The activities of cyclin D-dependent kinases serve to integrate extracellular signaling during G 1 phase with the cell-cycle engine that regulates DNA replication and mitosis. Induction of D-type cyclins and their assembly into holoenzyme complexes depend on mitogen stimulation. Conversely, the fact that D-type cyclins are labile proteins guarantees that the subunit pool shrinks rapidly when cells are deprived of mitogens. Phosphorylation of cyclin D1 on a single threonine residue near the carboxyl terminus (Thr-286) positively regulates proteasomal degradation of D1. Now, we demonstrate that glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) phosphorylates cyclin D1 specifically on Thr-286, thereby triggering rapid cyclin D1 turnover. Because the activity of GSK-3β can be inhibited by signaling through a pathway that sequentially involves Ras, phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3K), and protein kinase B (Akt), the turnover of cyclin D1, like its assembly, is also Ras dependent and, hence, mitogen regulated. In contrast, Ras mutants defective in PI3K signaling, or constitutively active mitogen-activated protein kinase-kinase (MEK1) mutants that act downstream of Ras to activate extracellular signal-regulated protein kinases (ERKs), cannot stabilize cyclin D1. In direct contrast to cyclin D1, which accumulates in the nucleus during G 1 phase and exits into the cytoplasm during S phase, GSK-3β is predominantly cytoplasmic during G 1 phase, but a significant fraction enters the nucleus during S phase. A highly stable D1 mutant in which an alanine is substituted for the threonine at position 286 and that is refractory to phosphorylation by GSK-3β remained in the nucleus throughout the cell cycle. Overexpression of an active, but not a kinase-defective, form of GSK-3β in mouse fibroblasts caused a redistribution of cyclin D1 from the cell nucleus to the cytoplasm. Therefore, phosphorylation and proteolytic turnover of cyclin D1 and its subcellular localization during the cell division cycle are linked through the action of GSK-3β.

The feline c-fms proto-oncogene product is a 170 kd glycoprotein with associated tyrosine kinase activity. This glycoprotein was expressed on mature cat macrophages from peritoneal inflammatory exudates and spleen. Similarly, the receptor for the murine colony-stimulating factor, CSF-1, is restricted to cells of the mononuclear phagocytic lineage and is a 165 kd glycoprotein with an associated tyrosine kinase. Rabbit antisera to a recombinant v-fms-coded polypeptide precipitated the feline c-fms product and specifically cross-reacted with a 165 kd glycoprotein from mouse macrophages. This putative product of the murine c-fms gene exhibited an associated tyrosine kinase activity in immune complexes, specifically bound murine CSF-1, and, in the presence of the growth factor, was phosphorylated on tyrosine in membrane preparations. The murine c-fms proto-oncogene product and the CSF-1 receptor are therefore related, and possibly identical, molecules.

The INK4a tumor suppressor locus encodes p16 INK4a, an inhibitor of cyclin D-dependent kinases, and p19 ARF, an alternative reading frame protein that also blocks cell proliferation. Surprisingly, mice lacking p19 ARF but expressing functional p16 INK4a develop tumors early in life. Their embryo fibroblasts (MEFs) do not senesce and are transformed by oncogenic Ha-ras alone. Conversion of ARF+/+ or ARF+/− MEF strains to continuously proliferating cell lines involves loss of either p19 ARF or p53. p53-mediated checkpoint control is unperturbed in ARF-null fibroblast strains, whereas p53-negative cell lines are resistant to p19 ARF-induced growth arrest. Therefore, INK4a encodes growth inhibitory proteins that act upstream of the retinoblastoma protein and p53. Mutations and deletions targeting this locus in cancer cells are unlikely to be functionally equivalent.

Establishment of primary mouse embryo fibroblasts (MEFs) as continuously growing cell lines is normally accompanied by loss of the p53 or p19 ARF tumor suppressors, which act in a common biochemical pathway. myc rapidly activates ARF and p53 gene expression in primary MEFs and triggers replicative crisis by inducing apoptosis. MEFs that survive myc overexpression sustain p53 mutation or ARF loss during the process of establishment and become immortal. MEFs lacking ARF or p53 exhibit an attenuated apoptotic response to myc ab initio and rapidly give rise to cell lines that proliferate in chemically defined medium lacking serum. Therefore, ARF regulates a p53-dependent checkpoint that safeguards cells against hyperproliferative, oncogenic signals.

