HepatologyVolume 41, Issue 6 p. 1313-1321 Liver Failure and Liver DiseaseFree Access Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease† David E. Kleiner, Corresponding Author David E. Kleiner KleinerD@mail.nih.gov Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, Bethesda, MD fax: 301-480-9488Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, Bldg 10, Room 2N212, MSC 1516, Bethesda, MD 20892===Search for more papers by this authorElizabeth M. Brunt, Elizabeth M. Brunt Saint Louis University Liver Center, Department of Pathology, Saint Louis University School of Medicine, St. Louis, MOSearch for more papers by this authorMark Van Natta, Mark Van Natta Johns Hopkins Center for Clinical Trials, Baltimore, MDSearch for more papers by this authorCynthia Behling, Cynthia Behling Department of Pathology, University of California San Diego, San Diego, CASearch for more papers by this authorMelissa J. Contos, Melissa J. Contos Department of Pathology, Virginia Commonwealth University, Richmond, VASearch for more papers by this authorOscar W. Cummings, Oscar W. Cummings Department of Pathology, University Hospital, Indianapolis, INSearch for more papers by this authorLinda D. Ferrell, Linda D. Ferrell Department of Pathology, University of California San Francisco, San Francisco, CASearch for more papers by this authorYao-Chang Liu, Yao-Chang Liu Department of Pathology, MetroHealth Medical Center, Cleveland, OHSearch for more papers by this authorMichael S. Torbenson, Michael S. Torbenson Department of Pathology, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, MDSearch for more papers by this authorAynur Unalp-Arida, Aynur Unalp-Arida Johns Hopkins Center for Clinical Trials, Baltimore, MDSearch for more papers by this authorMatthew Yeh, Matthew Yeh Department of Pathology, University of Washington Medical Center, Seattle, WASearch for more papers by this authorArthur J. McCullough, Arthur J. McCullough Division of Gastroenterology, MetroHealth Medical Center, Cleveland, OHSearch for more papers by this authorArun J. Sanyal, Arun J. Sanyal Department of Internal Medicine, Division of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, Virginia Commonwealth University Medical Center, Richmond, VASearch for more papers by this authorNonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network, Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network A list of members of the Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network is located in the Appendix.Search for more papers by this author David E. Kleiner, Corresponding Author David E. Kleiner KleinerD@mail.nih.gov Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, Bethesda, MD fax: 301-480-9488Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, Bldg 10, Room 2N212, MSC 1516, Bethesda, MD 20892===Search for more papers by this authorElizabeth M. Brunt, Elizabeth M. Brunt Saint Louis University Liver Center, Department of Pathology, Saint Louis University School of Medicine, St. Louis, MOSearch for more papers by this authorMark Van Natta, Mark Van Natta Johns Hopkins Center for Clinical Trials, Baltimore, MDSearch for more papers by this authorCynthia Behling, Cynthia Behling Department of Pathology, University of California San Diego, San Diego, CASearch for more papers by this authorMelissa J. Contos, Melissa J. Contos Department of Pathology, Virginia Commonwealth University, Richmond, VASearch for more papers by this authorOscar W. Cummings, Oscar W. Cummings Department of Pathology, University Hospital, Indianapolis, INSearch for more papers by this authorLinda D. Ferrell, Linda D. Ferrell Department of Pathology, University of California San Francisco, San Francisco, CASearch for more papers by this authorYao-Chang Liu, Yao-Chang Liu Department of Pathology, MetroHealth Medical Center, Cleveland, OHSearch for more papers by this authorMichael S. Torbenson, Michael S. Torbenson Department of Pathology, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, MDSearch for more papers by this authorAynur Unalp-Arida, Aynur Unalp-Arida Johns Hopkins Center for Clinical Trials, Baltimore, MDSearch for more papers by this authorMatthew Yeh, Matthew Yeh Department of Pathology, University of Washington Medical Center, Seattle, WASearch for more papers by this authorArthur J. McCullough, Arthur J. McCullough Division of Gastroenterology, MetroHealth Medical Center, Cleveland, OHSearch for more papers by this authorArun J. Sanyal, Arun J. Sanyal Department of Internal Medicine, Division of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, Virginia Commonwealth University Medical Center, Richmond, VASearch for more papers by this authorNonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network, Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network A list of members of the Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network is located in the Appendix.Search for more papers by this author First published: 24 May 2005 https://doi.org/10.1002/hep.20701Citations: 6,343 † Potential conflict of interest: Nothing to report. AboutSectionsPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onFacebookTwitterLinked InRedditWechat Abstract Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is characterized by hepatic steatosis in the absence of a history of significant alcohol use or other known liver disease. Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is the progressive form of NAFLD. The Pathology Committee of the NASH Clinical Research Network designed and validated a histological feature scoring system that addresses the full spectrum of lesions of NAFLD and proposed a NAFLD activity score (NAS) for use in clinical trials. The scoring system comprised 14 histological features, 4 of which were evaluated semi-quantitatively: steatosis (0-3), lobular inflammation (0-2), hepatocellular ballooning (0-2), and fibrosis (0-4). Another nine features were recorded as present or absent. An anonymized study set of 50 cases (32 from adult hepatology services, 18 from pediatric hepatology services) was assembled, coded, and circulated. For the validation study, agreement on scoring and a diagnostic categorization (“NASH,” “borderline,” or “not NASH”) were evaluated by using weighted kappa statistics. Inter-rater agreement on adult cases was: 0.84 for fibrosis, 0.79 for steatosis, 0.56 for injury, and 0.45 for lobular inflammation. Agreement on diagnostic category was 0.61. Using multiple logistic regression, five features were independently associated with the diagnosis of NASH in adult biopsies: steatosis (P = .009), hepatocellular ballooning (P = .0001), lobular inflammation (P = .0001), fibrosis (P = .0001), and the absence of lipogranulomas (P = .001). The proposed NAS is the unweighted sum of steatosis, lobular inflammation, and hepatocellular ballooning scores. In conclusion, we present a strong scoring system and NAS for NAFLD and NASH with reasonable inter-rater reproducibility that should be useful for studies of both adults and children with any degree of NAFLD. NAS of ≥5 correlated with a diagnosis of NASH, and biopsies with scores of less than 3 were diagnosed as “not NASH.” (HEPATOLOGY 2005;41:1313–1321.) Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is increasingly recognized as the hepatic manifestation of insulin resistance and the systemic complex known as metabolic syndrome.1-4 Prevalence estimates of NAFLD have used a variety of laboratory and imaging assessments and suggest that NAFLD may be the most common form of chronic liver disease in adults in the United States, Australia, Asia, and Europe, paralleling the “epidemic” of obesity in developed countries.5-9 Ludwig et al.10 are credited with solidifying the nomenclature and pathological findings of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) in a seminal manuscript published in 1980. Now recognized as a progressive form of fatty liver disease, NASH has been documented to have the potential to progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.3, 5 NASH may be a leading cause of “cryptogenic cirrhosis” in which etiologically specific clinical laboratory or pathological features can no longer be identified.11 NAFLD is also gaining recognition as a significant form of liver disease in pediatric populations, which in some patients may progress to cirrhosis in adulthood.12, 13 Whereas laboratory test abnormalities and radiographic findings may be suggestive of NAFLD, histological evaluation remains the only means of accurately assessing the degree of steatosis, the distinct necroinflammatory lesions and fibrosis of NASH, and distinguishing NASH from “simple” steatosis, or steatosis with inflammation.14 Matteoni et al.15 showed that cirrhosis developed in 21% to 28% of patients whose index biopsies had shown the combination of lesions of steatosis, inflammation, ballooning, and Mallory's hyaline or fibrosis, whereas only 4% of patients with simple steatosis and none of the patients with steatosis and inflammation alone had evidence of cirrhosis during the 10 years of follow-up. A system for semiquantitative evaluation for the unique lesions recognized for NASH proposed by Brunt et al.16 in 1999 was developed to parallel the concepts and terminology used in chronic hepatitis for semiquantitative evaluation, commonly referred to as “grading” and “staging.”17 The proposed system was based on the concept that the histological diagnosis of NASH rests on a constellation of features rather than any individual feature. However, it was developed for NASH and was not developed to encompass the entire spectrum of NAFLD as defined by Matteoni et al.15 A different semiquantitative feature-based scoring system for NAFLD was used in a recently published treatment trial from Promrat et al.18 Neither of these systems was designed to evaluate pediatric NAFLD, which may show different histological features than adult NASH.12 Beginning