Abstract

 We report that human secretory breast carcinoma (SBC), a rare subtype of infiltrating ductal carcinoma, expresses the ETV6-NTRK3 gene fusion previously cloned in pediatric mesenchymal cancers. This gene fusion encodes a chimeric tyrosine kinase with potent transforming activity in fibroblasts. ETV6-NTRK3 expression was confirmed in 12 (92%) of 13 SBC cases, but not in other ductal carcinomas. Retroviral transfer of ETV6-NTRK3 (EN) into murine mammary epithelial cells resulted in transformed cells that readily formed tumors in nude mice. Phenotypically, tumors produced glands and expressed epithelial antigens, confirming that EN transformation is compatible with epithelial differentiation. This represents a recurrent chromosomal rearrangement and expression of a dominantly acting oncogene as a primary event in human breast carcinoma.

Abstract Carbonic anhydrase IX (CAIX) is a hypoxia and HIF-1–inducible protein that regulates intra- and extracellular pH under hypoxic conditions and promotes tumor cell survival and invasion in hypoxic microenvironments. Interrogation of 3,630 human breast cancers provided definitive evidence of CAIX as an independent poor prognostic biomarker for distant metastases and survival. shRNA-mediated depletion of CAIX expression in 4T1 mouse metastatic breast cancer cells capable of inducing CAIX in hypoxia resulted in regression of orthotopic mammary tumors and inhibition of spontaneous lung metastasis formation. Stable depletion of CAIX in MDA-MB-231 human breast cancer xenografts also resulted in attenuation of primary tumor growth. CAIX depletion in the 4T1 cells led to caspase-independent cell death and reversal of extracellular acidosis under hypoxic conditions in vitro. Treatment of mice harboring CAIX-positive 4T1 mammary tumors with novel CAIX-specific small molecule inhibitors that mimicked the effects of CAIX depletion in vitro resulted in significant inhibition of tumor growth and metastasis formation in both spontaneous and experimental models of metastasis, without inhibitory effects on CAIX-negative tumors. Similar inhibitory effects on primary tumor growth were observed in mice harboring orthotopic tumors comprised of lung metatstatic MDA-MB-231 LM2-4Luc+ cells. Our findings show that CAIX is vital for growth and metastasis of hypoxic breast tumors and is a specific, targetable biomarker for breast cancer metastasis. Cancer Res; 71(9); 3364–76. ©2011 AACR.

Extracellular matrix (ECM) profoundly influences the growth and differentiation of the mammary gland epithelium, both in culture and in vivo. Utilizing a clonal population of mouse mammary epithelial cells that absolutely requires an exogenous ECM for function, we developed a rapid assay to study signal transduction by ECM. Two components of the cellular response to a basement membrane overlay that result in the expression of the milk protein beta-casein were defined. The first component of this response involves a rounding and clustering of the cells that can be physically mimicked by plating the cells on a nonadhesive substratum. The second component is biochemical in nature, and it is associated with beta 1 integrin clustering and increased tyrosine phosphorylation. The second component is initiated in a morphology-independent manner, but the proper translation of this biochemical signal into a functional response requires cell rounding and cell clustering. Thus, physical and biochemical signal transduction events contribute to the ECM-dependent regulation of tissue-specific gene expression in mouse mammary epithelial cells.

The integrin-linked kinase (ILK) is an ankyrin repeat containing serine-threonine protein kinase that can interact directly with the cytoplasmic domains of the β1 and β3 integrin subunits and whose kinase activity is modulated by cell–extracellular matrix interactions. Overexpression of constitutively active ILK results in loss of cell–cell adhesion, anchorage-independent growth, and tumorigenicity in nude mice. We now show that modest overexpression of ILK in intestinal epithelial cells as well as in mammary epithelial cells results in an invasive phenotype concomitant with a down-regulation of E-cadherin expression, translocation of β-catenin to the nucleus, formation of a complex between β-catenin and the high mobility group transcription factor, LEF-1, and transcriptional activation by this LEF-1/β-catenin complex. We also find that LEF-1 protein expression is rapidly modulated by cell detachment from the extracellular matrix, and that LEF-1 protein levels are constitutively up-regulated at ILK overexpression. These effects are specific for ILK, because transformation by activated H- ras or v- src oncogenes do not result in the activation of LEF-1/β-catenin. The results demonstrate that the oncogenic properties of ILK involve activation of the LEF-1/β-catenin signaling pathway, and also suggest ILK-mediated cross-talk between cell–matrix interactions and cell–cell adhesion as well as components of the Wnt signaling pathway.

We develop a methodology to segment cells from microscopy images and compute quantitative descriptors that characterize their morphology. Using unsupervised techniques for dimensionality reduction and density-based clustering, we perform label-free cell shape classification. Cells are identified with minimal user input using mathematical morphology and region-growing segmentation methods. Physical quantities describing cell shape and size (including area, perimeter, Feret diameters, etc.) are computed along with other features including shape factors and Hu's image moments. Correlated features are combined to obtain a low-dimensional (2-D or 3-D) embedding of data points corresponding to individual segmented cell shapes. Finally, a hierarchical density-based clustering algorithm (HDBSCAN) is used to classify cells. We compare cell classification results obtained from different combinations of features to identify a feature set that delivers optimum classification performance for our test data consisting of phase-contrast microscopy images of a pancreatic-cancer cell line, MIA PaCa-2.