Abstract

 Three mouse cyclin-like (CYL) genes were lsolated, two of which are regulated by colony-stimulating factor 1 (CSF-1) during the G1 phase of the macrophage cell cycle. CSF-1 deprivation during G1 leads to rapid degradation of CYL proteins (p36^CYL) and correlates with fallure to initiate DNA synthesis. However, after entering S phase, macrophages no longer require CSF-1 and can complete cell division without expressing CYL genes. During G1, p36^CYL is phosphorylated and associates with a polypeptide antigenically related to p34^cdc2. The timing of p36^CYL expression, its rapid turnover in the absence of CSF-1, and its phosphorylation and transient binding to a cdc2-related polypeptide suggest that CYL genes may function during S phase commitment.

Article15 March 1999free access The p21Cip1 and p27Kip1 CDK ‘inhibitors’ are essential activators of cyclin D-dependent kinases in murine fibroblasts Mangeng Cheng Mangeng Cheng Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Search for more papers by this author Paul Olivier Paul Olivier Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author J.Alan Diehl J.Alan Diehl Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Matthew Fero Matthew Fero Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Martine F. Roussel Martine F. Roussel Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Search for more papers by this author James M. Roberts James M. Roberts Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Charles J. Sherr Corresponding Author Charles J. Sherr Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Mangeng Cheng Mangeng Cheng Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Search for more papers by this author Paul Olivier Paul Olivier Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author J.Alan Diehl J.Alan Diehl Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Matthew Fero Matthew Fero Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Martine F. Roussel Martine F. Roussel Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Search for more papers by this author James M. Roberts James M. Roberts Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Charles J. Sherr Corresponding Author Charles J. Sherr Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA Howard Hughes Medical Institute, USA Search for more papers by this author Author Information Mangeng Cheng1, Paul Olivier2,3, J.Alan Diehl1,3, Matthew Fero2,3, Martine F. Roussel1, James M. Roberts2,3 and Charles J. Sherr 1,3 1Department of Tumor Cell Biology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, TN, 38105 USA 2Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, 98104 USA 3Howard Hughes Medical Institute, USA *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (1999)18:1571-1583https://doi.org/10.1093/emboj/18.6.1571 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The widely prevailing view that the cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) are solely negative regulators of cyclin-dependent kinases (CDKs) is challenged here by observations that normal up-regulation of cyclin D–CDK4 in mitogen-stimulated fibroblasts depends redundantly upon p21Cip1 and p27Kip1. Primary mouse embryonic fibroblasts that lack genes encoding both p21 and p27 fail to assemble detectable amounts of cyclin D–CDK complexes, express cyclin D proteins at much reduced levels, and are unable to efficiently direct cyclin D proteins to the cell nucleus. Restoration of CKI function reverses all three defects and thereby restores cyclin D activity to normal physiological levels. In the absence of both CKIs, the severe reduction in cyclin D-dependent kinase activity was well tolerated and had no overt effects on the cell cycle. Introduction Regulation of mammalian cell proliferation by extracellular mitogens is governed through receptor-mediated signaling circuits which ultimately converge on the cell cycle machinery driven by cyclin-dependent kinases (CDKs) and opposed by CDK inhibitors (CKIs) (Sherr and Roberts, 1995). One important example is receptor-activated Ras signaling, which governs the accumulation of cyclin D1–CDK4 complexes by at least three independent but complementary pathways: gene transcription, protein association and protein stabilization. First, Ras signaling promotes transcription of the cyclin D1 gene via a kinase cascade that depends upon the sequential activities of Ras, Raf-1, mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs), also referred to as extracellular signal-regulated protein kinases (ERKs) (Albanese et al., 1995; Lavoie et al., 1996; Winston et al., 1996; Aktas et al., 1997; Kerkhoff and Rapp, 1997; Weber et al., 1997). Signaling through this same pathway is