Global energy balance in mammals is controlled by the actions of circulating hormones that coordinate fuel production and utilization in metabolically active tissues. Bone-derived osteocalcin, in its undercarboxylated, hormonal form, regulates fat deposition and is a potent insulin secretagogue. Here, we show that insulin receptor (IR) signaling in osteoblasts controls osteoblast development and osteocalcin expression by suppressing the Runx2 inhibitor Twist2. Mice lacking IR in osteoblasts have low circulating undercarboxylated osteocalcin and reduced bone acquisition due to decreased bone formation and deficient numbers of osteoblasts. With age, these mice develop marked peripheral adiposity and hyperglycemia accompanied by severe glucose intolerance and insulin resistance. The metabolic abnormalities in these mice are improved by infusion of undercarboxylated osteocalcin. These results indicate the existence of a bone-pancreas endocrine loop through which insulin signaling in the osteoblast ensures osteoblast differentiation and stimulates osteocalcin production, which in turn regulates insulin sensitivity and pancreatic insulin secretion.

To examine the local actions of IGF signaling in skeletal tissue in a physiological context, we have used Cre-mediated recombination to disrupt selectively in mouse osteoblasts the gene encoding the type 1 IGF receptor (Igf1r). Mice carrying this bone-specific mutation were of normal size and weight but, in comparison with normal siblings, demonstrated a striking decrease in cancellous bone volume, connectivity, and trabecular number, and an increase in trabecular spacing. These abnormalities correlated with a striking decrease in the rate of mineralization of osteoid that occurred despite an unexpected osteoblast and osteoclast hyperactivity, detected from the significant increments in both osteoblast and erosion surfaces. Our findings indicate that IGF1 is essential for coupling matrix biosynthesis to sustained mineralization. This action is likely to be particularly important during the pubertal growth spurt when rapid bone formation and consolidation are required. To examine the local actions of IGF signaling in skeletal tissue in a physiological context, we have used Cre-mediated recombination to disrupt selectively in mouse osteoblasts the gene encoding the type 1 IGF receptor (Igf1r). Mice carrying this bone-specific mutation were of normal size and weight but, in comparison with normal siblings, demonstrated a striking decrease in cancellous bone volume, connectivity, and trabecular number, and an increase in trabecular spacing. These abnormalities correlated with a striking decrease in the rate of mineralization of osteoid that occurred despite an unexpected osteoblast and osteoclast hyperactivity, detected from the significant increments in both osteoblast and erosion surfaces. Our findings indicate that IGF1 is essential for coupling matrix biosynthesis to sustained mineralization. This action is likely to be particularly important during the pubertal growth spurt when rapid bone formation and consolidation are required. Body size and linear bone growth in mammals is affected by cellular signaling pathways controlled by growth factors and hormones (1Efstratiadis A. Int. J. Dev. Biol. 1998; 42: 955-976PubMed Google Scholar). In this regard, a major growth-promoting signaling system consisting of the insulin-like growth factors (IGF, 1The abbreviations used are: IGF, insulin-like growth factor; PBS, phosphate-buffered saline; X-gal, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside; AP, alkaline phosphatase IGF1 and IGF2) and the type 1 IGF receptor (IGF1R) regulates embryonic growth, as shown by gene knockout experiments in mice (1Efstratiadis A. Int. J. Dev. Biol. 1998; 42: 955-976PubMed Google Scholar). IGF1 acting through IGF1R also plays central roles in postnatal growth either independently or by mediating growth hormone functions (2Lupu F. Terwilliger J.D. Lee K. Segre G.V. Efstratiadis A. Dev. Biol. 2001; 229: 141-162Crossref PubMed Scopus (643) Google Scholar). Signaling through the IGF1R tyrosine kinase receptor not only promotes cell proliferation, but also mediates anti-apoptotic actions (3Baserga R. Resnicoff M. D'Ambrosio C. Valentinis B. Vitam. Horm. 1997; 53: 65-98Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 4Nakae J. Kido Y. Accili D. Endocr. Rev. 2001; 22: 818-835Crossref PubMed Scopus (357) Google Scholar). The IGF system includes a second receptor (IGF2R) devoid of signaling properties, but serving IGF2 turnover, and at least six IGF-binding proteins (IGFBPs) of obscure functional significance (single and also some double mouse mutations ablating IGFBPs have not revealed as yet significant consequences in growth impairment). 2J. Pintar, personal communication. The IGFs are produced locally in various tissues, including bones, and exert autocrine/paracrine functions, but they are also present in serum, mostly associated with IGFBPs. Whether the circulating IGFs act systemically as hormones is currently controversial (5Yakar S. Liu J.L. Stannard B. Butler A. Accili D. Sauer B. LeRoith D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 7324-7329Crossref PubMed Scopus (1191) Google Scholar, 6D'Ercole A.J. Calikoglu A.S. Growth Horm. IGF Res. 2001; 11: 261-265Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). A number of in vitro and in vivo studies are progressively unraveling the significance of the IGF system for skeletal development and metabolic control (for a review see Ref. 7Conover C.A. Growth Horm. IGF Res. 2000; 10 Suppl. B: S107-S110Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar). IGF1, by stimulating the proliferation of chondrocytes in the growth plate, plays an essential role in longitudinal bone growth (2Lupu F. Terwilliger J.D. Lee K. Segre G.V. Efstratiadis A. Dev. Biol. 2001; 229: 141-162Crossref PubMed Scopus (643) Google Scholar) and is also involved in the formation of trabecular bone. In fact, chondrocytes and bone cells produce IGFs and express IGF1R (see for example Refs. 8Shinar D.M. Endo N. Halperin D. Rodan G.A. Weinreb M. Endocrinology. 1993; 132: 1158-1167Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar and 9Wang E. Wang J. Chin E. Zhou J. Bondy C.A. Endocrinology. 1995; 136: 2741-2751Crossref PubMed Google Scholar). Studies using osteoblast culture systems have shown that IGF1 stimulates osteoblast proliferation, accelerates their differentiation, and enhances bone matrix production (10Canalis E. Bone. 1993; 14: 273-276Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar, 11Birnbaum R.S. Bowsher R.R. Wiren K.M. J. Endocrinol. 1995; 144: 251-259Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). In addition, IGF1 is being recognized as a critical factor for bone cell survival (12Parfitt A.M. Mundy G.R. Roodman G.D. Hughes D.E. Boyce B.F. J. Bone Miner. Res. 1996; 11: 150-159Crossref PubMed Scopus (292) Google Scholar, 13Hughes D.E. Boyce B.F. Mol. Pathol. 1997; 50: 132-137Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar, 14Hill P.A. Tumber A. Meikle M.C. Endocrinology. 1997; 138: 3849-3858Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Finally, IGF1 also appears to regulate bone resorption, either directly or through its action on osteoblasts that stimulate in turn the formation and function of osteoclasts (15Hill P.A. Reynolds J.J. Meikle M.C. Endocrinology. 1995; 136: 124-131Crossref PubMed Google Scholar). Because of complex relationships in the signaling processes of the IGF regulatory system (1Efstratiadis A. Int. J. Dev. Biol. 1998; 42: 955-976PubMed Google Scholar) on one hand, and intricacies in bone development (16Olsen B.R. Reginato A.M. Wang W. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000; 16: 191-220Crossref PubMed Scopus (780) Google Scholar, 17Karsenty G. Wagner E.F. Dev. Cell. 2002; 2: 389-406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1204) Google Scholar) on the other, it has been quite difficult to define individualin vivo aspects of the skeletal actions of IGF1, especially those brought about by local (autocrine/paracrine) mechanisms. Nevertheless, progress is being made with the use of genetically modified mice. For example, mice with targeted overexpression of IGF1 in osteoblasts exhibited an increased bone formation rate and increased trabecular and cortical bone volume (18Zhao G. Monier-Faugere M.C. Langub M.C. Geng Z. Nakayama T. Pike J.W. Chernausek S.D. Rosen C.J. Donahue L.R. Malluche H.H. Fagin J.A. Clemens T.L. Endocrinology. 