Abstract The Poly(A) Tail Length (PATL) of mRNAs of certain cell-cycle regulatory genes undergo significant trimming during M-phase, however the functional importance is unknown. The Ccr4-Not and PAN complexes account for the majority of cytoplasmic poly(A) deadenylation, however a role in M phase has not been described. We find that under conditions of microtubule stress in yeast, loss of PAN deadenylase activity leads to arrest in M phase, defective spindles, and increased cell death. PAN consists of the catalytic subunit Pan2 and the RNA binding subunit Pan3. Consistent with a role in mitosis, PAN2 interacts genetically with tubulin genes, prefoldin complex genes and the mitotic cyclin CLB1 . PAN2 knockdown in human cultured cells disrupts mitosis and results in spindle fragmentation leading to abnormal cell division, while expression of human PAN2 in yeast rescues pan2 Δ cell-cycle phenotypes. Hence, we reveal an important highly conserved role for PAN in ensuring proper mitosis when cells are under microtubule stress. We propose PAN regulates PATLs of mRNAs of key cell-cycle/mitotic proteins in response to defective spindles. Author Summary Proper cell division is essential for the growth and survival of all living organisms. Our study investigates the role of PAN deadenylase complex in yeast and human cultured cells under microtubule stress, induced by microtubule inhibitors used in cancer treatment. The PAN complex, consisting of Pan2 and Pan3, trims the poly(A) tails of mRNAs. We found that loss of PAN activity leads to cell cycle arrest in M-phase, spindle defects and increased cell death in yeast. Similarly, PAN2 knockdown in human cultured cells disrupts mitosis and causes abnormal cell division, indicating a conserved function across species. We propose that PAN regulates mRNA poly(A) tail lengths of key mitotic proteins to ensure proper mitosis under stress. This regulation likely prevents faulty spindle formation by repressing translation of these mRNAs. Interestingly, PAN’s role is specific to stress conditions, as cells without PAN function normally otherwise. Our findings highlight PAN’s critical role in maintaining genomic stability and proper cell division during microtubule stress, providing insights into the post-transcriptional regulation of cell cycle and potential targets for cancer therapy.

ABSTRACT Genetic testing is widely used in evaluating a patient’s predisposition for developing a malignancy. In the case of cancer, when a functionally impactful inherited mutation (i.e. genetic variant) is identified in a disease-relevant gene, the patient is at elevated risk of developing a lesion in their lifetime. Unfortunately, as the rate and coverage of genetic testing has accelerated, our ability to make informed assessments regarding the functional status of the variants has lagged. Currently, there are two main strategies for assessing variant functions: in silico predictions or in vitro testing. The first approach is to build generalist computational prediction software using theoretical parameters such as amino acid conservation as feature inputs. These types of software can classify any variant of any gene. Although versatile, their non-specific design and theoretical assumptions result in different models frequently producing conflicting classifications. The second approach is to develop gene-specific assays. Although each assay is tailored to the physiological function of the gene, this approach requires significant investments. Therefore, there is an urgent need for more practical, streamlined and cost-effective methods. To directly address these issues, we designed a new approach of using alterations in protein subcellular localization as a key indicator of loss of function. Thus, new variants can be rapidly functionalized by using high-content microscopy. To facilitate the analysis of large amounts of image data, we developed a new software, named MAPS for machine-assisted phenotype scoring, that utilizes deep learning (DL) techniques to extract and classify cell-level phenotypes. This new Python-based toolkit helps users leverage commercial cloud-based DL services that are easy to train and deploy to fit varying experimental conditions. Model training is entirely code-free and can be done with limited number of images. Users simply input the trained endpoints into MAPS to accomplish cell detection, phenotype discovery and phenotype classification. Thus, MAPS allows cell biologists to easily apply DL to accelerate their image analysis workflow.

Alveolar macrophages (AMs) are CD44 expressing cells that reside in the alveolar space where they maintain lung homeostasis by serving critical roles in immunosurveillance and lipid surfactant catabolism. AMs lacking CD44 are unable to bind the glycosaminoglycan, hyaluronan, which compromises their survival and leads to reduced numbers of AMs in the lung. Using RNA sequencing, lipidomics and multiparameter flow cytometry, we demonstrate that CD44-/- mice have impaired AM lipid homeostasis and increased surfactant lipids in the lung. CD44-/- AMs had increased expression of CD36, a lipid scavenger receptor, as well as increased intracellular lipid droplets, giving them a foamy appearance. RNA sequencing revealed the differential expression of genes associated with lipid efflux and metabolism in CD44-/- AMs. Lipidomic analysis showed increased lipids in both the supernatant and cell pellet extracted from the bronchoalveolar lavage of CD44-/- mice. Phosphatidylcholine species, cholesterol, oxidized phospholipids and levels of reactive oxygen species (ROS) were increased in CD44-/- AMs. Oxidized phospholipids were more cytotoxic to CD44-/- AMs and induced greater lung inflammation in CD44-/- mice. Reconstitution of CD44+/+ mice with CD44-/- bone marrow as well as adoptive transfer of CD44-/- AMs into CD44+/+ mice showed that lipid accumulation in CD44-/- AMs occurred irrespective of the lung environment, suggesting a cell intrinsic defect. Administration of colony stimulating factor 2 (CSF-2), a critical factor in AM development and maintenance, increased AM numbers in CD44-/- mice and decreased phosphatidylcholine levels in the bronchoalveolar lavage, but was unable to decrease intracellular lipid accumulation in CD44-/- AMs. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), downstream of CSF-2 signaling and a regulator of lipid metabolism, was reduced in the nucleus of CD44-/- AMs, and PPARγ inhibition in normal AMs increased their lipid droplets. Thus, CD44 deficiency causes defects in AMs that lead to abnormal lipid accumulation and oxidation, which exacerbates oxidized lipid-induced lung inflammation. Collectively, these findings implicate CD44 as a regulator of lung homeostasis and inflammation.