also sufficient to promote assembly of cyclin D1–CDK4 complexes (Cheng et al., 1998), although the physiological target of ERK phosphorylation that mediates this process has not been defined. Finally, proteasomal degradation of cyclin D1 is triggered by its phosphorylation on a single threonine residue (Thr286) by glycogen synthase kinase-3β (Diehl et al., 1997, 1998), a process antagonized by signaling through a separate Ras-dependent pathway involving phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and protein kinase B (also called Akt) (Boudewijn et al., 1995; Cross et al., 1995; Franke et al., 1995, 1997; Klinghoffer et al., 1996; Dudek et al., 1997; Vanhaesebroeck et al., 1997). In the continued presence of mitogenic signals, cyclin D1–CDK4 complexes assemble and accumulate throughout G1 phase, enter the nucleus and undergo phosphorylation by CDK-activating kinase (CAK) to yield active holoenzymes. One key function of the cyclin D-dependent kinases is to initiate phosphorylation of the retinoblastoma protein (Rb), thereby helping to cancel its activity as a transcriptional repressor of a bank of genes, including cyclins E and A, whose activities are required for S phase entry (Weinberg, 1995; Sherr, 1996). A separate, non-catalytic action of cyclin D-dependent kinases is the sequestration of CKIs, including p27Kip1 and p21Cip1 (Sherr and Roberts, 1995). The Cip/Kip proteins interact with a variety of cyclin–CDK complexes through a conserved N-terminal domain that contains both cyclin and CDK binding sites (Toyoshima and Hunter, 1994; Chen et al., 1995, 1996; Luo et al., 1995; Nakanishi et al., 1995; Lin et al., 1996; Russo et al., 1996). Cyclin D-dependent CDKs isolated from mammalian cells appear to be less susceptible to Cip/Kip-mediated inhibition than are other classes of cyclin–CDKs (Soos et al., 1996; Blain et al., 1997; LaBaer et al., 1997), and sequestration of p21Cip1 and p27Kip1 into higher order complexes with cyclin D-dependent kinases during G1 phase helps to relieve cyclin E–CDK2 from their constraint, thereby facilitating its activation later in G1 phase. This ability to ‘titrate’ CKIs therefore sets a dependency of cyclin E-dependent kinase on the mitogen-stimulated assembly of cyclin D-dependent kinases. Cyclin E–CDK2 collaborates with cyclin D-dependent kinases to phosphorylate Rb (Hatakeyama et al., 1994; Mittnacht et al., 1994; Lee et al., 1996; Kelly et al., 1998; Lundberg and Weinberg, 1998), phosphorylates p27Kip1 to trigger its degradation (Sheaff et al., 1997; Vlach et al., 1997), and may target other proteins whose modifications trigger origin firing and DNA replication per se (Stillman, 1996; Krude et al., 1997). Although it is generally assumed that CKIs act solely to retard G1 progression, the fact that they can be found in complexes with active cyclin–CDKs (Zhang et al., 1994; Soos et al., 1996; Blain et al., 1997; LaBaer et al., 1997) raises the possibility that they may also act as positive regulators. Intriguingly, LaBaer et al. (1997) demonstrated that p21Cip1 could promote the assembly of active cyclin D1–CDK4 complexes and, in addition, could provide a localization signal for their nuclear import. However, the fact that p21 nullizygous mice undergo normal development and do not seem to have a significant deficiency in cyclin D-dependent kinase function (Brugarolas et al., 1995; Deng et al., 1995) leaves open the question of whether the CKIs are normal physiological regulators of cyclin D–CDK assembly. In this study, we have used primary mouse embryo fibroblast (MEF) strains deficient in p21, p27 or both to study their roles in governing the activities of cyclin D–CDK holoenzymes. Results Impaired assembly of cyclin D–CDK4 complexes in MEFs lacking p21 and p27 Cell lysates from asynchronously proliferating MEFs derived from wild-type mice, p21- and p27-null mice and from animals lacking both genes were precipitated with antibodies to cyclin D1 or CDK4. Precipitated proteins were resolved on denaturing polyacrylamide gels, transferred to nitrocellulose membranes and blotted with the cognate antibodies to quantitate cyclin D1 and CDK4 levels, respectively, or with the reciprocal antibodies to score for the presence of cyclin D1–CDK4 complexes (Figure 1A). In early passage (p5) wild-type MEFs, ∼40% of the total CDK4 (lane 1, K4 blot) co-precipitated with antibodies to D1 (lane 2, K4 blot). A smaller percentage of the total D1 pool (lane 2, D1 blot) co-precipitated with CDK4 (lane 1, D1 blot). However, antibodies to full-length recombinant CDK4 used in this experiment preferentially detect free versus cyclin D1-bound catalytic subunits, so the amount of D1 detected in CDK4 immunoprecipitates underestimates