2000; 141: 2674-2682Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar). Remarkably, these changes occurred without an increase in the total number of osteoblasts, suggesting that locally produced IGF1 could exert its anabolic effects primarily by increasing the performance of resident osteoblasts. Nevertheless, firm establishment of causal relationships necessitates complete ablation of IGF signaling by elimination of IGF1R function. In this regard, however, the invariable neonatal lethality ofIgf1r nullizygous mice (19Liu J.P. Baker J. Perkins A.S. Robertson E.J. Efstratiadis A. Cell. 1993; 75: 59-72Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2597) Google Scholar) precluded an examination of the skeletal role of IGF1 during postnatal growth and development. To circumvent this problem, we have now disrupted selectively theIgf1r gene in mouse osteoblasts using thecre/loxP recombination system, and evaluated the bone phenotype. As we report here, this site-specific ablation of IGF signaling impairs the rate of bone formation and severely retards mineralization of osteoid resulting in decreased cancellous bone volume and altered trabecular structure. A DNA fragment representing the human osteocalcin (OC) promoter (20Clemens T.L. Tang H. Maeda S. Kesterson R.A. DeMayo F. Pike J.W. Gundberg C.M. J. Bone Miner. Res. 1997; 12: 1570-1576Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar) was cloned into the pBluescript SK(−) vector to create pOC. A plasmid containing a cDNA encoding cre, which was modified to include a nuclear localization sequence and the human β-actin 3′-untranslated region (provided by Dr. Thomas Doetschman, University of Cincinnati), was cloned into the pKBpA plasmid (18Zhao G. Monier-Faugere M.C. Langub M.C. Geng Z. Nakayama T. Pike J.W. Chernausek S.D. Rosen C.J. Donahue L.R. Malluche H.H. Fagin J.A. Clemens T.L. Endocrinology. 2000; 141: 2674-2682Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar) downstream from a sequence representing the rabbit β-globin second intron flanked by remnants of truncated exons. The derived fused (globin-cre) sequences were then subcloned into pOC downstream from the osteocalcin promoter, to create pOC-cre (Fig. 1 A). The insert of this plasmid (OC-cre) was excised and microinjected into fertilized eggs (FVB-N mouse strain). Transgenic lines were established from 11 founders that were identified by Southern analysis of genomic DNA. Two of the transgenic lines (4 and 6) were analyzed in detail and used in our experiments (see “Results”). Differences in the level and specificity of transgenic expression between the two lines were not detected. Expression of cre mRNA was determined by Northern analysis of total RNA (10 μg per lane) using acre cDNA probe. All animals received humane care in compliance with the local Institutional Animal Care and Use Committee. OC-cre mice were mated with homozygous conditional mutants carrying modified Igf1ralleles (with loxP sites flanking exon 3; (21Dietrich P. Dragatsis I. Xuan S. Zeitlin S. Efstratiadis A. Mamm. Genome. 2000; 11: 196-205Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar), to generate OC-cre/Igf1rflox/+ progeny, which were used in subsequent crosses (see “Results”). The OC-cre mice were also crossed with Z/AP reporter mice (22Lobe C.G. Koop K.E. Kreppner W. Lomeli H. Gertsenstein M. Nagy A. Dev. Biol. 1999; 208: 281-292Crossref PubMed Scopus (452) Google Scholar), to estimate the efficiency of Cre-mediated recombination (see “Results”). For routine genotyping of progeny, thecre transgene was detected by PCR (1 min at 94 °C, 1 min at 53 °C, and 1 min at 72 °C, for 30 cycles) using the primers: 5′-CAAATAGCCCTGGCAGATTC-3′ (forward) and 5′-TGATACAAGGGACATCTTCC-3′ (reverse) to generate a 260-bp product corresponding to a portion of the OC promoter and the rabbit β-globin intron. The Igf1rlocus was detected by PCR (1 min at 94 °C, 1 min at 61 °C, and 1 min at 72 °C, for 30 cycles) with the primers 2 and 3 (see Fig. 1): 5′-CTTCCCAGCTTGCTACTCTAGG-3′ (forward) and 5′-CAGGCTTGCAATGAGACATGGG-3′ (reverse), which generate a 120-bp product from the wild-type allele or a 220-bp product from the floxed allele. To detect the recombined allele, another primer (primer 1; Fig. 1) 5′-TGAGACGTAGCGAGATTGCTGTA-3′ was used in combination with primer 3, to generate a 320-bp product. Whole-mount lacZ staining was used to genotype the Z/AP reporter mice, as described below. To determine the specificity and efficiency of Cre-mediated recombination, OC-cre mice from two Cre-expressing lines (3 and 6) were crossed with the Z/AP mice (17Karsenty G. Wagner E.F. Dev. Cell. 2002; 2: 389-406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1204) Google Scholar) carrying a “double reporter” transgene (see Fig. 2 A and “Results”). When recombination occurs, the LacZ site is excised, and the downstream human Hplap gene is expressed. Mice were sacrificed and organs were harvested, rinsed in PBS, and fixed with 2% paraformaldehyde plus 0.2% glutaraldehyde in PBS on ice for 2 h. For whole-mount staining, each calvarium was cut in half longitudinally, one half was used for lacZ staining and the other for AP as described (22Lobe C.G. Koop K.E. Kreppner W. Lomeli H. Gertsenstein M. Nagy A. Dev. Biol. 1999; 208: 281-292Crossref PubMed Scopus (452) Google Scholar). For lacZ staining, the fixed samples were washed three times for 5 min in lacZ wash buffer (2 mmMgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% Nonidet-P40, 5 mm EGTA in PBS). Staining was carried out in lacZ staining buffer (1 mg/ml X-gal, 5 mm potassium ferrocyanide, and 5 mm potassium ferricyanide in lacZ wash buffer) at 37 °C for 4 h to overnight, with shaking and protection from light. After staining, samples were rinsed with PBS, post-fixed in 2% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde in 0.1 m sodium cacodylate buffer (pH 7.3) for 10 min, rinsed twice with PBS, and then twice with 70% ethanol prior to storage in 70% ethanol at 4 °C. For alkaline phosphatase (AP) staining, the fixed calvaria were washed three times with PBS for 5 min, and then incubated in PBS at 70–75 °C for 30 min to inactivate endogenous AP. Samples were rinsed in PBS, washed in AP buffer (100 mm Tris-HCl, pH 9.5, 50 mm MgSO4, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% Nonidet-P40) for 10 min, and stained with NBT/BCIP stain (0.4 mg/ml NBT (nitroblue tetrazolium chloride), 0.19 mg/ml BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate, toluidine-salt), in AP buffer) for at least 90 min or until staining was evident. After staining, samples were washed in PBS and 70% ethanol and stored in 70% ethanol. Stained calvaria halves were dehydrated, infiltrated and embedded in paraffin. Blocks were sectioned at 10 μm, placed onto slides, and coverslipped. Non-skeletal tissues were sectioned prior to staining. Samples were washed in PBS three times for 5 min after fixation and cryoprotected in 15% sucrose in PBS for 1 h at 4 °C and then in 30% sucrose in PBS overnight at 4 °C. They were then embedded in OCT, sectioned, and placed onto slides. Prior to staining, slides were refixed in cold PBS containing 0.2% glutaraldehyde for 10 min. For lacZ staining, slides were washed three times for 5 min in lacZ wash buffer and then stained in lacZ staining buffer for 3–4 h at 37 °C, protected from light. After staining, slides were rinsed in PBS, postfixed (see above) before dehydration through a graded ethanol series and coverslipped. For AP staining, after fixation, slides were washed three times in PBS for 5 min and endogenous AP was inactivated by incubating slides in PBS at 75 °C for 30 min. Slides were then rinsed with PBS, washed in AP buffer for 10 min, and stained with NBT/BCIP stain for 5–15 min at room temperature. After staining, slides were washed in PBS, dehydrated through an ethanol series, and then coverslipped. The three-dimensional microarchitecture of the intact right femurs was evaluated using a high-resolution, desktop microtomographic imaging system (μCT20, Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland) (23Ruegsegger P. Koller B. Muller R. Calcif. Tissue Int. 1996; 58: 24-29Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar). Three regions were evaluated: the entire femur, cortical bone in the mid-diaphysis, and secondary spongiosa in the distal metaphysis. For evaluation of the entire femur and mid-diaphyseal cortical bone, the bone was scanned using a 34-μm slice increment, requiring ∼100–150 μCT slices per specimen. For evaluation of the secondary spongiosa in the distal metaphysis, the bone was scanned using a 9-μm slice increment, beginning approximately at the growth plate and extending proximally for 200 CT slices. A region of interest including only cancellous bone was constructed, beginning 0.25 mm proximal to the growth plate and extending proximally for 1.25 mm. Images were reconstructed, filtered, and thresholded as previously described (24Alexander J.M. Bab I. Fish S. Muller R. Uchiyama T. Gronowicz G. Nahounou M. Zhao Q. White D.W. Chorev M. Gazit D. Rosenblatt M. J. Bone Miner. Res. 2001; 16: 1665-1673Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). The images were stored in three-dimensional arrays with an isotropic voxel size of either 34 μm (for the whole bone) or 9 μm (for the distal femoral metaphysis). Morphometric parameters were computed using a direct three-dimensional approach that does not rely on any assumptions about whether the underlying structure is either plate or rod-like (25Pfeilschifter J. Laukhuf F. Muller-Beckmann B. Blum W.F. Pfister T. Ziegler R. J. Clin. Investig. 