induced upon incubation of human endothelial cells to inflammatory mediators such as tumor necrosis factor-α and interleukin-1β, and a possible role for theA1 gene in inflammation was suggested. By taking advantage of the biolistic transfection technique to transiently transfect primary human endothelial cells, we wanted to test whether Bcl-2 was sufficient to mediate survival in our assay conditions. Transfected endothelial cells were identified by cotransfection of an expression vector for green fluorescent protein (pEGFP, CLONTECH, Palo Alto, CA) 24 h after the beginning of serum starvation and identified by fluorescence microscopy. To assess the effects of Bcl-2, we scored transfected cells in a blinded manner as healthy or apoptotic by morphology (21Li Y. Horwitz M.S. BioTechniques. 1997; 23: 1026-1030Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar). Healthy endothelial cells are flat and well attached to the plate. Apoptotic endothelial cells are rounded, and some are fragmenting with the small cytoplasmic blebs that are characteristic of apoptosis. When we stained the cells with the DNA dye bisbenzimide (Hoechst 33258), apoptotic endothelial cells showed pronounced nuclear condensations. As shown in Fig. 3, Bcl-2 was sufficient to inhibit endothelial cell apoptosis in the absence of VEGF. We have observed lower levels of apoptosis when cells were transfected with Bcl-2 compared with untransfected cells grown in the presence of VEGF (100 ng/ml) or 10% fetal calf serum. These findings suggest that the levels of Bcl-2 are critical for endothelial cell survival when cultured under serum starvation conditions. VEGF exerts its biological effects by binding to its respective transmembrane receptors Flt-1 and Flk-1/KDR, which are expressed mainly on endothelial cells. Stimulation of endothelial cells with VEGF and subsequent immunoblot analysis demonstrated that VEGF induces phosphorylation of phosphatidylinositol 3-kinase, Ras GTPase-activating protein, p190-rhoGAP, p62, PLC-y, the oncogenic adaptor protein NcK, p125 focal adhesion kinase (p125 FAK), paxilin, and several others (22Terman B.I. Carrion M.E. Kovacs E. Rasmussen B.A. Eddy R.L. Shows T.B. Oncogene. 1991; 6: 1677-1683PubMed Google Scholar, 23Guo D. Jia Q. Song H.-Y. Warren R.S. Donner D.B. J. Biol. Chem. 1995; 270: 6729-6733Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (412) Google Scholar, 24Settleman J. Narasimhan V. Foster L.C. Weinberg R.A. Cell. 1992; 69: 539-549Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (260) Google Scholar, 25Ellis C. Morgan M. McCormick F. Pawson T. Nature. 1990; 343: 377-381Crossref PubMed Scopus (523) Google Scholar, 26Abedi H. Zachary I. J. Biol. Chem. 1997; 272: 15442-15451Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (414) Google Scholar, 27Waltenberger J. Claesson-Welsh L. Siegbahn A. Shibuya M. Heldin C.-H. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26988-26995Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 28Takahashi T. Shibuya M. Oncogene. 1997; 12: 2079-2089Crossref Scopus (271) Google Scholar, 29Seetharam L. Gotoh N. Maru Y. Neufeld G. Yamaguchi S. Shibuya M. Oncogene. 1995; 10: 135-147PubMed Google Scholar, 30Cunningham S.A. Waxham M.N. Arrate P.M. Brock T.A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20254-20257Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (94) Google Scholar; for review see Ref. 31Merenmies J. Parada L.F. Henkemeyer M. Cell Growth Differ. 1997; 8: 3-10PubMed Google Scholar). The signal transduction pathways involved in mediating the various biologic functions of VEGF on endothelial cells such as migration, proliferation, or survival remain to be characterized. Both VEGF receptors, Flk-1/KDR and Flt-1, were found previously to be expressed on HUVE cells by cell binding and cross-linking studies with VEGF or the Flt-1-specific ligand PlGF (32Park J.E. Chen H.H. Winer J. Houck K.A. Ferrara N. J. Biol. Chem. 1994; 269: 25646-25654Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) or by RT-PCR analysis (18Gerber H.-P. Condorelli F. Park J. Ferrara N. J. Biol. Chem. 1997; 272: 23659-23667Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (670) Google Scholar). The HUVE cells used in our experiments were pooled primary isolates from 300 individual donor umbilical veins and thus are likely to represent an average population of endothelial cells. Upon incubation of primary human endothelial cells with VEGF, we found increased expression of two antiapoptotic proteins, Bcl-2 and A1. The increase in Bcl-2 message in response to VEGF can reflect the sum of an increase in the transcriptional level as well as an increase in RNA stability. The overall increase of the Bcl-2 protein observed in these cells may represent higher levels of Bcl-2 mRNA as well as the result of an increase in the protein stability. Recently, several reports identified altered Bcl-2 levels in endothelial cells engaged in physiologic as well as pathologic angiogenesis. In human corpora lutea, Bcl-2 was found to be expressed in the vascular endothelium of some luteal arterioles and venules (33Rodger F.E. Fraser H.M. Duncan W.C. Illingworth P.J. Hum. Reprod. 