the extent of complex formation. Generally equivalent levels of CDK4 were expressed in MEF strains lacking one or both CKIs (Figure 1A, lanes 3, 5 and 7). In contrast, the overall levels of cyclin D1 were significantly lowered in cells lacking either p21 or p27 (D1 blot, lanes 6 and 8 versus lane 2) and were decreased at least 10-fold in lysates of cells lacking both CKIs (lane 4). Cyclin D1–CDK4 complexes were recovered at similarly reduced levels from lysates of p21-null and p27-null MEFs (lanes 5–8), but at this level of resolution, no cyclin D1–CDK4 complexes were detected in immune precipitates from cells lacking both CKIs (lanes 3 and 4). Figure 1.Impaired assembly of cyclin D–CDK4 complexes in MEFs lacking p21 and p27. (A) Cell lysates (500 μg total protein per lane) from MEFs of the indicated genotypes were immunoprecipitated (IP) with antibodies to CDK4 (K4) or cyclin D1 and the separated proteins were blotted with the cognate or reciprocal antibodies. (B) Cell lysates were normalized for cyclin D1 abundance, and D1 immune precipitates were blotted with antibodies to cyclin D1 or CDK4. Two electrophoretic forms of cyclin D1 detected in this experiment can be routinely observed when separation conditions are sufficiently stringent (Matsushime et al., 1991); both are phosphoproteins and the nature of the differences between them remains unclear (Diehl et al., 1998). (C) Wild-type or p21/p27 double-null MEFs were infected with retrovirus encoding Flag-tagged cyclin D1. Cell lysates prepared 48 h post-infection were precipitated with a control monoclonal antibody (C) or with antibodies to the Flag epitope (M2), and the separated proteins were blotted with antibodies to cyclin D1 or CDK4. (D) Cell lysates from MEFs with the indicated genotypes were precipitated with antibodies to cyclin D2 and the separated proteins were blotted with antibodies to cyclin D2 or CDK4. All immunoblots were visualized using enhanced chemiluminescence. Download figure Download PowerPoint Reduced cyclin D1–CDK4 complex formation in double-null MEFs may have simply reflected the lower levels of cyclin D1 expressed in these cells. However, several lines of evidence indicate that this is not the explanation. First, when cell lysates were normalized so that each contained comparable amounts of cyclin D1 protein, the levels of CDK4 that co-precipitated with cyclin D1 were again found to be decreased in p21-null or p27-null cells (Figure 1B, lanes 2 and 3) and were very much reduced in p21/p27 double-null MEFs, whether the cells were in early (p7) or late (p15) passage (Figure 1B, lanes 4 and 6). We estimated that p7 double-null cells contained <10% of the D1–CDK4 complexes detected in age-matched wild-type MEFs. Secondly and more importantly, infection of p21/p27 double-null MEFs for 48 h with a retrovirus encoding Flag epitope-tagged cyclin D1 restored high levels of D1 expression but not D1–CDK4 complex formation (Figure 1C). This demonstrated directly that the lower levels of cyclin D1 expressed in the p21/p27 double-null cells do not account for the defect observed in cyclin D1–CDK4 assembly. MEFs also express cyclin D2 (Figure 1D, lane 1) but little detectable cyclin D3 (data not shown). Compared with wild-type MEFs, cyclin D2 levels were reduced by ∼30% in cells lacking either p21 (lane 2) or p27 (lane 3) and, like D1, were significantly decreased in cells lacking both CKIs (lane 4). Despite the fact that the D2 signal in Figure 1D exceeds the D1 signal in Figure 1A and B, quantitation of the two cyclins by comparison with recombinant protein standards indicated that the level of D1 exceeds that of D2 by 2- to 3-fold (data not shown). Cyclin D2–CDK4 complexes were readily detected in wild-type MEFs and in those lacking either CKI but were significantly reduced in cells lacking both inhibitors (Figure 1D, K4 blot). In agreement with previous data showing that CDK4 is the predominant partner of D-type cyclins in rodent fibroblasts (Matsushime et al., 1994), virtually no cyclin D1–CDK6 or D2–CDK6 complexes were detected in MEFs. D-type cyclin binding is essential for activating CDK4 kinase activity (Matsushime et al., 1992). Since association of D-type cyclins with CDK4 was significantly compromised in the p21/p27 double null MEFs, both cyclin D1-dependent and total CDK4 kinase activity were measured in these cells (Figure 2A). Cell lysates from proliferating MEFs were precipitated with either non-immune rabbit serum (NRS), antibody to cyclin D1 or antibody to CDK4, and the resulting immune complexes were assayed for kinase activity using recombinant GST-Rb as the substrate. Note that CDK4-dependent kinase activity should include contributions from both D1- and