1995; 96: 767-774Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). For the whole bone, we computed the total bone volume (BV, mm3) and the apparent volume density (AVD, %), defined as the percent of mineralized tissue volume divided by the total volume defined by the external bone envelope (24Alexander J.M. Bab I. Fish S. Muller R. Uchiyama T. Gronowicz G. Nahounou M. Zhao Q. White D.W. Chorev M. Gazit D. Rosenblatt M. J. Bone Miner. Res. 2001; 16: 1665-1673Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar). For the cortical region, the bone volume (BV, mm3), bone volume density (BV/TV, %), and cortical thickness (μm) were computed in a 1-mm thick region at the mid-diaphysis. For the cancellous bone region in the distal metaphysis, bone volume density (BV/TV, %), trabecular thickness (Tb.Th, μm), trabecular separation (Tb.Sp, μm), trabecular number (Tb.N, mm−1), and connectivity density (mm−3) were assessed. Distal femora and calvaria were fixed in 100% ethanol. After dehydration, bone samples were embedded in methyl methacrylate (26Malluche H.H. Faugere M.C. Atlas of Mineralized Bone Histology. Karger, New York1986Google Scholar), and 4-μm sections were cut with a heavy-duty microtome (Microm, C. Zeiss, Thornwood, NY). This thickness allows analysis of the same histologic features in slides prepared for light and fluorescent microscopy. Four bone sections were stained using the modified Masson-Goldner trichrome technique (27Goldner J. Am. J. Pathol. 1997; 14: 237-243Google Scholar), and four others serial to the stained sections were left unstained for fluorescent microscopy. Static and dynamic parameters of bone structure, formation, and resorption were measured using a semi-automatic method (Osteoplan II, Kontron, Munich, Germany) (18Zhao G. Monier-Faugere M.C. Langub M.C. Geng Z. Nakayama T. Pike J.W. Chernausek S.D. Rosen C.J. Donahue L.R. Malluche H.H. Fagin J.A. Clemens T.L. Endocrinology. 2000; 141: 2674-2682Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar, 28Malluche H.H. Sherman D. Meyer W. Massry S.G. Calcif. Tissue Int. 1982; 34: 439-448Crossref PubMed Scopus (143) Google Scholar). In 6-week-old mice, measurements were confined to the secondary spongiosa of the distal femur to ensure that only remodeling sites were analyzed. In 3-week-old mice, measurements were made in the epiphysis due to the lack of sufficient trabecular bone in the secondary spongiosa. For dynamic endpoints, 3- and 6-week-old animals were injected with calcein intraperitoneally on days 1 and 4 and sacrificed 2 or 3 days later. All parameters comply with the recommendations of the Histomorphometry Nomenclature Committee of the American Society of Bone and Mineral Research (29Parfitt A.M. Drezner M.K. Glorieux F.H. Kanis J.A. Malluche H. Meunier P.J. Ott S.M. Recker R.R. J. Bone Miner. Res. 1987; 2: 595-610Crossref PubMed Scopus (4921) Google Scholar). Results are expressed as mean ± S.E. All statistical tests were two-sided. An assigned significance level of 0.05 was used. Comparability of the two groups at any given time was assessed using the Mann-Whitney U test. Comparability of data from a group at different time points was done using the Kruskal-Wallis H test. All computations were performed using the SPSS software package for Windows release 7.5 (SPSS, Chicago, IL). Tissue-specific conditional mutagenesis requires crosses between Cre-producing and Cre-responding strains of mice. Responders used in this study, in which exon 3 of theIgf1r gene is “floxed” (flanked by loxP sites in direct orientation), have been described previously (21Dietrich P. Dragatsis I. Xuan S. Zeitlin S. Efstratiadis A. Mamm. Genome. 2000; 11: 196-205Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar). To drivecre expression in the osteoblasts of producer mice, we used the osteocalcin (OC) gene promoter and generated OC-cretransgenic mice (see “Materials and Methods”). Northern analysis demonstrated that the transgene encoding the recombinase was expressed in bones and in no other of the examined tissues (Fig.1 B). For the purposes of our experiments, it was important to demonstrate the specificity and efficiency of Cre-mediated recombination in osteoblasts. However, the floxed Igf1r allele could not serve itself as a reporter for this purpose, because the heterogeneity of skeletal tissue constituents precluded an assessment of the level of DNA excision by Southern analysis (osteoblasts represent only a minor bone component). Also unsuitable were (feasible, but difficult for bone tissue) alternative analyses, such as in situ hybridization and immunohistochemistry, since quantitative results could not be obtained. For these reasons, we used an indirect approach and crossed OC-cre producers with Z/AP mice (17Karsenty G. Wagner E.F. Dev. Cell. 2002; 2: 389-406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1204) Google Scholar) carrying a “double reporter” transgene, which consists of a sequence (βgeo) encoding β-galactosidase and a selectable marker flanked by twoloxP sites that is followed by a human placental alkaline phosphatase (hPLAP) gene (Fig.2 A). The latter gene is expressed after Cre-mediated excision of βgeo. Thus, the efficiency of Cre action can be estimated by determining in various tissues the reduction in X-gal staining and the appearance of staining for alkaline phosphatase. To determine the time of commencement of the OC-cretransgene expression during development, whole calvaria harvested from OC-cre/Z/AP embryos were stained for AP. As shown in Fig. 2 B, AP-positive cells were first detected in E17 calvaria at the primary ossification centers. Examination of sections from these calvaria revealed that the AP-positive elements were osteoblasts and osteocytes (Fig.2 C). Such sections were also stained for X-gal, to estimate the efficiency of Cre-mediated recombination. Osteoblasts, osteocytes, lining cells and cells within the marrow cavities of calvaria fromZ/AP embryos consistently stained positive for X-gal and were AP-negative (Fig. 2 C). In contrast, calvaria derived from OC-cre/Z/AP double transgenics exhibited a marked reduction in X-gal staining and the appearance of AP staining in the cells of the osteoblast lineage (Fig.2 C; the latter staining was less uniform than that for X-gal, possibly due to less efficient penetration of the AP reaction reagents into the whole mount preparation). In the double transgenic embryos, cells within the marrow (likely representing derivatives of hematopoetic origin) continued to stain positive for X-gal. To also provide an approximate quantitative estimate for the degree of Cre-mediated DNA excision brought about by the OC-cretransgene (“excision index”), we counted the numbers of X-gal-positive osteoblasts and osteocytes in calvarial sections from OC-cre/Z/AP andZ/AP (control) mice (4 sections each). We found that 84.4 ± 0.7% of the cells being monitored (2752 of 3261 cells) were positive for β-galactosidase expression in the control mice, whereas the corresponding score in the double transgenic calvarial sections was only 9.8 ± 1.4% (248 of 2530 cells). Thus, the estimated excision index in osteoblasts and osteocytes was [1-(9.8/84.4)] × 100 or 88.4%. Non-skeletal tissues including bladder, heart, and skeletal muscle from the same OC-cre/Z/AP mice consistently stained positive for lacZ and negative for AP (Fig. 2 D). Moreover, PCR analysis using DNA templates from tissues of OC-cre/Igf1r flox/floxoffspring confirmed that Cre-mediated recombination occurred exclusively in bone (Fig.3 B). Despite the fact that a direct estimation of the excision index for theIgf1rflox allele in osteoblasts and osteocytes is not feasible, we believe that assigning a level of nearly 90% by extrapolation from the results with the Z/AP reporter (documenting the successful performance of the OC-cre transgene) is justifiable, on the basis of the following consistent results. Whenever the Igf1rflox locus was used in combination with various high-performance cre transgenes analogous to OC-cre, including a liver-specific albumin-cre(5Yakar S. Liu J.L. Stannard B. Butler A. Accili D. Sauer B. LeRoith D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 7324-7329Crossref PubMed Scopus (1191) Google Scholar), a brain-specific CaMKIIα-cre (30Dragatsis I. Zeitlin S. Genesis. 