in 2002, the National Institute of Diabetes & Digestive & Kidney Diseases (NIDDK) sponsored the development of a multicenter cooperative Clinical Research Network for NASH.19 Among the goals of the network were: (1) to form a database for long-term natural history observations of patients with NAFLD; (2) to collect clinical samples for metabolic, immunological, molecular, and genetic studies of NAFLD focusing on defining the etiology of this disease; and (3) to evaluate promising therapies for NASH in both adult and pediatric populations. One of the charges to the NASH Clinical Research Network was to develop and validate a system of histological evaluation that would encompass the spectrum of NAFLD, that could be applied to pediatric NAFLD, and that would allow for assessment of changes with therapy. This report describes the multi-center effort to accomplish this task. Abbreviations NAFLD, nonalcoholic fatty liver disease; NASH, nonalcoholic steatohepatitis; NIDDK, National Institute of Diabetes & Digestive & Kidney Diseases; NIH, National Institutes of Health; H&E, hematoxylin and eosin; NAS, NAFLD activity score. Materials and Methods The Pathology Subcommittee, composed of pathologists from each Clinical Research Network Clinical Center (total of eight), a pathologist from the National Institutes of Health (NIH), two principal investigators from Clinical Centers, the NIDDK project scientist, and the principal investigator from the Data Coordinating Center, met to devise a scoring system and to discuss plans for case review. A study set was assembled from cases contributed by each center; the cases provided were drawn from locally evaluated patients who underwent biopsies to “rule out” NAFLD or NASH. Cases were specifically included to cover the range of possible diagnoses: (1) diagnostic of steatohepatitis, (2) borderline or possible steatohepatitis, and (3) not diagnostic of steatohepatitis. Each case had hematoxylin and eosin (H&E) and Masson trichrome stains submitted. The study set cases were stripped of all clinical information except for the designation as “adult” or “pediatric,” and the pathologists were blinded to even this piece of information. The Institute Review Boards at each Clinical Center, the Data Coordinating Center, and the Office of Human Subjects Research of the NIH approved the research plan. Scoring System Definition. The Committee reviewed the study set cases as a group and then proposed an evaluation method for each of the recognized features of NAFLD. The Committee agreed that only H&E and Masson's trichrome stains should be necessary to perform the evaluation. The histological features were grouped into five broad categories: steatosis, inflammation, hepatocellular injury, fibrosis, and miscellaneous features. The system of evaluation is detailed in Table 1, and examples of ballooning, microvesicular steatosis, and megamitochondria are shown in Figs. 1 and 2. Table 1. NASH Clinical Research Network Scoring System Definitions and Scores in Study Set Item Definition Score/Code % Responses in Category for Study Set Cases Adult (n = 576) Pediatric (n = 162) Steatosis Grade Low- to medium-power evaluation of parenchymal involvement by steatosis <5% 0 10% 3% 5%-33% 1 34% 29% >33%-66% 2 31% 31% >66% 3 26% 36% Location Predominant distribution pattern Zone 3 0 31% 14% Zone 1 1 1% 12% Azonal 2 37% 22% Panacinar 3 31% 52% Microvesicular steatosis** Ballooning classification: few indicates rare but definite ballooned hepatocytes as well as case that are diagnostically borderline; examples are shown in Fig. 1. Examples of patches of microvesicular steatosis and megamitochondria are shown in Fig. 2. Contiguous patches Not present 0 90% 96% Present 1 10% 4% Fibrosis Stage None 0 40% 29% Perisinusoidal or periportal 1 Mild, zone 3, perisinusoidal 1A 15% 4% Moderate, zone 3, perisinusoidal 1B 6% 5% Portal/periportal 1C 6% 27% Perisinusoidal and portal/periportal 2 12% 10% Bridging fibrosis 3 15% 17% Cirrhosis 4 6% 9% Inflammation Lobular inflammation Overall assessment of all inflammatory foci No foci 0 14% 15% <2 foci per 200× field 1 53% 60% 2-4 foci per 200× field 2 27% 22% >4 foci per 200× field 3 6% 3% Microgranulomas Small aggregates of macrophages Absent 0 57% 53% Present 1 43% 47% Large lipogranulomas Usually in portal areas or adjacent to central veins Absent 0 86% 99% Present 1 14% 1% Portal inflammation Assessed from low magnification None to minimal 0 67% 67% Greater than minimal 1 33% 33% Liver cell injury Ballooning** Ballooning classification: few indicates rare but definite ballooned hepatocytes as well as case that are diagnostically borderline; examples are shown in Fig. 1. Examples of patches of microvesicular steatosis and megamitochondria are shown in Fig. 2. None 0 33% 49% Few balloon cells 1 38% 36% Many cells/prominent ballooning 2 29% 15% Acidophil bodies None to rare†† The “None to rare” category is meant to alleviate the need for time-consuming searches