D2-containing holoenzymes (Figure 1). Active cyclin D1- and CDK4-dependent Rb kinase activities were detected in precipitates from wild-type MEFs (Figure 2A, lanes 2 and 6), p21-null MEFs (lanes 3 and 7) and p27-null MEFs (lanes 4 and 8). In contrast, only background levels of kinase activity were detected in immune complexes recovered from p21/p27 double-null MEFs (lanes 5 and 9), consistent with observations that few cyclin D–CDK4 complexes were formed (Figure 1). Figure 2.Cyclin D1 and CDK4-dependent Rb kinase activity in MEFs lacking p21 and p27. (A) Lysates from MEFs of the indicated genotypes were precipitated with non-immune rabbit serum (NRS) or with antibodies to cyclin D1 or CDK4. Resulting complexes were assayed for kinase activity using GST-Rb as the substrate. (B) Lysates from cells of the indicated genotype were depleted of p21, p27 or both, and then precipitated with antibodies to CDK4 or control NRS. Washed immune complexes were assayed for Rb kinase activity. Download figure Download PowerPoint Cell lysates from wild-type MEFs were subjected to two rounds of immunodepletion using antisera to p21, p27 or to both, and CDK4 kinase activity was measured using glutathione S-transferase (GST)-Rb as the substrate. Removal of p27 (Figure 2B, lane 3) or p21 (lane 4) from lysates of wild-type MEFs partially reduced CDK4 kinase activity, whereas elimination of both p21 and p27 (lane 5) completely depleted the activity. Similarly, removal of p27 from lysates of p21-null MEFs (lane 7) or vice versa (lane 9) depleted all CDK4 kinase activity from these lysates. Therefore, both p21- and p27-associated cyclin D–CDK complexes retain activity (Zhang et al., 1994; Soos et al., 1996; Blain et al., 1997; LaBaer et al., 1997), consistent with results that either p21 or p27 is required for efficient assembly of active cyclin D–CDK4 complexes. p21 or p27 promotes assembly of stable cyclin D1–CDK4 complexes in double-null MEFs One prediction is that reintroduction of p21 or p27 into double-null MEFs should increase the assembly of cyclin D1–CDK4 complexes. We infected these cells either with a control retrovirus encoding the T-cell co-receptor CD8 or with retroviruses encoding either p21 or p27 (Figure 3A). Lysates prepared from MEFs infected for 48 h were precipitated with antibodies to cyclin D1 or CDK4, and assayed for complex formation. Ectopic expression of either p21 (Figure 3A, lane 3) or p27 (lane 4) but not CD8 (lane 1) increased cyclin D1–CDK4 complex formation in p21/p27 double-null MEFs. The N-terminal portion of p27, which contains the cyclin and CDK binding sites, is sufficient to promote the stable association of cyclin D1 and CDK4, whereas the C-terminal half of p27 is inactive in this assembly assay (data not shown). Ectopic expression of another CDK inhibitor, p16INK4a, which binds to CDK4 or CDK6 but not to D cyclins (Serrano et al., 1993), did not promote assembly of cyclin D1–CDK4 in these cells (data not shown). Ectopic expression of p21 or p27 not only increased the assembly of cyclin D–CDK4 complexes but also increased the overall levels of cyclin D1 in p21/p27 double-null MEFs to levels that approached those in wild-type MEFs (Figure 3A, lanes 3 and 4 versus lane 2). Figure 3.Reconstitution of cyclin D1–CDK4 complexes in vivo and restabilization of cyclin. (A) Wild-type MEFs or those lacking both p21 and p27 were infected for 48 h with control virus (CD8) or with viruses encoding p21 or p27. Cells were lysed and immunoprecipitated with antibodies to cyclin D1 or CDK4. Separated immune complexes were then blotted with the cognate or reciprocal antibodies, and sites of antibody binding were detected by enhanced chemiluminescence. (B) MEFs lacking both p21 and p27 were infected with a control retrovirus encoding CD8 or with a virus encoding p27. Two days post-infection, cells were pulse-labeled for 30 min with [35S]methionine and then ‘chased’ in the presence of 100-fold excess of unlabeled methionine for the indicated times. Lysates normalized for protein concentration were precipitated with a monoclonal antibody to cyclin D1, and the labeled proteins were resolved on a denaturing gel, which was dried and subjected to autoradiography. Download figure Download PowerPoint Cyclin D1 is a labile protein (Matsushime et al., 1992), and its rapid proteolytic degradation is triggered by phosphorylation on Thr286 (Diehl et al., 1997). By interacting with both cyclin D1 and CDK4, p21 and p27 might slow cyclin D1 turnover, possibly by promoting nuclear localization of the complexes (see below) and/or by interfering with cyclin D1 phosphorylation. Double-null MEFs were infected for 48 h with a retrovirus encoding p27, and cells were metabolically