2000; 26: 133-135Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar), a pancreatic β-cell-specific RIP-cre (31Herrera P.L. Development. 2000; 127: 2317-2322Crossref PubMed Google Scholar), and a mammary gland-specific WAP-cre (32Ludwig T. Fisher P. Murty V. Efstratiadis A. Oncogene. 2001; 20: 3937-3948Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar), practically complete Cre-mediated recombination has been observed. 3S. Xuan and A. Efstratiadis, unpublished data. Among the progeny of crosses between OC-cre/Igf1r +/flox andIgf1r flox/flox mice, female animals with an OC-cre/Igf1r flox/floxgenotype were selected for a detailed study of mutational effects using the femur as a long bone representative, whereas theirIgf1r flox/flox female siblings served as controls. The abnormalities described below were qualitatively similar, but less pronounced in male experimental animals (data not shown). Because of the expression of the cre transgene from E17 onward, osteoblasts appearing for the first time postnatally in the long bones of OC-cre/Igf1r flox/floxmice possess an Igf1r Δflox/Δfloxmutant genotype. For simplicity, these experimental animals will be referred to below as ΔIgf1r mice, although in all cells other than osteoblasts the floxed alleles of the Igf1r gene remain intact. Also by convention, the genetically modified, but normal (control) mice will be considered as indistinguishable from wild-type. To assess quantitatively bone mass, architecture, and turnover, static and dynamic histomorphometric analyses were performed on female ΔIgf1r and control littermates at 3 and 6 weeks of age, when the skeletal modeling in the mouse is very active (33Richman C. Kutilek S. Miyakoshi N. Srivastava A.K. Beamer W.G. Donahue L.R. Rosen C.J. Wergedal J.E. Baylink D.J. Mohan S. J. Bone Miner. Res. 2001; 16: 386-397Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar). At these ages, the mutant and normal animals were indistinguishable in size and weight. Moreover, no differences in femoral lengths were detected at 6 weeks (measured in mm with a dial caliper; 14.31 ± 0.45 and 14.41 ± 0.34 for ΔIgf1r and control female mice, respectively, with corresponding values for males of 15.18 ± 0.46 and 15.0 ± 0.53). Thus, disruption of the Igf1r gene in osteoblasts did not appear to affect the overall postnatal growth in the mutants. Although the 6-week measurements were focused on the secondary spongiosa of the distal femur, the histomorphometric analysis at 3 weeks was performed on the femoral epiphysis because at this age there is a greater amount of bone at this site (TableI). These quantitative data, which were consistent with qualitative evaluations of the trabecular bone in the primary and secondary spongiosa, revealed that the rate of epiphyseal bone formation (normalized for bone surface) was dramatically reduced in ΔIgf1r mice (∼42% of normal; Table I and Fig.4). Moreover, significant reductions in osteoblast and osteoclast numbers per bone perimeter (67–69% of normal) were observed (Table I and Fig. 4). However, differences between mutants and controls in trabecular bone volume fraction or architecture were not detected at this time point.Table IBone histomorphometryBone parameteraValues are shown as mean ± S.E. (n = 7 per group at 3 weeks; n= 8 per group at 6 weeks).3 weeks (epiphysis)6 weeks (secondary spongiosa)Control (C)Mutant (M)M/CdMutant to control ratios (M/C; expressed as percentages) are shown only for values exhibiting statistically significant differences.ControlMutantM/CdMutant to control ratios (M/C; expressed as percentages) are shown only for values exhibiting statistically significant differences.Bone structureBone volume/tissue volume (BV/TV; %)3.08 ± 0.752.47 ± 0.495.73 ± 0.653.09 ± 0.34cp < 0.01.53.9Trabecular thickness (Tb.Th; μm)19.0 ± 1.820.5 ± 1.322.3 ± 1.5616.8 ± 0.65cp < 0.01.75.3Trabecular number (Tb.N; /mm)1.51 ± 0.241.19 ± 0.212.58 ± 0.231.83 ± 0.17bp < 0.05.70.9Trabecular separation (Tb.Sp; μm)753 ± 127980 ± 158388 ± 37557 ± 47bp < 0.05.143.6Bone formationOsteoid volume/bone volume (OV/BV; %)3.43 ± 0.762.84 ± 1.24.93 ± 0.978.36 ± 1.08bp < 0.05.169.6Osteoid surface/bone surface (OS/BS; %)17 ± 3.5811.86 ± 2.4820.65 ± 2.9729.82 ± 1.99bp < 0.05.144.4Osteoid thickness (O.Th; μm)3.01 ± 0.393.06 ± 1.123.54 ± 0.293.84 ± 0.35Osteoblast surface/bone surface (Ob.S/BS; %)22.5 ± 2.2813.8 ± 1.94bp < 0.05.61.317.9 ± 3.1226.0 ± 1.89bp < 0.05.145.3Osteoblast number/bone perimeter (NOb/BPm; no./100 mm)1498 ± 1161039 ± 128bp < 0.05.69.41364 ± 2481833 ± 121Bone erosionErosion surface/bone surface (ES/BS; %)14.1 ± 1.6812.0 ± 1.4814.0 ± 2.325.9 ± 2.47cp < 0.01.185.0Erosion depth (E.De; μm)5.83 ± 0.47.91 ± 1.595.31 ± 0.64.87 ± 0.36Osteoblast surface (Oc.S/BS; %)6.87 ± 0.954.8 ± 0.877.97 ± 0.6911.6 ± 2.53Osteoclast number/bone perimeter (NOc/BPm; no./100 mm)232 ± 21156 ± 20bp < 0.05.67.2290 ± 38418 ± 98Bone dynamicsMineral apposition rate (M

Skeletal development and turnover occur in close spatial and temporal association with angiogenesis. Osteoblasts are ideally situated in bone to sense oxygen tension and respond to hypoxia by activating the hypoxia-inducible factor α (HIFα) pathway. Here we provide evidence that HIFα promotes angiogenesis and osteogenesis by elevating VEGF levels in osteoblasts. Mice overexpressing HIFα in osteoblasts through selective deletion of the von Hippel–Lindau gene (Vhl) expressed high levels of Vegf and developed extremely dense, heavily vascularized long bones. By contrast, mice lacking Hif1a in osteoblasts had the reverse skeletal phenotype of that of the Vhl mutants: long bones were significantly thinner and less vascularized than those of controls. Loss of Vhl in osteoblasts increased endothelial sprouting from the embryonic metatarsals in vitro but had little effect on osteoblast function in the absence of blood vessels. Mice lacking both Vhl and Hif1a had a bone phenotype intermediate between those of the single mutants, suggesting overlapping functions of HIFs in bone. These studies suggest that activation of the HIFα pathway in developing bone increases bone modeling events through cell-nonautonomous mechanisms to coordinate the timing, direction, and degree of new blood vessel formation in bone.