1995; 10: 1566-1570Crossref PubMed Scopus (50) Google Scholar). During normal luteal phase or after treatment with chorionic gonadotrophin, the corpus luteum undergoes a rapid and massive increase in size and vasculature. This process was completely inhibited by administration of a truncated soluble Flt-1 receptor in a rat model of hormonally induced ovulation (34Ferrara N. Chen H. Davis-Smyth T. Gerber H.P. Nguyen T.H. Peers D. Chisholm V. Hillan K.J. Schwall R. Nat. Med. 1998; 4: 336-340Crossref PubMed Scopus (580) Google Scholar). These findings indirectly suggested a correlation between the levels of VEGF and Bcl-2 in endothelial cells. However, the numbers of blood vessels exhibiting Bcl-2 staining showed little variation throughout the luteal phase implying that other mechanisms are involved in luteal maintenance (33Rodger F.E. Fraser H.M. Duncan W.C. Illingworth P.J. Hum. Reprod. 1995; 10: 1566-1570Crossref PubMed Scopus (50) Google Scholar). An increase in the levels of Bcl-2 expression within the vascular endothelial spindle-shaped cells in Kaposi sarcoma lesions in humans was observed, indicating that up-regulation of Bcl-2 may be important in the pathogenesis of both classical and AIDS-associated Kaposi sarcoma (35Morris C.B. Gendelman R. Marrogi A.J. Lu M. Lockyer J.M. Alperin-Lea W. Ensoli B. Am. J. Pathol. 1996; 148: 1055-1063PubMed Google Scholar). In vitro, overexpression of Bcl-2 in a bovine endothelial cell line blocked the effects of oxidative stress such as lipid peroxidation. In these cells, Bcl-2 also blocked hyperglycemia-induced formation of advanced glycation end products, which are thought to cause tissue damage observed in diabetes-associated hyperglycemia (36Giardino I. Edelstein D. Brownlee M. J. Clin. Invest. 1996; 97: 1422-1428Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). The identification of two novel VEGF target genes, Bcl-2 andA1, appears timely, given the emerging concepts that VEGF is a survival factor for endothelial cells2 and that VEGF withdrawal may result in regression of the vasculature in several cases (14Alon T. Hemo I. Itin A. Pe'er J. Stone J. Keshet E. Nat. Med. 1995; 1: 1024-1028Crossref PubMed Scopus (1400) Google Scholar, 15Yuan F. Chen Y. Dellian M. Safabakhsh N. Ferrara N. Jain R.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14765-14770Crossref PubMed Scopus (597) Google Scholar, 16Benjamin L.E. Keshet E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 8761-8766Crossref PubMed Scopus (439) Google Scholar). The role of Bcl-2 in endothelial cells during pathologic and physiologic neoangiogenesis or during vessel regression remains to be analyzed. We thank the FACS laboratory at Genentech for excellent support; and M. Vasser, P. Ng, and P. Jhurani for oligonucleotide synthesis. We thank David Wood and Charles Hoffman for excellent graphic artwork.

ABSTRACT We employed two independent approaches to inactivate the angiogenic protein VEGF in newborn mice: inducible, Cre-loxP-mediated gene targeting, or administration of mFlt(1-3)-IgG, a soluble VEGF receptor chimeric protein. Partial inhibition of VEGF achieved by inducible gene targeting resulted in increased mortality, stunted body growth and impaired organ development, most notably of the liver. Administration of mFlt(1-3)-IgG, which achieves a higher degree of VEGF inhibition, resulted in nearly complete growth arrest and lethality. Ultrastructural analysis documented alterations in endothelial and other cell types. Histological and biochemical changes consistent with liver and renal failure were observed. Endothelial cells isolated from the liver of mFlt(1-3)-IgG-treated neonates demonstrated an increased apoptotic index, indicating that VEGF is required not only for proliferation but also for survival of endothelial cells. However, such treatment resulted in less significant alterations as the animal matured, and the dependence on VEGF was eventually lost some time after the fourth postnatal week. Administration of mFlt(1-3)-IgG to juvenile mice failed to induce apoptosis in liver endothelial cells. Thus, VEGF is essential for growth and survival in early postnatal life. However, in the fully developed animal, VEGF is likely to be involved primarily in active angiogenesis processes such as corpus luteum development.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its two endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases, Flk-1/KDR and Flt-1, play a key role in physiological and pathological angiogenesis. Hypoxia has been shown to be a major mechanism for up-regulation of VEGF and its receptors in vivo. When we exposed human umbilical vein endothelial cells to hypoxic conditions in vitro, we observed increased levels of Flt-1expression. In contrast, Flk-1/KDR mRNA levels were unchanged or slightly repressed. These findings suggest a differential transcriptional regulation of the two receptors by hypoxia. To identify regulatory elements involved in the hypoxic response, promoter regions of the mouse Flt-1 and Flk-1/KDR genes were isolated and tested in conjunction with luciferase reporter gene. In transient transfection assays, hypoxia led to strong transcriptional activation of the Flt-1 promoter, whereasFlk-1/KDR transcription was essentially unchanged. Promoter deletion analysis demonstrated a 430-bp region of the Flt-1promoter to be required for transcriptional activation in response to hypoxia. This region includes a heptamer sequence matching the hypoxia-inducible factor-1 (HIF) consensus binding site previously found in other hypoxia-inducible genes such as the VEGFgene and erythropoietin gene. We further narrowed down the element mediating the hypoxia response to a 40-base pair sequence including the putative HIF binding site. We show that this element acts like an enhancer, since it activated transcription irrespective of its location or orientation in the construct. Furthermore, mutations within the putative HIF consensus binding site lead to impaired transcriptional activation by hypoxia. These findings indicate that, unlike the KDR/Flk-1 gene, the Flt-1 receptor gene is directly up-regulated by hypoxia via a hypoxia-inducible enhancer element located at positions −976 to −937 of theFlt-1 promoter. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its two endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases, Flk-1/KDR and Flt-1, play a key role in physiological and pathological angiogenesis. Hypoxia has been shown to be a major mechanism for up-regulation of VEGF and its receptors in vivo. When we exposed human umbilical vein endothelial cells to hypoxic conditions in vitro, we observed increased levels of Flt-1expression. In contrast, Flk-1/KDR mRNA levels were unchanged or slightly repressed. These findings suggest a differential transcriptional regulation of the two receptors by hypoxia. To identify regulatory elements involved in the hypoxic response, promoter regions of the mouse Flt-1 and Flk-1/KDR genes were isolated and tested in conjunction with luciferase reporter gene. In transient transfection assays, hypoxia led to strong transcriptional activation of the Flt-1 promoter, whereasFlk-1/KDR transcription was essentially unchanged. Promoter deletion analysis demonstrated a 430-bp region of the Flt-1promoter to be required for transcriptional activation in response to hypoxia. This region includes a heptamer sequence matching the hypoxia-inducible factor-1 (HIF) consensus binding site previously found in other hypoxia-inducible genes such as the VEGFgene and erythropoietin gene. We further narrowed down the element mediating the hypoxia response to a 40-base pair sequence including the putative HIF binding site. We show that this element acts like an enhancer, since it activated transcription irrespective of its location or orientation in the construct. Furthermore, mutations within the putative HIF consensus binding site lead to impaired transcriptional activation by hypoxia. These findings indicate that, unlike the KDR/Flk-1 gene, the Flt-1 receptor gene is directly up-regulated by hypoxia via a hypoxia-inducible enhancer element located at positions −976 to −937 of theFlt-1 promoter. The growth of new blood vessels (angiogenesis) is essential for embryonic development and other physiologic processes such as bone remodeling, wound healing, and ovarian cycle (1Folkman J. Klagsbrun M. Science. 1987; 235: 442-447Crossref PubMed Scopus (4046) Google Scholar, 2Folkman J. J. Natl. Cancer Inst. 1987; 82: 4-6Crossref Scopus (4409) Google Scholar). Angiogenesis is also a critical component of tumors, inflammatory arthritis, intraocular neovascular syndromes, and other disorders (3Folkman J. Hanahan D. Princess Takamatsu Symp. 1991; 22: 339-347PubMed Google Scholar, 4Kim K.J. Li B. Winer J. Armanini M. Gillett N. Phillips H.S. Ferrara N. Nature. 1993; 362: 841-844Crossref PubMed Scopus (3353) Google Scholar). The search for potential regulators of angiogenesis led to a number of candidates (aFGF, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-α, transforming growth factor-β, etc.) (5Folkman J. Shing Y. J. Biol. Chem. 1992; 267: 10931-10934Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Among those, VEGF 1The abbreviations used are: VEGF, vascular endothelial growth factor; HIF, hypoxia-inducible factor-1; EPO, erythropoietin; HUVE, human umbilical vein endothelial; kb, kilobase pair; bp, base pair; EGM, endothelial growth medium; EGF, epidermal growth factor; RLU, relative light units; PCR, polymerase chain reaction; RT-PCR, reverse transcriptase-polymerase chain reaction; HIE, hypoxia inducible element. and its two receptors, Flt-1 and Flk-1/KDR have been shown to be crucially involved in physiological and pathological regulation of blood vessel growth (6Ferrara N. Davis-Smtyh T. Endocr. Rev. 1997; 18: 4-25Crossref PubMed Scopus (3668) Google Scholar). Recently, it has been shown that oxygen tension plays a major role in the regulation of VEGF gene expression (7Minchenko A. Bauer T. Salceda S. Caro J. Lab. Invest. 1994; 71: 374-379PubMed Google Scholar, 8Shweiki D. Itin A. Soffer D. Keshet E. Nature. 1992; 359: 843-845Crossref PubMed Scopus (4163) Google Scholar, 9Shima D.T. Adamis A.P. Ferrara N. Yeo K.T. Yeo T.K. Allende R. Folkman J. D'Amore P.A. Mol. Med. 1995; 1: 182-193Crossref PubMed Google Scholar). VEGF mRNA expression is rapidly and reversibly induced by exposure to low oxygen conditions in a variety of normal and transformed cells. A 47-bp regulatory element located about 1 kb upstream to the VEGF transcription initiation site was found to be involved in the activation of VEGF transcription in hypoxic cells. This element includes a binding site for the transcription factor hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) (10Jiang B.-H. Rue E. Wang G.L. Roe R. Semenza G.L. J. Biol. Chem. 1996; 271: 17771-17778Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (902) Google Scholar). When reporter constructs containing the VEGF sequences that mediate hypoxia inducibility were co-transfected with expression vectors encoding HIF-1 subunits, reporter gene transcription was much greater than that observed in cells transfected with the reporter alone, both in hypoxic and normoxic conditions (11Forsythe J.A. Jiang B.H. Iyer N.V. Agani F. Leung S.W. Koos R.D. Semenza G.L. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 4604-4613Crossref PubMed Scopus (3217) Google Scholar). HIF-1 has been shown to be involved also in the regulation of the human and mouse erythropoietin (EPO) genes (12Madan A. Curtin P.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 3928-3932Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar, 13Semenza G.L. Nejfelt M. Chi S.M. Antonarakis S.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 5680-5684Crossref PubMed Scopus (719) Google Scholar) as well as other hypoxia inducible genes such as the glycolytic enzymes (14Firth J.D. Ebert B.L. Pugh C.W. Ratcliffe P.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 6496-6500Crossref PubMed Scopus (446) Google Scholar, 15Semenza G.L. Roth P.H. Fang H.-M. Wang G.L. J. Biol. Chem. 1994; 269: 23757-23763Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Hypoxia has been proposed to play an important role also in the regulation of VEGF receptor gene expression. Exposure of rats to acute or chronic hypoxia led to pronounced up-regulation of bothFlt-1 and Flk-1/KDR genes in the lung vasculature (16Tuder R.M. Flook B.E. Voelkel N.F. J. Clin. Invest. 1995; 95: 1798-1807Crossref PubMed Scopus (532) Google Scholar). Also, Flk-1/KDR and Flt-1 mRNAs were substantially up-regulated throughout the heart following myocardial infarction in the rat (17Li J. Brown L.F. Hibberd M.G. Grossman J.D. Morgan J.P. Simons M. Am. J. Physiol. 1996; 270: H1803-H1811PubMed Google Scholar). Furthermore, Flt-1 and Flk-1/KDR mRNAs are markedly up-regulated in ischemic regions of tumors such as glioblastoma multiforme (8Shweiki D. Itin A. Soffer D. Keshet E. Nature. 1992; 359: 843-845Crossref PubMed Scopus (4163) Google Scholar, 18Plate K.H. Breier G. Weich H.A. Risau W. Nature. 1992; 359: 845-848Crossref PubMed Scopus (2122) Google Scholar, 19Phillips H.S. Armanini M. Stavrou D. Ferrara N. Westphal M. Int. J. Oncol. 1993; 2: 913-919PubMed Google Scholar). However, in vitro studies have yielded conflicting findings. Although Thieme et al. (20Thieme H. Aiello L.P. Ferrara N. King G.L. Diabetes. 1995; 44: 98-103Crossref PubMed Google Scholar) have shown that hypoxia increases VEGF receptor number by 50% in cultured bovine retinal capillary endothelial cells, the levels of Flk-1/KDR mRNA appeared to be down-regulated. Also, while an up-regulation of Flt-1 mRNA in response to hypoxia was found in cultured pericytes (21Takagi H. King G.L. Aiello L.P. Diabetes. 1996; 45: 1016-1023Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar) or in microvessels in skin explants (22Detmar M. Brown L.F. Berse B. Jackman R.W. Elicker R.W. Dvorak H.F. Claffey K.P. J. Invest. Dermatol. 1997; 108: 263-268Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (236) Google Scholar), others failed to detect a similar up-regulation of Flt-1 in human umbilical vein endothelial (HUVE) cells (23Waltenberger J. Mayr U., S., P. Hombach V. Circulation. 1996; 94: 1647-1654Crossref PubMed Scopus (232) Google Scholar). Furthermore, Brogiet al. (24Brogi E. Schatteman G. Wu T. Kim E.A. Varticovski L. Keyt B. Isner J.M. J. Clin. Invest. 1996; 97: 469-476Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar) reported that the Flk-1/KDR mRNA is not directly induced by hypoxia in HUVE cells or in microvascular endothelial cells. It has been suggested that the in vivoup-regulation of Flk-1/KDR receptor expression is mediated by a paracrine factor released by ischemic tissues (24Brogi E. Schatteman G. Wu T. Kim E.A. Varticovski L. Keyt B. Isner J.M. J. Clin. Invest. 1996; 97: 469-476Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar) or by post-transcriptional mechanisms such as increased mRNA stability (23Waltenberger J. Mayr U., S., P. Hombach V. Circulation. 1996; 94: 1647-1654Crossref PubMed Scopus (232) Google Scholar). Using real time RT-PCR technology, we found an up-regulation of theFlt-1 expression compared with the Flk-1/KDR in HUVE cells. Sequence analysis of the mouse and human Flt-1 promoter revealed a heptamer element highly homologous to the HIF consensus sites present in the 5′-region of mouse and human VEGF genes and the 3′-enhancer of the human EPO gene. So far, such a homologous element could be found neither in the human nor in the mouseFlk-1 promoter sequences available. In the present study, we provide evidence that a 40-bp sequence including such an element is sufficient to confer hypoxia inducibility when tested in a heterologous promoter context and revealed enhancer-like features. These differences in the regulation further emphasize the different roles played by these receptors in mediating VEGF biological responses. A 129Sv/ev male genomic library in λGEM-11 vector (Promega, Madison, WI), generated by partial Sau3A digestion, was screened with a set of overlapping oligonucleotides covering the 5′-end of the leader sequences of the mouse Flt-1 andFlk-1 gene, respectively (25Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). Oligonucleotide probes used to isolate the mouse Flt-1 gene were mFlt-1 probe 1 and probe 2. For the mouse Flk-1 gene, oligonucleotide mFlk-1 probe 1 and probe 2 were radioactively labeled after annealing in a Klenow fill-in reaction (DNA Polymerase I, Large (Klenow) fragment (25Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). For sequences of oligonucleotides, see Table I. All enzymes used were from New England Biolabs (Beverly, MA), unless otherwise indicated. 