labeled with [35S]methionine for 30 min. Medium containing labeled methionine was removed, and cells were incubated in complete medium containing a 100-fold excess of unlabeled methionine. Cell lysates prepared after different periods of ‘chase’ were precipitated with the monoclonal antibody to cyclin D1, and the labeled proteins were resolved on a denaturing gel (Figure 3B). The half-life of cyclin D1 in p21/p27 double-null MEFs in several such experiments was calculated to be 15 min (Figure 3B, lanes 2–5), which is shorter than that in wild-type cells (t1/2 = 25 min) (Matsushime et al., 1992; Diehl et al., 1997, 1998). In contrast, in cells infected with p27-virus, the half-life of D1 exceeded 40 min (Figure 3B, lanes 6–9). Metabolic labeling experiments indicated that the relatively low level of cyclin D1 in p21/p27 double-null MEFs also reflects a 3-fold reduced rate of D1 synthesis versus that in wild-type MEFs (data not shown). Cyclin D1 synthesis was only modestly increased following acute infection of the cells with the p27 retrovirus (Figure 3B, compare lane 6 with lane 2), so the restoration of D1 levels following reintroduction of p21 or p27 (Figure 3) primarily reflects increased D1 stability. Association of CDK4 with Cdc37 and INK4 proteins in p21/p27 double-null cells Although CDK4 in mouse fibroblasts has a half-life of ∼4 h (Matsushime et al., 1992), unassembled CDK4 subunits are unstable, and the levels of monomeric CDK4 are very low (Dai et al., 1996; Stepanova et al., 1996). Similarly, the vast majority of CDK6 subunits are bound to other molecules (Mahony et al., 1998). CDK4 requires association with Hsp90/Cdc37 for stabilization, suggesting that the latter acts as a chaperone for the proper folding of kinase subunits (Dai et al., 1996; Stepanova et al., 1996). High molecular weight complexes containing Hsp90, Cdc37 and CDK4 or CDK6 are cytoplasmic and do not contain D-type cyclins, so assembly of cyclin D with CDK4, the nuclear translocation of these complexes, and their activation by CAK presumably occur as later steps. We considered the possibility that in p21/p27 double-null cells, the lack of complexes between CDK4 and cyclins D1 and D2 might result in a greater association of CDK4 subunits with Cdc37. Instead, the level of Cdc37-bound CDK4 was lower in double-null cells than in wild-type cells (Figure 4D), suggesting that most CDK4 was complexed with other molecules or remained monomeric. Figure 4.Association of CDK4 with INK4 proteins and Cdc37. Cell lysates from wild-type (A) or p21/p27 double-null cells (B) were sequentially depleted by two rounds of precipitation with non-immune rabbit serum (NRS) or with antibodies to the designated INK4 proteins (lanes 1 and 2) and then precipitated with anti-CDK4 (lanes 3). All recovered proteins were immunoblotted with anti-CDK4. (C) Experiments were performed as above, except that immunodepletion was carried out with a mixture of antibodies to all four INK4 family members prior to blotting of precipitated proteins with anti-CDK4 and anti-D1. (D) Cells of the indicated genotype were lysed and equal quantities of protein (100 μg) were resolved on denaturing gels and immunoblotted directly with anti-CDK4 (lanes 1 and 2) or rabbit anti-Cdc37 (lanes 5 and 6; produced by J.A.D. and C.J.S. to recombinant mouse protein synthesized in bacteria, unpublished). The arrows indicate the position of authentic CDK4 (34 kDa, left) and Cdc37 (50 kDa, right). The faster-migrating band detected with commercial polyclonal antibodies to mouse CDK4 used in this experiment (Santa Cruz Biotechnology) is not observed using antisera raised in our laboratory (RY or RZ; Matsushime et al., 1994). To quantitate complex formation, 5-fold more lysate protein (500 μg/lane) precipitated with anti-Cdc37 was separated on denaturing gels and blotted with anti-CDK4 (lanes 3 and 4). Download figure Download PowerPoint Apart from interacting with D-type cyclins, CDK4 and CDK6 can independently associate with INK4 proteins (Serrano et al., 1993; Guan et al., 1994; Hannon and Beach, 1994; Chan et al., 1995; Hirai et al., 1995). CDK–INK4 complexes are stable, lack Cdc37, cannot assemble with cyclins, and therefore appear inaccessible for enzymatic activation (Parry et al., 1995; Stepanova et al., 1996). It is therefore presumed that CDK4 can achieve alternative fates after release from the chaperone complex, either assembling with D-type cyclins or being inactivated through INK4 binding. Possibly, p21 and p27 might facilitate assembly of CDK4 and D-type cyclins by blocking the ability of INK4 proteins to sequester CDK4 in an inactive pool. We therefore studied the expression of the four different INK4 family members (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c and p19INK4d) and compared their associations with CDK4 in wild-type and p21/p27 double-null MEFs. Individual INK4 proteins were depleted from cell lysates by two sequential immunoprecipitations, and the levels of CDK4 associated with each INK4 family member were determined by blotting the precipitated proteins with antibodies to CDK4 (Figure 4A, lanes 1 and 2). Lysates depleted of individual INK4 proteins were then precipitated and blotted with antibodies to CDK4, in order to estimate the levels of residual CDK4 that remained unassociated with INK4 proteins (Figure 4A, lanes 3). Wild-type MEFs expressed significant amounts of CDK4 in complexes with p16INK4a, p15INK4b and p18INK4c (Figure 4A). In cells lacking both p21 and p27, CDK4 associated with the same three INK4 family members, although in comparison with wild-type MEFs, less CDK4 was bound to p18INK4c and more was bound to p15INK4b (Figure 4B). In both MEF strains, more CDK4 was complexed with p16INK4a than with other INK4 family members, and no association with p19INK4d was detected. To determine the relative pools of total INK4-bound and -unbound CDK4, MEF lysates were depleted with mixtures of antibodies directed to all four INK4 family members, and the above analysis was repeated (Figure 4C). From several such experiments, we estimated that in wild-type cells, ∼40% of the total CDK4 pool stably associated with INK4 proteins. As expected, cyclin D1 co-precipitated only with those CDK4 molecules that were not bound to INK4 proteins (+/+ cells, lanes 3). Importantly, all enzymatically active CDK4 is bound to D-type cyclins, and this fraction also contained associated p21 and p27 molecules (Figure 2). In p21/p27 double-null cells, the INK4-bound CDK4 fraction was increased to ∼50–60%; D1–CDK4 complexes were again not detected even though a substantial pool of non-INK4-bound CDK4 remained (−/− cells, lanes 3). Therefore, in wild-type MEFs, ∼40% of CDK4 is associated with cyclin D1 and 10–15% is associated with D2 (Figure 1), ∼40% is associated with INK4 proteins (Figure 4C), and much of the remainder is bound to Cdc37 (Figure 4D; see figure legend for amounts of protein loading per lane). In p21/p27 double-null cells, little CDK4 binding to D cyclins was detected (Figure 1), ∼60% was bound to INK4 proteins (Figure 4C) and <10% was complexed to Cdc37. Therefore, a substantial fraction of CDK4 must either remain monomeric or is associated with as yet unidentified molecules. This indicates that p21 and p27 do not simply compete with INK4 proteins in directing cyclin D–CDK assembly. p21 or p27 can facilitate nuclear accumulation of cyclin D1 Cyclin D1 normally accumulates in the nuclei of cells during G1 phase but relocalizes to the cytoplasm during S phase (Baldin et al., 1993). Although cyclin D1 has no obvious nuclear import signal, p21 family members can direct the nuclear localization of cyclin D1–CDK4 complexes (Diehl and Sherr, 1997; LaBaer et al., 1997), raising the possibility that cyclin D1 might not be able to enter the nucleus in MEFs lacking both p21 and p27. When asynchronously proliferating wild-type MEFs were stained with antibody to cyclin D1, 61% of the cells exhibited strong nuclear fluorescence (Table I). Fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis of DNA content indicated that 52% of the total asynchronously proliferating population were in G1 phase, and in agreement with others' results (Baldin et al., 1993), double-labeling with BrdU for 2 h prior to staining indicated that ∼90% of cells exhibiting bright nuclear cyclin D1 fluorescence were not in S phase (data not shown). Although a smaller fraction of cells lacking p21, p27 or both exhibited exclusively nuclear staining, the lower levels of cyclin D1 expressed were still able to enter the nucleus (Table I). In agreement with immunoblotting results (Figure 1), the intensity of cyclin D1 staining in p21/p27 double-null MEFs was much lower than that of wild-type MEFs (as judged by the need for a 6-fold increase in exposure time to obtain an almost comparable signal). Hence, the CDK inhibitors are not strictly required for cyclin D1 nuclear import. Moreover, the fact that a significant fraction of cyclin D1 was detected in the nucleus of double-null cells (Table I) whereas >95% failed to assemble with CDK4 (Figure 1) suggests that stable association with catalytic subunits is also not essential for D1 nuclear import. Table 1. Subcellular localization of cyclin D1 in cells lacking CKIs Genotype % Nuclear % Nuclear and cytoplasmic % Cytoplasmic p21 p27 + + 61 ± 4 21 ± 3 18 ± 3 − + 49 ± 4 23 ± 3 28 ± 4 + − 46 ± 4 26 ± 4 28 ± 4 − − 38 ± 3 28 ± 3 34 ± 4 Flag-tagged D1 retrovirus + + 59 ± 5 23 ± 2 18 ± 2 − − 7 ± 3 64 ± 5 29 ± 4 Flag-tagged D1 (T286A) retrovirus + + 82 ± 5 14 ± 2 4 ± 1 − − 77 ± 7 17 ± 5 6 ± 2 Proliferating wild-type MEFs and those lacking p21, p27 or both were stained with monoclonal antibody to cyclin D1 and scored by immunofluorescence for the presence of nuclear and/or cytoplasmic D1. Cells infected with retroviruses encoding Flag-tagged D1 or the D1 (T286A) mutant that is stable and remains in the nucleus throughout interphase were studied similarly. Because ectopic expression of D1 greatly exceeded that of the endogenous protein, no background sig