Mutations in the Wnt co-receptor LRP5 alter bone mass in humans, but the mechanisms responsible for Wnts actions in bone are unclear. To investigate the role of the classical Wnt signaling pathway in osteogenesis, we generated mice lacking the β-catenin or adenomatous polyposis coli (Apc) genes in osteoblasts. Loss of β-catenin produced severe osteopenia with striking increases in osteoclasts, whereas constitutive activation of β-catenin in the conditional Apc mutants resulted in dramatically increased bone deposition and a disappearance of osteoclasts. In vitro, osteoblasts lacking the β-catenin gene exhibited impaired maturation and mineralization with elevated expression of the osteoclast differentiation factor, receptor activated by nuclear factor-κB ligand (RANKL), and diminished expression of the RANKL decoy receptor, osteoprotegerin. By contrast, Apc-deficient osteoblasts matured normally but demonstrated decreased expression of RANKL and increased osteoprotegerin. These findings suggest that Wnt/β-catenin signaling in osteoblasts coordinates postnatal bone acquisition by controlling the differentiation and activity of both osteoblasts and osteoclasts. Mutations in the Wnt co-receptor LRP5 alter bone mass in humans, but the mechanisms responsible for Wnts actions in bone are unclear. To investigate the role of the classical Wnt signaling pathway in osteogenesis, we generated mice lacking the β-catenin or adenomatous polyposis coli (Apc) genes in osteoblasts. Loss of β-catenin produced severe osteopenia with striking increases in osteoclasts, whereas constitutive activation of β-catenin in the conditional Apc mutants resulted in dramatically increased bone deposition and a disappearance of osteoclasts. In vitro, osteoblasts lacking the β-catenin gene exhibited impaired maturation and mineralization with elevated expression of the osteoclast differentiation factor, receptor activated by nuclear factor-κB ligand (RANKL), and diminished expression of the RANKL decoy receptor, osteoprotegerin. By contrast, Apc-deficient osteoblasts matured normally but demonstrated decreased expression of RANKL and increased osteoprotegerin. These findings suggest that Wnt/β-catenin signaling in osteoblasts coordinates postnatal bone acquisition by controlling the differentiation and activity of both osteoblasts and osteoclasts. The Wnt signaling pathway is implicated in the regulation of bone mineral density (1Gong Y. Slee R.B. Fukai N. Rawadi G. Roman-Roman S. Reginato A.M. Wang H. Cundy T. Glorieux F.H. Lev D. Zacharin M. Oexle K. Marcelino J. Suwairi W. Heeger S. Sabatakos G. Apte S. Adkins W.N. Allgrove J. Arslan-Kirchner M. Batch J.A. Beighton P. Black G.C. Boles R.G. Boon L.M. Borrone C. Brunner H.G. Carle G.F. Dallapiccola B. De Paepe A. Floege B. Halfhide M.L. Hall B. Hennekam R.C. Hirose T. Jans A. Juppner H. Kim C.A. Keppler-Noreuil K. Kohlschuetter A. LaCombe D. Lambert M. Lemyre E. Letteboer T. Peltonen L. Ramesar R.S. Romanengo M. Somer H. Steichen-Gersdorf E. Steinmann B. Sullivan B. Superti-Furga A. Swoboda W. van den Boogaard M.J. Van Hul W. Vikkula M. Votruba M. Zabel B. Garcia T. Baron R. Olsen B.R. Warman M.L. Cell. 2001; 107: 513-523Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1810) Google Scholar, 2Boyden L.M. Mao J. Belsky J. Mitzner L. Farhi A. Mitnick M.A. Wu D. Insogna K. Lifton R.P. N. Engl. J. Med. 2002; 346: 1513-1521Crossref PubMed Scopus (1299) Google Scholar, 3Kato M. Patel M.S. Levasseur R. Lobov I. Chang B.H. Glass II, D.A. Hartmann C. Li L. Hwang T.H. Brayton C.F. Lang R.A. Karsenty G. Chan L. J. Cell Biol. 2002; 157: 303-314Crossref PubMed Scopus (925) Google Scholar, 4Little R.D. Carulli J.P. Del Mastro R.G. Dupuis J. Osborne M. Folz C. Manning S.P. Swain P.M. Zhao S.C. Eustace B. Lappe M.M. Spitzer L. Zweier S. Braunschweiger K. Benchekroun Y. Hu X. Adair R. Chee L. FitzGerald M.G. Tulig C. Caruso A. Tzellas N. Bawa A. Franklin B. McGuire S. Nogues X. Gong G. Allen K.M. Anisowicz A. Morales A.J. Lomedico P.T. Recker S.M. Van Eerdewegh P. Recker R.R. Johnson M.L. Am. J. Hum. Genet. 2002; 70: 11-19Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1060) Google Scholar, 5Babij P. Zhao W. Small C. Kharode Y. Yaworsky P.J. Bouxsein M.L. Reddy P.S. Bodine P.V. Robinson J.A. Bhat B. Marzolf J. Moran R.A. Bex F. J. Bone Miner. Res. 2003; 18: 960-974Crossref PubMed Scopus (437) Google Scholar). Wnt ligands bind and activate a specific cellular receptor complex composed of a member of the frizzled family of seven transmembrane-spanning proteins and either LRP5 or LRP6 (6He X. Semenov M. Tamai K. Zeng X. Development. 2004; 131: 1663-1677Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). LRP5 and LRP6 are members of a distinct subfamily of the low density lipoprotein receptor proteins (6He X. Semenov M. Tamai K. Zeng X. Development. 2004; 131: 1663-1677Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). Loss of LRP5 causes osteoporosis pseudoglioma syndrome in humans, which is characterized by low bone density at an early age (7De Paepe A. Leroy J.G. Nuytinck L. Meire F. Capoen J. Am. J. Med. Genet. 1993; 45: 30-37Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 8Gong Y. Vikkula M. Boon L. Liu J. Beighton P. Ramesar R. Peltonen L. Somer H. Hirose T. Dallapiccola B. De Paepe A. Swoboda W. Zabel B. Superti-Furga A. Steinmann B. Brunner H.G. Jans A. Boles R.G. Adkins W. van den Boogaard M.J. Olsen B.R. Warman M.L. Am. J. Hum. Genet. 1996; 59: 146-151PubMed Google Scholar), whereas point mutations in LRP5 are associated with extremely high bone density in an autosomal dominant inheritance pattern in humans and mice (2Boyden L.M. Mao J. Belsky J. Mitzner L. Farhi A. Mitnick M.A. Wu D. Insogna K. Lifton R.P. N. Engl. J. Med. 2002; 346: 1513-1521Crossref PubMed Scopus (1299) Google Scholar, 4Little R.D. Carulli J.P. Del Mastro R.G. Dupuis J. Osborne M. Folz C. Manning S.P. Swain P.M. Zhao S.C. Eustace B. Lappe M.M. Spitzer L. Zweier S. Braunschweiger K. Benchekroun Y. Hu X. Adair R. Chee L. FitzGerald M.G. Tulig C. Caruso A. Tzellas N. Bawa A. Franklin B. McGuire S. Nogues X. Gong G. Allen K.M. Anisowicz A. Morales A.J. Lomedico P.T. Recker S.M. Van Eerdewegh P. Recker R.R. Johnson M.L. Am. J. Hum. Genet. 2002; 70: 11-19Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1060) Google Scholar, 5Babij P. Zhao W. Small C. Kharode Y. Yaworsky P.J. Bouxsein M.L. Reddy P.S. Bodine P.V. Robinson J.A. Bhat B. Marzolf J. Moran R.A. Bex F. J. Bone Miner. Res. 2003; 18: 960-974Crossref PubMed Scopus (437) Google Scholar, 9Van Wesenbeeck L. Cleiren E. Gram J. Beals R.K. Benichou O. Scopelliti D. Key L. Renton T. Bartels C. Gong Y. Warman M.L. De Vernejoul M.C. Bollerslev J. Van Hul W. Am. J. Hum. Genet. 2003; 72: 763-771Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (470) Google Scholar). Binding of cognate receptors by Wnt ligands can initiate several downstream signaling cascades (6He X. Semenov M. Tamai K. Zeng X. Development. 2004; 131: 1663-1677Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). 1R. Nusse, personal communication.1R. Nusse, personal communication. Activation of the "canonical" pathway involves the stabilization of cytoplasmic levels of β-catenin. The main function of the adenomatous polyposis coli (APC) 2The abbreviations used are: APC, adenomatous polyposis coli; OPG, osteoprotegerin; μCT, microcomputed tomography; RANKL, receptor activated by nuclear factor-κB ligand; RT, reverse transcription; OC, osteocalcin.2The abbreviations used are: APC, adenomatous polyposis coli; OPG, osteoprotegerin; μCT, microcomputed tomography; RANKL, receptor activated by nuclear factor-κB ligand; RT, reverse transcription; OC, osteocalcin. protein appears to be the normal degradation of β-catenin. In the absence of APC, β-catenin levels are elevated, which ultimately contributes to increased proliferation (11Polakis P. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999; 9: 15-21Crossref PubMed Scopus (602) Google Scholar). This pathway requires either LRP5 or LRP6 for activity (6He X. Semenov M. Tamai K. Zeng X. Development. 2004; 131: 1663-1677Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar), but LRP5 and LRP6 may have other cellular functions that are not directly related to regulation of Wnt signaling. For example, mice lacking LRP5 display defects in cholesterol and glucose metabolism (12Fujino T. Asaba H. Kang M.J. Ikeda Y. Sone H. Takada S. Kim D.H. Ioka R.X. Ono M. Tomoyori H. Okubo M. Murase T. Kamataki A. Yamamoto J. Magoori K. Takahashi S. Miyamoto Y. Oishi H. Nose M. Okazaki M. Usui S. Imaizumi K. Yanagisawa M. Sakai J. Yamamoto T.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 229-234Crossref PubMed Scopus (328) Google Scholar). It remains unclear whether the bone defects seen in humans and mice lacking the Lrp5 gene are due solely to defects in Wnt signaling or if other downstream signaling cascades are involved. In this work, we have shown that osteoblast-specific deletion of the β-catenin gene leads to early onset, severe osteoporosis and is associated with defective osteoblast differentiation in vitro. In contrast, loss of Apc leads to early onset, severe osteopetrosis leading to lethality early in life. Interestingly, we show that these osteoblast-specific deletions are associated with alterations in the regulation of osteoprotegerin (OPG) and receptor activated by nuclear factor-κ B ligand (RANKL) and with altered osteoclastogenesis in vivo. Thus, this work provides the first genetic evidence that dysregulation of β-catenin in osteoblasts leads to defects in bone development and supplies the first link between Wnt/β-catenin signaling in osteoblasts and functional alterations of the osteoclast regulated by the OPG/RANKL signaling axis. Mouse Crosses—OC-cre mice (20Zhang M. Xuan S. Bouxsein M.L. von Stechow D. Akeno N. Faugere M.C. Malluche H. Zhao G. Rosen C.J. Efstratiadis A. Clemens T.L. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44005-44012Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar) were mated with homozygous conditional mutants carrying modified Apc (19Shibata H. Toyama K. Shioya H. Ito M. Hirota M. Hasegawa S. Matsumoto H. Takano H. Akiyama T. Toyoshima K. Kanamaru R. Kanegae Y. Saito I. Nakamura Y. Shiba K. Noda T. Science. 1997; 278: 120-123Crossref PubMed Scopus (456) Google Scholar) or β-catenin (18Brault V. Moore R. Kutsch S. Ishibashi M. Rowitch D.H. McMahon A.P. Sommer L. Boussadia O. Kemler R. Development. 2001; 128: 1253-1264Crossref PubMed Google Scholar) alleles to generate OC-cre/Apcflox/+ and OC-cre/β-cateninflox/+ progeny, which were used in subsequent matings. All experiments performed were in compliance with the guiding principles of the "Care and Use of Animals" available at www.nap.edu/books/0309053773/html and approved prior to use by the Van Andel Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee. Genotype Analysis—DNA was prepared from tail biopsies using an AutoGenprep 960 automated DNA isolation system. PCR-based strategies were then used to genotype these mice (details available upon request). Demineralized Bone Histology—Tissue samples were fixed in formalin overnight, decalcified in Immunocal decalcifying agent (Decal, Baltimore, MD) overnight, and then dehydrated through a graded alcohol series in a Ventana Renaissance processor (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Tissues were paraffin-embedded, and 5-μm sections were adhered to glass slides. Slides were de-paraffinized and stained with hematoxylon and eosin or left unstained for immunohistochemistry. Mineralized Bone Histology—Femurs were fixed in ethanol at room temperature, dehydrated, and embedded in methylmethacrylate. 3-μm sections were cut with a Microm microtome and stained with modified Mason-Goldner trichrome stain. The number of osteoblasts and osteoclasts per bone perimeter were measured at standardized sites under the growth plate using a semiautomatic method (Osteoplan II; Kontron, Munich, Germany) at a magnification of ×200. These parameters comply with guidelines of the nomenclature committee of the American Society of Bone and Mineral Research (13Parfitt A.M. Drezner M.K. Glorieux F.H. Kanis J.A. Malluche H. Meunier P.J. Ott S.M. Recker R.R. J. Bone Miner. Res. 1987; 2: 595-610Crossref PubMed Scopus (4859) Google Scholar). Osteoblast Isolation and Culture—Osteoblasts were isolated from calvaria of newborn mice by serial digestion in α-minimal essential medium (Mediatech, Herndon, VA) containing 10% bovine serum albumin, 25 mm HEPES, pH 7.4, 0.2 mg/ml collagenase type I (Worthington, Lakewood, NJ), 0.7 mg/ml collagenase type 2 (Worthington), and 1 mm CaCl2. Calvaria were digested for 15 min at 37 °C with constant agitation. The digestion solution was collected, washed with fresh medium, and digested an additional five times. Digestions 3–6 (containing the osteoblasts) were centrifuged, washed with α-minimal essential medium containing 10% fetal bovine serum, 1% pen/strep, and plated overnight at 37 °C. The next day, the cells were trypsinized and 1.1 × 105 cells were plated on 6-cm dishes. The medium was supplemented with 5 mm β-glycerophosphate (Sigma) and 100 μg/ml ascorbic acid (Sigma) (mineralization medium), which was replaced every other day. Immunohistochemistry—β-Catenin was detected in cells using a mouse monoclonal antibody (BD Transduction Laboratories) at a 1:100 dilution. The signal was detected with the Vectastain ABC kit (Vector Labs, Burlingame, CA) and visualized with 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Vector Labs). Slides were counterstained with hematoxylin. Von Kossa Staining—Cultures were maintained in differentiation medium for the days indicated and fixed in 10% neutral buffered formalin. The cells were washed with water, dehydrated, and allowed to air dry. Silver nitrate (2%) was added to the cells for 20 min. The cells were washed with water and then incubated with 5% sodium carbonate for 3 min. Microcomputed Tomography (μCT)—High resolution images of the femur were acquired using a desktop microtomographic imaging system (MicroCT40; Scanco Medical AG, Basserdorf, Switzerland). The femur was scanned at 45 keV with an isotropic voxel size of 6 μm, and the resulting two-dimensional cross-sectional images are shown in gray scale. Scanning was started in the mid-epiphysis and extended proximally for ∼3.6 mm (600 CT slices/specimen). OPG Serum Enzyme-linked Immunosorbent Assay—Serum was collected from animals, and serum OPG levels were quantitated using the mouse OPG/TNFSRSF11B immunoassay according to the manufacturer's specifications (R&D Systems, Minneapolis, MN). Semiquantitative RT-PCR—mRNA was extracted from cells using TRIzol (Invitrogen) extraction protocol. Briefly, the cells were homogenized in TRIzol and mRNA was extracted using chloroform. The RNA was precipitated by isopropanol, and 5 μg of mRNA was used to synthesize first strand cDNA using an Invitrogen superscript cDNA synthesis kit. RNA controls and reverse transcription controls were used for all reactions. First strand cDNA was amplified using the sequence-specific primer sets listed below at the indicated annealing temperatures (30 cycles), and the products were resolved on 1–2% agarose gels. 1-kb or 100-bp ladders (Invitrogen) were used as markers. Primers used were: OPG, (5′-GTGAAGCAGGAGTGCAAC-3′ and 5′-GCAAACTGTGTTTCGCTC-3′ at 54 °C annealing temperature); RANKL, (5′-TGTACTTTCGAGCGCAGATG-3′ and 5′-ACATCCAACCATGAGCCTTC-3′ at 59 °C); osteocalcin, (5′-CAAGTCCCACACAGCAGCTT-3′ and 5′-AAAGCCGAGCTGCCAGAGTT-3′ at 58 °C); Runx-2, (5′-CCAAATTTGCCTAACAGAATG-3′ and 5′-GAGGCTGTGGTTTCAAAGCA-3′ at 56 °C); and β-actin (5′-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3′ and 5′-GGCATACAGGGACAGCACAGCC-3′ at 56 °C). Mice with Osteoblast-specific Deletions of β-Catenin or Apc Die by 4 Weeks of Age—Because global inactivation of either the β-catenin gene (14Haegel H. Larue L. Ohsugi M. Fedorov L. Herrenknecht K. Kemler R. Development. 1995; 121: 3529-3537Crossref PubMed Google Scholar, 15Huelsken J. Vogel R. Brinkmann V. Erdmann B. Birchmeier C. Birchmeier W. J. Cell Biol. 2000; 148: 567-578Crossref PubMed Scopus (509) Google Scholar) or Apc (16Fodde R. Edelmann W. Yang K. van Leeuwen C. Carlson C. Renault B. Breukel C. Alt E. Lipkin M. Khan P.M. Kucherlapati R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 8969-8973Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 17Moser A.R. Shoemaker A.R. Connelly C.S. Clipson L. Gould K.A. Luongo C. Dove W.F. Siggers P.H. Gardner R.L. Dev. Dyn. 1995; 203: 422-433Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar) results in early embryonic death, we crossed mice containing conditionally inactivatable alleles of β-catenin (β-catenin-flox) (18Brault V. Moore R. Kutsch S. Ishibashi M. Rowitch D.H. McMahon A.P. Sommer L. Boussadia O. Kemler R. Development. 2001; 128: 1253-1264Crossref PubMed Google Scholar) or Apc (Apc-flox) (19Shibata H. Toyama K. Shioya H. Ito M. Hirota M. Hasegawa S. Matsumoto H. Takano H. Akiyama T. Toyoshima K. Kanamaru R. Kanegae Y. Saito I. Nakamura Y. Shiba K. Noda T. Science. 1997; 278: 120-123Crossref PubMed Scopus (456) Google Scholar) to mice expressing cre under the control of the osteocalcin (OC) promoter (20Zhang M. Xuan S. Bouxsein M.L. von Stechow D. Akeno N. Faugere M.C. Malluche H. Zhao G. Rosen C.J. Efstratiadis A. Clemens T.L. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44005-44012Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar) to disrupt these genes in osteoblasts. Previous analysis of the OC-cre strain via crossing it to strains carrying cre reporter transgenes indicated that expression of cre recombinase was specific to cells of the osteoblast lineage with no detectable expression or function in other cell lineages (20Zhang M. Xuan S. Bouxsein M.L. von Stechow D. Akeno N. Faugere M.C. Malluche H. Zhao G. Rosen C.J. Efstratiadis A. Clemens T.L. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44005-44012Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar). As expected, deletion of the β-catenin gene led to loss of β-catenin protein (Fig. 1, a and b). Consistent with its role in mediating β-catenin degradation (11Polakis P. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999; 9: 15-21Crossref PubMed Scopus (602) Google Scholar), deletion of Apc was associated with significantly elevated levels of β-catenin as assessed by immunohistochemistry (Fig. 1, b and c). By 1 week of age mice homozygous for either mutation could be identified by their reduced size (Fig. 1, d–g). OC-cre;β-catenin-flox/flox (Δβ-catenin, or Δβ-cat) mice died within 5 weeks (Fig. 1h). Growth retardation was even more severe in the OC-cre;Apc-flox/flox (ΔAPC) mice (Fig. 1g), and these mice generally succumbed within 2 weeks (Fig. 1i). At weaning, only 75% of the expected number of Δβ-catenin mice and only 10% of the expected number of ΔAPC mice were identified (Fig. 1, h and i). No defects in the incisors were observed either grossly or histologically, and the teeth erupted normally in both mutants (data not shown). The cause of the postnatal lethality in these mutant mice is currently unclear but is certainly not because of aberrant expression of the osteocalcin promoter in extraosseous tissues (20Zhang M. Xuan S. Bouxsein M.L. von Stechow D. Akeno N. Faugere M.C. Malluche H. Zhao G. Rosen C.J. Efstratiadis A. Clemens T.L. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44005-44012Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (566) Google Scholar). Importantly, mice carrying osteoblast-specific deletions of both the Apc and β-catenin genes (ΔAPC/Δβ-catenin) display growth and survival characteristics similar to those lacking only the β-catenin gene (data not shown), suggesting that the severe phenotype induced by loss of Apc is due to dysregulation of β-catenin signaling. Δβ-Catenin and ΔAPC Mice Have Dramatic Defects in Bone Development—Analysis of femurs from Δβ-catenin mice by μCT revealed striking reductions in both the trabecular and cortical bone compartments (Fig. 2, a and b). In contrast, analysis of ΔAPC mice revealed a significant accumulation of bone matrix in the femur, to the point where the marrow space was almost completely filled (Fig. 2, d and e). Bone in the metaphyseal region was poorly mineralized, whereas osteoid in the diaphysis was more completely mineralized and entirely filled the marrow cavity. μCT images of femurs from ΔAPC/Δβ-catenin mice were similar to those seen in Δβ-catenin mice, again suggesting that loss of APC induced phenotypes in a β-catenin-dependent manner (Fig. 2c). Examination of undecalcified sections from tibia of the Δβ-catenin mice disclosed a dramatic reduction in mineralized cortical and trabecular bone (Fig. 3, a–d), consistent with changes observed by μCT. By contrast, the ΔAPC mice had dramatically increased bone deposition associated with disturbances in bone architecture and composition (Fig. 3, e–h). For example, the growth plate of ΔAPC mice lacked a secondary ossification center and was misshapen (Fig. 3g), possibly because of the rapid rate of bone formation and the lack of osteoclasts (see below) that would normally function to shape the ends of the bone. Further analysis of decalcified bone sections from 4-week-old Δβ-catenin and 2-week-old ΔAPC mice showed marked abnormalities in all bone examined, including vertebrae, long bones, and calvaria (Fig. 4).Fig. 4Histological analysis of decalcified bone from Δβ-catenin and ΔAPC mice. a, d, and g, femur; b, e, and h, vertebrae; c, f, and i, skull from 32-day-old Δβ-catenin (a–c) and ΔAPC (g–i) mice as compared with age-matched (d–f) control littermates. The skull sections were taken from equivalent positions immediately dorsal to the hippocampus. Calibration marks are indicated.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Effects of Dysregulation of β-Catenin on Osteoblast Differentiation in Vitro—To examine the cellular mechanisms responsible for these disturbances in the mutant mice, we studied the effect of conditional deletion of the β-catenin and Apc genes in calvarial osteoblasts in vitro. Cells derived from mice carrying the floxed alleles were infected with adenovirus expressing the cre recombinase (Cre+) or a control adenovirus directing the expression of green fluorescent protein (Cre–) and then differentiated in the presence of β-glycerol phosphate and ascorbate (mineralizing medium). No obvious qualitative differences in proliferation rates or osteoblast density were observed in osteoblasts mutant for either gene (data not shown). However, consistent with the osteopenic phenotype of the Δβ-catenin mice, osteoblasts deficient in β-catenin showed delayed and diminished expression of osteocalcin as well as a marked reduction in calcified nodule formation (von Kossa staining). Interestingly, Runx-2 expression levels were similar in control and β-catenin osteoblasts (Fig. 5a), suggesting that early events in the osteoblast differentiation program (21Karsenty G. Endocrinology. 2001; 142: 2731-2733Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar) do not depend on signaling through β-catenin. In contrast, ΔAPC osteoblasts appeared to mature and mineralize normally in vitro, although osteocalcin expression levels increased somewhat prematurely as compared with controls (Fig. 5b). It appears, therefore, that excess β-catenin signaling does not severely impact the ability of osteoblasts to differentiate, at least in vitro. Thus, the more dramatic effects of disruption of the β-catenin gene observed in vivo may be due to non-cell autonomous functions of APC in osteoblasts. Dysregulation of β-Catenin in Osteoblasts Is Associated with Abnormal Osteoclastogenesis—Initial histological analysis (Fig. 3) suggested a disturbance in osteoclastogenesis in both mutants. Indeed, quantitation of osteoclasts in representative long bone sections showed that osteoclast numbers were dramatically increased in the Δβ-catenin mutants but entirely absent in the ΔAPC mice (Fig. 6a). In addition, osteoblasts were dramatically decreased in Δβ-catenin mutants at 4 weeks of age and were absent in ΔAPC mice at 2 weeks of age (data not shown). However, the dramatic deposition of osteoid material in ΔAPC mice suggests they were present at an earlier age. These findings suggested that dysregulated β-catenin signaling in osteoblasts not only causes cell-autonomous osteoblast defects but can also impact bone resorption by altering the numbers of osteoclasts. To explore this possibility further, we measured the expression of RANKL, the major osteoclast differentiation factor, and the osteoclast inhibitory factor, OPG (22Hofbauer L.C. Schoppet M. J. Am. Med. Assoc. 2004; 292: 490-495Crossref PubMed Scopus (796) Google Scholar). In Δβ-catenin osteoblasts, OPG mRNA expression was decreased compared with controls after 5 and 10 days of differentiation in mineralization medium, whereas RANKL expression was increased (Fig. 6b). The reverse pattern was observed in the ΔAPC osteoblasts (Fig. 6c). In addition, levels of serum OPG in the ΔAPC mice were 3-fold higher than controls (Fig. 6d). Serum OPG levels were similar to controls in both Δβ-catenin and ΔAPC/Δβ-catenin mice (data not shown). Taken together, these observations suggest that alterations in β-catenin signaling in osteoblasts brought about by each mutation lead to marked disturbances in osteoclast differentiation. In this study we used conditional mutagenesis to disrupt selectively the genes encoding β-catenin and Apc in mouse osteoblasts. In both models, osteoblast-specific disruption of the canonical Wnt signaling pathway led to postnatal death. In the case of the ΔAPC mice, we speculate that deficiencies in hematopoiesis may be responsible. As shown, ΔAPC mice develop bone in which the vast majority of the marrow component is absent. In other situations where osteopetrosis is observed in humans and mice, it is often accompanied with hepatosplenomegaly associated with extramedullary hematopoiesis. Interestingly, despite severe osteopetrosis, we have not observed any evidence of extramedullary hematopoiesis in these mice. Importantly, mice carrying osteoblast-specific deletions of both the Apc and the β-catenin genes are phenotypically similar to those lacking only the β-catenin gene (Fig. 2), suggesting that the majority of the phenotype induced by loss of APC is because of dysregulated β-catenin signaling. In the case of