16 pmol of each oligonucleotide was present in 20 μl of 10 mmTris-HCl, 10 mm MgCl2, 50 mm NaCl, 1 mm dithiothreitol, heated for 10 min at 55 °C, and allowed to cool for 10 min at room temperature. The mixture was made 100 μm for dGTP, dTTP, and dATP. 2 units of Klenow fragment were then added, and the total volume was adjusted to 50 μl. The labeling reaction occurred at 37 °C for 30 min in the presence of 50 μCi of [32P]dCTP (3000 mCi/mmol, Amersham Corp. Three overlapping but not identical clones of each gene were isolated. The restriction maps of these genes were generated using the partial restriction method (25Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar) (data not shown). Fragments were cloned into pBluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA). A 3.5-kb NcoI fragment of the Flt-1 gene and a 2.1-kb PstI fragment from the Flk-1 phages were subcloned into pGEM5 or pSK to generate pGEM5Flt-1(NcoI) and pSKFlk-1(PstI), respectively. Sequencing reactions were performed in an automatic sequencer (model 373A, Applied BioSystems, Foster City, CA). Both strands of the Flt-1 promoter including the region from −3181 to +352 and the region between −1824 and +148 of the Flk-1 promoter were sequenced by cycle sequencing. Sequence analysis was done using the Sequencher 3.1 program (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).Table ISequences of oligonucleotide primers and real time RT-PCR probesmFlt-1 probe 1GGT CAG CTG CTG GGA CAC CGC GGT CTT GCC TTA CGC GCT GCT CGG GTG TCT GCmFlt-1 probe 2GGC ACT TTT AAC TTC GAC CCT GAG CCA TAT CCT GTG AGA AGC AGA CAC CCG AGC AGC GCGmFlk-1 probe 1GGG GCC ATA CCG CCT CTG TGA CTT CTT TGC GGG CCA GGG ACG GAG AAG GAG TCT GmFlk-1 probe 2CTC CCT GGG CAC AGA GCC CAG TTT CTC AGG CAC AGA CTC CTT CTC CGT CCCmFlt-HIE30–1TCG CCA ATT GAG GAA CAA CGT GGA ATT AGT GTC ATGmFlt-HIE30–2TCG ACA TGA CAC TAA TTC CAC GTT GTT CCT CAA TTGmFlt-HIE40–1GAT CCT GCA TAA TTG AGG AAC AAC GTG GAA TTA GTG TCA TCG TAA GmFlt-1HIE40–2TCG ACT TAC GAT GAC ACT AAT TCC ACG TTG TTC CTC AAT TAT GCA GmFlt-HIE50–1TCG AGA TGG ATG CAT AAT TGA GGA ACA AGC TGG AAT TAG TGT CAT CGT AAA TGA TCmFlt-HIE50–2ACG TGA TCA TTT ACG ATG ACA CTA ATT CCA CGT TGT TCC TCA ATT ATGmFlt-HIE50–234A1TCG AGA TGG ATG CAT AAT TGA GGA ACA AAA AGG AAT TAG TGT CAT CGT AAA TGA TCmFlt-HIE50–234A2ACG TGA TCA TTT ACG ATG ACA CTA ATT CCT TTT TGT TCC TCA ATT ATG CAT CCA TChEPOHIE-1TCG AGG CCC TAC GTG CTG TCT CAC ACA GCC TGT TCT GAC CTC TCG ACC TAC CGG CChEPOHIE-2TCG AGG CCG GTA GGT CGA GAG GTC AGA ACA GGC TGT GTG AGA CAG CAC GTA GGG CChVEGFHIE-1TCG AGC ACA GTG CAT ACG TGG GCT TCC ACA ChVEGFHIE-2TCG AGT GTG GAA GCC CAC GTA TGC ACT GTG CmFlt-1HIE264.FGAC TAC GCG TCA CGG GTA TCT GGC AGG TTC TAmFlt-1HIE264.RGAC TAC GCG TGA AAC GCT GGA TGG AAA ACA AAmFlt-1HIE100.FGAC TAC GCG TCC GGG ACG ACT TCA GCC TmFlt-1HIE100.RGAC TAC GCG TGG GTG AAA TTA ACT TGA GAC ACT AGA TCHUMKDR 2530.FGGC CAA GAG ATT GAA GCA GAT CHUMKDR 3043.RACT TTC GCG ATG CCA AGA ACT CHUMKDR 2872.FP5′(FAM)-ACT GGT GAT GCT GTC CAA GCG CCG TTT-(TAMRA)p3′HSFLT 2689.RCCC ACT TGC TGG CAT CAT AAG GHSFLT 2228.FCAC CAT ACC TCC TGC GAA ACC THSFLT 2549.FP5′(FAM)-TGG CTG CGA CTC TCT TCT GGC TCC TAT-(TAMRA)p3′ Open table in a new tab Primary cultures of HUVE cells were obtained from Clonetics (San Diego, CA). Cells were maintained in the presence of endothelial growth medium (EGM; Clonetics). EGM consists of endothelial basic medium plus 0.1 ng/ml recombinant human EGF, 10 μg/ml hydrocortisone, 500 μg/ml gentamycin, 500 ng/ml amphotericin B, 12 μg/ml bovine brain extract, and 2% fetal bovine serum. 24 h before exposure to hypoxia, cells were trypsinized and plated on gelatinized 10-cm culture dishes to a density of 8.8 × 103 cells/cm2. Dishes were then floated with preanalyzed gas mixture for 20 min and kept in 0% O2, 5% CO2, and 95% N2 at 37 °C for various durations. Oxygen concentration in the incubators was monitored by a portable oxygen analyzer (Teldyne Brown Engineering, San Leandro, CA). HeLa cells (ATCC number CRL 7923) were maintained in high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies, Inc.) supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin. Hep3B cells (ATCC number HB-8064) were grown in minimal essential medium with Earle's salts with nonessential amino acids, without glutamine (Life Technologies), complemented with 2 mml-glutamine, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin. For transient expression in Hep3B cells, 0.5 μg of test DNA and 0.5 μg of reference template were added to each well of six-well plates. Cells were at a density of 0.5 × 106/well. Plasmid DNA was prepared by using commercial kits (Qiagen, Santa Clara, CA) and introduced into cells by electroporation with a Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA) at 260 V and 960 microfarads following the manufacturer's instructions. Quadruplicate electroporations were pooled and split into six-well plates with 5 ml of medium in each well. Cells were then allowed to recover for 24 h in a 5% CO2, 95% air incubator at 37 °C. Following medium change, triplicate wells were placed in a hypoxic (0% O2, 5% CO2) or in a normoxic (5% CO2, air) incubator for the indicated duration of time. Cell extracts were generated by incubation in 500 μl of 1 × passive lysis buffer solution (dual luciferase assay; Promega) at room temperature for 15 min and frozen at −70 °C. 10 μl of the extracts were analyzed in a luminometer (TD-20e, Turner Designs, Inc., Mountain View, CA) using the reagents provided in the kit. Light production was measured for 15 s, and results were expressed as relative light units (RLU). The mean RLU was corrected with the signals obtained from the reference constructs. The relative luciferase activity (mean ± S.E.) was calculated as luciferase (RLU)/Renilla luciferase (RLU). 