Murine D type cyclins associate with a catalytic subunit (p34PSK-J3) with properties distinct from known cyclin-dependent kinases (cdks). Mouse p34PSK-J3 shows less than 50% amino acid identity to p34cdc2, p33cdk2, and p36cdk3, lacks a PSTAIRE motif, and does not bind to p13suc1. Cyclin D1-p34PSK-J3 complexes accumulate in macrophages during G1 and decline in S phase, whereas complexes involving cyclins D2 and D3 form in proliferating T cells. Although histone H1 kinase activity is not detected in cyclin D or PSK-J3 immunoprecipitates, cyclin D-p34PSK-J3 complexes assembled in vitro stably bind and phosphorylate the retinoblastoma gene product (pRb) and an Rb-like protein (p107) but do not interact with pRb mutants that are functionally inactive. Thus, p34PSK-J3 is a cyclin D-regulated catalytic subunit that acts as an Rb (but not H1) kinase.

The INK4a-ARF locus encodes two proteins, p16 INK4a and p19 ARF , that restrain cell growth by affecting the functions of the retinoblastoma protein and p53, respectively. Disruption of this locus by deletions or point mutations is a common event in human cancer, perhaps second only to the loss of p53. Using insect cells infected with baculovirus vectors and NIH 3T3 fibroblasts infected with ARF retrovirus, we determined that mouse p19 ARF can interact directly with p53, as well as with the p53 regulator mdm2. ARF can bind p53-DNA complexes, and it depends upon functional p53 to transcriptionally induce mdm2 and the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 Cip1 , and to arrest cell proliferation. Binding of p19 ARF to p53 requires the ARF N-terminal domain (amino acids 1–62) that is necessary and sufficient to induce cell cycle arrest. Overexpression of p19 ARF in wild type or ARF -null mouse embryo fibroblasts increases the half-life of p53 from 15 to ≈75 min, correlating with an increased p53-dependent transcriptional response and growth arrest. Surprisingly, when overexpressed at supra-physiologic levels after introduction into ARF -null NIH 3T3 cells or mouse embryo fibroblasts, the p53 protein is handicapped in inducing this checkpoint response. In this setting, reintroduction of p19 ARF restores p53’s ability to induce p21 Cip1 and mdm2, implying that, in addition to stabilizing p53, ARF modulates p53-dependent function through an additional mechanism.

Transgenic mice expressing the c-Myc oncogene driven by the immunoglobulin heavy chain enhancer (Emu) develop B-cell lymphoma and exhibit a mean survival time of approximately 6 months. The protracted latent period before the onset of frank disease likely reflects the ability of c-Myc to induce a p53-dependent apoptotic program that initially protects animals against tumor formation but is disabled when overtly malignant cells emerge. In cultured primary mouse embryo fibroblasts, c-Myc activates the p19(ARF)-Mdm2-p53 tumor suppressor pathway, enhancing p53-dependent apoptosis but ultimately selecting for surviving immortalized cells that have sustained either p53 mutation or biallelic ARF deletion. Here we report that p53 and ARF also potentiate Myc-induced apoptosis in primary pre-B-cell cultures, and that spontaneous inactivation of the ARF-Mdm2-p53 pathway occurs frequently in tumors arising in Emu-myc transgenic mice. Many Emu-myc lymphomas sustained either p53 (28%) or ARF (24%) loss of function, whereas Mdm2 levels were elevated in others. Its overexpression in some tumors lacking p53 function raises the possibility that Mdm2 can contribute to lymphomagenesis by interacting with other targets. Emu-myc transgenic mice hemizygous for ARF displayed accelerated disease (11-week mean survival), and 80% of these tumors lost the wild-type ARF allele. All ARF-null Emu-myc mice died of lymphoma within a few weeks of birth. About half of the tumors arising in ARF hemizygous or ARF nullizygous Emu-myc transgenic mice also overexpressed Mdm2. Therefore, Myc activation strongly selects for spontaneous inactivation of the ARF-Mdm2-p53 pathway in vivo, cancelling its protective checkpoint function and accelerating progression to malignancy.