Δβ-catenin mice, we occasionally observe animals with paralysis, consistent with osteoporotic-related fractures, accounting for some portion of the lethality observed. However, we find that many of these animals die very suddenly between 26 and 30 days of age (Fig. 1) without prior evidence of paralysis. One explanation is that catastrophic fractures may occur leading to full paralysis and sudden death. Alternatively, defects in hematopoietic cell regulation or other systemic defects may play a role. The skeletal phenotypes observed in these mice allow two important conclusions regarding the role of Wnt signaling in skeletal development. First, Wnt signaling controls postnatal bone acquisition by determining β-catenin levels in osteoblasts, and the previously identified alterations in bone mass in humans carrying mutations in LRP5 (1Gong Y. Slee R.B. Fukai N. Rawadi G. Roman-Roman S. Reginato A.M. Wang H. Cundy T. Glorieux F.H. Lev D. Zacharin M. Oexle K. Marcelino J. Suwairi W. Heeger S. Sabatakos G. Apte S. Adkins W.N. Allgrove J. Arslan-Kirchner M. Batch J.A. Beighton P. Black G.C. Boles R.G. Boon L.M. Borrone C. Brunner H.G. Carle G.F. Dallapiccola B. De Paepe A. Floege B. Halfhide M.L. Hall B. Hennekam R.C. Hirose T. Jans A. Juppner H. Kim C.A. Keppler-Noreuil K. Kohlschuetter A. LaCombe D. Lambert M. Lemyre E. Letteboer T. Peltonen L. Ramesar R.S. Romanengo M. Somer H. Steichen-Gersdorf E. Steinmann B. Sullivan B. Superti-Furga A. Swoboda W. van den Boogaard M.J. Van Hul W. Vikkula M. Votruba M. Zabel B. Garcia T. Baron R. Olsen B.R. Warman M.L. Cell. 2001; 107: 513-523Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1810) Google Scholar, 2Boyden L.M. Mao J. Belsky J. Mitzner L. Farhi A. Mitnick M.A. Wu D. Insogna K. Lifton R.P. N. Engl. J. Med. 2002; 346: 1513-1521Crossref PubMed Scopus (1299) Google Scholar, 4Little R.D. Carulli J.P. Del Mastro R.G. Dupuis J. Osborne M. Folz C. Manning S.P. Swain P.M. Zhao S.C. Eustace B. Lappe M.M. Spitzer L. Zweier S. Braunschweiger K. Benchekroun Y. Hu X. Adair R. Chee L. FitzGerald M.G. Tulig C. Caruso A. Tzellas N. Bawa A. Franklin B. McGuire S. Nogues X. Gong G. Allen K.M. Anisowicz A. Morales A.J. Lomedico P.T. Recker S.M. Van Eerdewegh P. Recker R.R. Johnson M.L. Am. J. Hum. Genet. 2002; 70: 11-19Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1060) Google Scholar, 9Van Wesenbeeck L. Cleiren E. Gram J. Beals R.K. Benichou O. Scopelliti D. Key L. Renton T. Bartels C. Gong Y. Warman M.L. De Vernejoul M.C. Bollerslev J. Van Hul W. Am. J. Hum. Genet. 2003; 72: 763-771Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (470) Google Scholar) result from aberrant β-catenin signaling. However, it is important to note that the bone phenotypes resulting from inactivation of osteoblast β-catenin signaling, although consistent with the alterations seen in patients carrying mutations in LRP5, were more severe. One explanation for this difference is the potential role of LRP6 in β-catenin regulation in osteoblasts. We speculate that the continued presence of LRP6 in the context of LRP5 deficiency allows residual Wnt signaling through β-catenin. In agreement with this idea, we (23Holmen S.L. Giambernardi T.A. Zylstra C.R. Buckner-Berghuis B.D. Resau J.H. Hess J.F. Glatt V. Bouxsein M.L. Ai M. Warman W.W. Williams B.O. J. Bone Min. Res. 2004; 19: 2033-2040Crossref PubMed Google Scholar) and others (24Kelly O.G. Pinson K.I. Skarnes W.C. Development. 2004; 131: 2803-2815Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar) have shown that mice carrying mutations in both Lrp5 and Lrp6 show synergistic defects in bone development. In an alternative model, functions of β-catenin independent of Wnt signaling contribute to the observed phenotype. For example, β-catenin also plays a key role in mediating cell-cell adhesion through its interaction with E-cadherin (25Nelson W.J. Nusse R. Science. 2004; 303: 1483-1487Crossref PubMed Scopus (2190) Google Scholar). E-cadherin is a single-pass transmembrane protein that forms homotypic dimers with E-cadherin proteins expressed on adjacent cells (25Nelson W.J. Nusse R. Science. 2004; 303: 1483-1487Crossref PubMed Scopus (2190) Google Scholar). The intracellular portion of E-cadherin binds directly to either β-catenin or the related plakoglobin protein, which then associates with α-catenin. The association of α-catenin with the actin cytoskeleton completes the coupling of cell-cell adhesion to the cytoskeleton. Although some studies have suggested that plakoglobin and β-catenin are interchangeable in mediating these cell adhesion complexes (26Wheelock M.J. Johnson K.R. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 509-514Crossref PubMed Scopus (227) Google Scholar), it is possible that loss of β-catenin could also affect cell-cell adhesion in osteoblasts. However, the fact that ΔAPC mice exhibit the converse phenotype suggests that the functions of β-catenin in canonical Wnt signaling underlie the observed phenotypes. Also, our observations that mice carrying osteoblast-specific mutations in both Apc and β-catenin genes have phenotypes similar to those seen in mice mutant for only the β-catenin gene suggests that the osteopetrosis seen in ΔAPC animals is due to dysregulation of β-catenin signaling. A more definitive picture of the role of cadherin-mediated adhesion in osteoblast differentiation may be provided by creating mice carrying osteoblast-specific knockouts of the α-catenin gene. This will disrupt cadherin-based adhesion in osteoblasts without directly affecting the canonical Wnt signaling pathway. The second conclusion from our studies is that β-catenin signaling in the mature osteoblast controls postnatal bone acquisition through both cell-autonomous and non-autonomous mechanisms. Thus, β-catenin signaling may not be required for the initial commitment of cells to the osteoblast lineage, based on Runx2 expression (3Kato M. Patel M.S. Levasseur R. Lobov I. Chang B.H. Glass II, D.A. Hartmann C. Li L. Hwang T.H. Brayton C.F. Lang R.A. Karsenty G. Chan L. J. Cell Biol. 2002; 157: 303-314Crossref PubMed Scopus (925) Google Scholar, 21Karsenty G. Endocrinology. 2001; 142: 2731-2733Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar), but appears to be essential for the performance of the more mature osteoblast (e.g. osteocalcin expression and mineralization) (27Aronow M.A. Gerstenfeld L.C. Owen T.A. Tassinari M.S. Stein G.S. Lian J.B. J. Cell. Physiol. 1990; 143: 213-221Crossref PubMed Scopus (479) Google Scholar, 28Owen T.A. Aronow M. Shalhoub V. Barone L.M. Wilming L. Tassinari M.S. Kennedy M.B. Pockwinse S. Lian J.B. Stein G.S. J. Cell. Physiol. 1990; 143: 420-430Crossref PubMed Scopus (1354) Google Scholar). However, the marked alterations in osteoclast numbers and reciprocal patterns of expression of OPG and RANKL in the context of dysregulated β-catenin signaling suggest that non-cell autonomous effects on osteoclast progenitors also impact overall bone acquisition. Further support for this latter effect has come from a recent report indicating that the OPG gene may be a direct transcriptional target for complexes containing the β-catenin protein (10Jackson A. Vayssiere B. Garcia T. Newell W. Baron R. Roman-Roman S. Rawadi G. Bone. 2005; 36: 585-598Crossref PubMed Scopus (142) Google Scholar). These combined effects of Wnt signaling through the canonical pathway in mature osteoblasts are therefore critical in the control of normal bone acquisition, and this pathway represents a plausible pharmaceutical target for treating osteoporosis and other bone disorders. We thank Tetsuo Noda for the Apc-flox embrymonic stem cells and Rolf Kemler for making β-catenin-flox mice available through the Jackson Laboratories. We thank Pam Swiatek and the Van Andel Research Institute (VARI) Mouse Germ Line Modification Core for generating Apc-flox mice from these ES cells. We also thank Kyle Furge for advice on statistics, David Nadziejka for critically reading the manuscript, Phil Sohn for help formatting figures, Jim Resau and the VARI Laboratory of Analytical, Cellular, and Molecular Microscopy for assistance, and Bryn Eagleson, Jason Martin, Sylvia Marinelli, and the rest of the VARI vivarium staff for expert animal husbandry. We acknowledge the Michigan Economic Development Corporation and the Michigan Technology Tri-Corridor for supporting these cores (Michigan Animals Models Consortium Grant 085P1000815). Download .pdf (.07 MB) Help with pdf files