1 μg of test DNA and 0.1 μg/well CMV-RLluciferase control vector (dual luciferase assay; Promega) were used for transient transfection of 0.2 × 106 HeLa cells/well in six-well plates. Immediately before the addition of the DNA-liposome complex, cells were washed twice with phosphate-buffered saline. The plasmid DNA mix was then added to a 15-ml Falcon tube containing 0.1 ml of Opti-MEM1 and mixed. 10 μl of Lipofectin (Life Technologies, Inc.) were added to another 15-ml tube containing 0.1 ml of Optim-MEM1 and mixed. Plasmid DNA and Lipofectin were mixed and incubated at room temperature to allow the complex to form. After 15 min, the DNA-liposomal complex was diluted with 0.8 ml of Opti-MEM1 (Life Technologies, Inc.), mixed, and layered gently on top of the cells. Cells were then incubated at 37 °C for 14–16 h. After removal of the DNA-liposome mixture, 3 ml of complemented medium was added 24 h before exposure to hypoxia. For final luciferase assay, cells were lysed in 200-μl passive lysis buffer (Promega). Cell lysates were then transferred into a 1.5-ml microcentrifuge tube and cleared by centrifugation at 10,000 rpm for 1 min at 4 °C. Luciferase andRenilla luciferase activity were measured by mixing 20 μl of extract with 100 μl of luciferase assay buffer and the subsequent addition of 100 μl of Stop and Glow solution, respectively. To generate the luciferase reporter vector containing the mouseFlt-1 promoter, the KpnI-XhoI promoter fragment was ligated into the KpnI and XhoI sites of pGL2-basic plasmid (Promega, Madison, WI). This resulted in the Flt-1-(−2778/+209)-luc construct. A series of 5′-promoter deletions were then generated by double digestion with various restriction enzymes followed by blunt end reaction and religation by standard cloning techniques (25Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). For the Flt-1-(−1464/+209)-luc construct,KpnI and PvuII were used; for Flt-1-(−977/+209)-luc KpnI and NsiI. For Flt-1-(−547/+209)-luc, KpnI and AflII were used, and for the Flt-1-(−202/+209)-luc construct, KpnI andBssHI were used (see Fig. 4 A). The constructs mFlt-HIE50, HIE40, HIE30, HIE50–234A, hEPO HIE, and hVEGF HIE were made by ligation of the corresponding oligonucleotide set into the SalI site 2.8 kb upstream of the SV40 promoter (“enhancer” position) or into the XhoI site (“promoter” position) of the pGL2SV40prom vector (Promega). For oligonucleotide sequences, see Table I. Phosphorylation of 50 pmol of the corresponding oligonucleotide set was carried out in 70 mm Tris-HCl (pH 7.6), 10 mm MgCl2, 5 mm dithiothreitol, 5 mm rATP (Pharmacia Biotech Inc.) and 10 units of T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Beverly, MA) for 1 h at 37 °C in a total volume of 20 μl. The reaction mixture was heated for 10 min at 65 °C and slowly cooled to room temperature. 0.1 μl of this mix was used in ligation reactions. Constructs mFlt-1HIE264 and mFlt-1HIE100 were generated by PCR (25Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar) of pGEM5Flt-1(NcoI) using the oligonucleotides mFlt-1HIE264.F and mFlt-1HIE264.R and oligonucleotides mFlt-1HIE100.F and mFlt-1HIE100.R, respectively. The PCR products were subcloned into pSK to generate pSKmFlt-1HIE264 and pSKmFlt-1HIE100, respectively. The inserts were cut by BamHI and SalI and cloned in “enhancer” position in pGL2prom, as above described. To clone these inserts in “promoter” position in pGL2SV40prom, they were cut withXhoI and SacI and then cloned into theXhoI site of the reporter plasmid. All constructs were analyzed by restriction digestion analysis and partial sequencing. HUVE cells from pooled donors were cultured as described under “Cell Cultures.” Cells were initially expanded for 8–10 days in the presence of EGM. 38 h prior to exposure to hypoxia, cells were split and seeded at a density of 100,000 cells/well in six-well plates in EGM. Immediately prior to hypoxic incubation (0% O2, 5% CO2, 95% N2), cells were washed once, and then 5 ml of assay medium (endothelial basic medium plus 2% fetal bovine serum, 10 μg/ml hydrocortisone, 500 μg/ml gentamycin, 0.5 μg/ml amphotericin-B) was added to each well. After incubations of various duration, cells were harvested by the STAT 60 method (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX), and total RNA was prepared according to the manufacturer's recommendations. The RNA was dissolved in 50 μl of H2O, and its concentration was determined by spectrophotometer (A 260). To monitor gene expression, we used real time RT-PCR analysis. This novel approach has been described previously (26Heid C.A. Stevens J. Livak K.J. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 986-994Crossref PubMed Scopus (5020) Google Scholar, 27Gibson U.E.M. Heid C.A. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 995-1001Crossref PubMed Scopus (1778) Google Scholar). Briefly, a gene-specific PCR oligonucleotide primer pair defines the “amplicon.” Within the amplicon, an oligonucleotide probe labeled with a reporter fluorescent dye (FAM) at the 5′-end and a quencher fluorescent dye (TAMRA) at the 3′-end are designed. When the probe is intact, the reporter dye emission is quenched. During the extension phase of the PCR cycle, the nucleolytic activity of the DNA polymerase cleaves the hybridization probe and releases the reporter dye from the probe. Fluorescence intensity produced during PCR amplifications is monitored by the sequence detector directly in the reaction tube (“real time”). A computer algorithm compares the amount of reporter dye emission with the quenching dye emission and calculates the threshold cycle number (C T), when signals reach 10 times the standard deviation of the base line. It was demonstrated that the calculated C T values are a quantitative measurement for the mRNA levels of various genes tested (27Gibson U.E.M. Heid C.A. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 995-1001Crossref PubMed Scopus (1778) Google Scholar). 100 ng of total RNA was added to a 50-μl RT-PCR reaction (PCR-Access, Promega). The reaction master mix was prepared according to the manufacturer's protocol to give final concentrations of 1 × avian myeloblastosis virus/Tfl reaction buffer, 0.2 mm dNTPs, 1.5 mm MgSO4, 0.1 unit/ml avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, 0.1 unit/μlTfl DNA polymerase, 250 nm concentration of the primers, and 200 nm concentration of the corresponding probe, as described by Gibson et al. (27Gibson U.E.M. Heid C.A. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 995-1001Crossref PubMed Scopus (1778) Google Scholar). Primers and probes for real time PCR analysis of Flt-1 andFlk-1/KDR genes were designed by the Oligo version 4.0 program (National Bioscience, Plymouth, MN), according to Heid et al. (26Heid C.A. Stevens J. Livak K.J. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 986-994Crossref PubMed Scopus (5020) Google Scholar). For sequences of all oligonucleotides used, see TableI. The primers for the humanFlk-1/KDR gene were HUMKDR 2530.F and HUMKDR 3043.R, and the probe was HUMKDR 2872.FP. For Flt-1 analysis, the following primers were used: HSFLT 2689.R and HSFLT 2228.F; the probe was HSFLT 2549.FP. Primers and probes were synthesized at Genentech using conventional nucleic acid synthesis chemistry. The β-actin primer and probe (TaqMan β-actin detection reagents) were purchased from Perkin-Elmer and Applied Biosystems. RT-PCR reactions and the resulting relative increase in reporter fluorescent dye emission were monitored in real time by the 7700 sequence detector (Perkin-Elmer). Signals were analyzed by the sequence detector 1.0 program (Perkin-Elmer). Conditions were as follows: 1 cycle at 48 °C for 45 min, 1 cycle at 94 °C for 2 min, 40 cycles at 94 °C for 30 s, 60 °C for 1 min, 68 °C for 2 min. Data were generated as indicated in the legend to Fig. 1. To determine whether the VEGF receptors are directly regulated by hypoxia in endothelial cells, primary HUVE cells were incubated in hypoxic conditions (0% O2, 5% CO2) and analyzed for VEGF receptor gene expression by real time quantitative RT-PCR analysis (27Gibson U.E.M. Heid C.A. Williams P.M. Genome Res. 1996; 6: 995-1001Crossref PubMed Scopus (1778) Google Scholar). In two independent experiments conducted with different HUVE cell preparations derived from different donors,Flt-1 levels were induced 4.2 ± 0.8-fold after 32 h of growth in hypoxia. Expression levels for Flk-1/KDR were unchanged or weakly down-regulated at the same time point. Time course experiments revealed a 2–3-fold stimulation of Flt-1 after 60 h in hypoxia (Fig.1 A), whereas theFlk-1/KDR levels were moderately down-regulated during the same period (Fig. 1 B). Initial Northern blot experiments yielded essentially similar results (data not shown). To test if the differential regulation of the VEGF receptor genes is due to transcriptional regulatory regions, promoter regions located upstream of both genes were isolated and tested for their ability to respond to hypoxia in fusion constructs with the luciferase gene. To isolate the 5′-flanking region of the murine Flk-1 andFlt-1 genes, a genomic DNA library from 129Sv/ev mice was screened using probes corresponding to the signal peptide sequence of their respective gene products. For each receptor gene, three independent phage clones were isolated and analyzed by restriction mapping. To exclude the possibility of recombination artifacts, genomic DNA from 129/SvJ mice (Stratagene) was analyzed by Southern blot hybridization and showed identical restriction fragments (data not shown). A 3.4-kb KpnI/NcoI Flt-1 and a 2.1-kbPstI Flk-1/KDR were subcloned into pSK vector (Stratagene) and used for further analysis. The nucleotide sequence of the KDR/Flk-1 promoter region (−1829/+148) and the comparison with the human sequence (−780/+148) (28Patterson C. Perrella M.A. Hsieh C.-M. Yoshizumi M. Lee M.-E. Haber E. J. Biol. Chem. 1995; 270: 23111-23118Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (140) Google Scholar) are shown in Fig. 2 A. Mouse Flt-1 promoter sequences (−3181/+276) and the comparison with the available human gene sequence (−1195/+276) (29Morishita K. Johnson D.E. Williams L.T. J. Biol. Chem. 1995; 270: 27948-27953Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (106) Google Scholar,30Ikeda T. Wakiya K. Shibuya M. Growth Factors. 1996; 13: 1151-1162Crossref Scopus (22) Google Scholar), are shown in Fig. 2 B. The sequence comparison between the human and mouse Flt-1 genes revealed 78% similarity in a 1.5-kb promoter region (Fig. 2 A). Flk-1/KDRexhibited a 60% similarity in a 0.9-kb promoter region. Interestingly, comparison of the coding regions between the human and mouse genes reveals a 75% similarity for Flt-1 (31Shibuya M. Yamaguchi S. Yamane A. Ikeda T. Tojo A. Matsushime H. Sato M. Oncogene. 1990; 8: 519-527Google Scholar, 32Finnerty H. Kelleher K. Morris G.E. Bean K. Merberg D.M. Kriz R. Morris J.C. Sookdeo H. Turner K.J. Wood C.R. Oncogene. 1993; 8: 2293-2298PubMed Google Scholar) and 85% for Flk-1/KDR (33Matthews W. Jordan C.T. Gavin M. Jenkins N.A. Copeland N.G. Lemischka I.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 9026-9030Crossref PubMed Scopus (450) Google Scholar, 34Terman B.I. Carrion M.E. Kovacs E. Rasmussen B.A. Eddy R.L. Shows T.B. Oncogene. 1991; 6: 1677-1683PubMed Google Scholar). T

The vascular endothelium was once thought to function primarily in nutrient and oxygen delivery, but recent evidence suggests that it may play a broader role in tissue homeostasis. To explore the role of sinusoidal endothelial cells (LSECs) in the adult liver, we studied the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor activation on mouse hepatocyte growth. Delivery of VEGF-A increased liver mass in mice but did not stimulate growth of hepatocytes in vitro, unless LSECs were also present in the culture. Hepatocyte growth factor (HGF) was identified as one of the LSEC-derived paracrine mediators promoting hepatocyte growth. Selective activation of VEGF receptor-1 (VEGFR-1) stimulated hepatocyte but not endothelial proliferation in vivo and reduced liver damage in mice exposed to a hepatotoxin. Thus, VEGFR-1 agonists may have therapeutic potential for preservation of organ function in certain liver disorders.

Preclinical models have examined the pharmacologic and pharmacodynamic activities of an anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) humanized, monoclonal antibody, bevacizumab, and/or its murine equivalent A4.6.1. These studies found that single-agent therapy with bevacizumab/A4.6.1 resulted in tumor growth inhibition of 20 different human tumor cell lines (13 tumor types) implanted into nude mice irrespective of the route of administration or tumor location. Several of these studies also observed significant inhibition of tumor metastases. Various studies have examined the feasibility of combining anti-VEGF therapy with cytotoxic or biological agents. Combining bevacizumab/A4.6.1 with doxorubicin, topotecan, paclitaxel, docetaxel, or radiotherapy resulted in additive or synergistic tumor growth inhibition. Changes in vascular functions were frequently reported, including decreased vessel diameter, density, and permeability in response to treatment. A reduction in interstitial fluid pressure was also observed. In some studies, these improvements resulted in an increase in intratumoral uptake of chemotherapy, implying that the most effective use of anti-VEGF therapy is in combination with chemotherapy. Alternatively, combination treatment with radiation increased tumor oxygenation and tumor growth inhibition. Interestingly, anti-VEGF therapy has also been reported to reduce the development of ascites in ovarian mouse models. Finally, safety pharmacology studies with bevacizumab in cynomolgus monkeys showed that this agent is generally well tolerated with no unexpected adverse events.

Many transcription factors contain proline- or glutamine-rich activation domains. Here it is shown that simple homopolymeric stretches of these amino acids can activate transcription when fused to the DNA binding domain of GAL4 factor. In vitro, activity increased with polymer length, whereas in cell transfection assays maximal activity was achieved by 10 to 30 glutamines or about 10 prolines. Similar results were obtained when glutamine stretches were placed within a [GAL4]-VP16 chimeric protein. Because these stretches are encoded by rapidly evolving triplet repeats (microsatellites), they may be the main cause for modulation of transcription factor activity and thus result in subtle or overt genomic effects.

We deleted the hypoxia-responsive transcription factor HIF-1alpha in endothelial cells (EC) to determine its role during neovascularization. We found that loss of HIF-1alpha inhibits a number of important parameters of EC behavior during angiogenesis: these include proliferation, chemotaxis, extracellular matrix penetration, and wound healing. Most strikingly, loss of HIF-1alpha in EC results in a profound inhibition of blood vessel growth in solid tumors. These phenomena are all linked to a decreased level of VEGF expression and loss of autocrine response of VEGFR-2 in HIF-1alpha null EC. We thus show that a HIF-1alpha-driven, VEGF-mediated autocrine loop in EC is an essential component of solid tumor angiogenesis.

Endocrine pancreatic β cells require endothelial signals for their differentiation and function. However, the molecular basis for such signals remains unknown. Here, we show that β cells, in contrast to the exocrine pancreatic cells, do not form a basement membrane. Instead, by using VEGF-A, they attract endothelial cells, which form capillaries with a vascular basement membrane next to the β cells. We have identified laminins, among other vascular basement membrane proteins, as endothelial signals, which promote insulin gene expression and proliferation in β cells. We further demonstrate that β1-integrin is required for the β cell response to the laminins. The proposed mechanism explains why β cells must interact with endothelial cells, and it may apply to other cellular processes in which endothelial signals are required.