for rare examples or deliberation over diagnostically borderline changes. If the feature is identified after a reasonable search, it should be coded as “many.” 0 89% 90% Many 1 11% 10% Pigmented macrophages None to rare†† The “None to rare” category is meant to alleviate the need for time-consuming searches for rare examples or deliberation over diagnostically borderline changes. If the feature is identified after a reasonable search, it should be coded as “many.” 0 87% 82% Many 1 13% 18% Megamitochondria** Ballooning classification: few indicates rare but definite ballooned hepatocytes as well as case that are diagnostically borderline; examples are shown in Fig. 1. Examples of patches of microvesicular steatosis and megamitochondria are shown in Fig. 2. None to rare†† The “None to rare” category is meant to alleviate the need for time-consuming searches for rare examples or deliberation over diagnostically borderline changes. If the feature is identified after a reasonable search, it should be coded as “many.” 0 86% 95% Many 1 14% 5% Other findings Mallory's hyaline Visible on routine stains None to rare†† The “None to rare” category is meant to alleviate the need for time-consuming searches for rare examples or deliberation over diagnostically borderline changes. If the feature is identified after a reasonable search, it should be coded as “many.” 0 80% 94% Many 1 20% 6% Glycogenated nuclei Contiguous patches None to rare†† The “None to rare” category is meant to alleviate the need for time-consuming searches for rare examples or deliberation over diagnostically borderline changes. If the feature is identified after a reasonable search, it should be coded as “many.” 0 57% 71% Many 1 43% 29% Diagnostic classification‡‡ Diagnostic classification was not available on 2 sets of adult biopsy observations, reducing the total of such observations to 512. Not steatohepatitis 0 31% 32% Possible/borderline 1 26% 33% Definite steatohepatitis 2 43% 35% * Ballooning classification: few indicates rare but definite ballooned hepatocytes as well as case that are diagnostically borderline; examples are shown in Fig. 1. Examples of patches of microvesicular steatosis and megamitochondria are shown in Fig. 2. † The “None to rare” category is meant to alleviate the need for time-consuming searches for rare examples or deliberation over diagnostically borderline changes. If the feature is identified after a reasonable search, it should be coded as “many.” ‡ Diagnostic classification was not available on 2 sets of adult biopsy observations, reducing the total of such observations to 512. Figure 1Open in figure viewerPowerPoint Scoring of ballooning injury. (A) There is mild steatosis but no ballooning degeneration. All pathologists scored this case as “0” for ballooning injury. (B) In no study set case was there absolute concordance among the nine pathologists for a ballooning score of 1. During the second round of reviews, this case was scored as 1+ ballooning injury by 8 of the 9 pathologists. This field shows several scattered balloon cells that are not much larger than the surrounding steatotic hepatocytes but with the same cytoplasmic characteristics as more obvious balloon cells, such as those seen in panel C. (C) This field is taken from a case scored as 2+ ballooning injury by all pathologists. There is a contiguous patch of hepatocytes showing prominent ballooning injury, sharply contrasted against the more normal hepatocytes in the field. (All photomicrographs: Hematoxylin and eosin; original magnification ×600). Figure 2Open in figure viewerPowerPoint Microvesicular steatosis and megamitochondria. (A) Contiguous patch of microvesicular steatosis from case of steatohepatitis. This case would be scored positively for this feature. (B) Photomicrograph of cells with easily identified megamitochondria (arrows). This case would be scored positively for this feature, although it is not necessary to see so many positive cells in a single field. (All photomicrographs: Hematoxylin and eosin; original magnification ×400). For the validation study, the pathologists were additionally asked to provide an overall diagnosis for each case as “NASH,” “borderline,” or “not NASH.” The biopsy specimens were made anonymous and randomized by an NIH employee not involved in the study. The adult cases were reviewed by each pathologist at his or her home institutions twice and at separate times; the pediatric cases were circulated once. Statistical Analyses. Pediatric and adult cases were analyzed separately. Weighted kappa scores were used to measure the degree of inter-rater and intra-rater agreement between and within multiple pathologists. Weighted kappa scores were estimated by using intra-class correlation coefficients derived from components of variance models.20 Chi-square tests were used to compare univariate associations of histological features with diagnosis of steatohepatitis. Multivariate associations with diagnosis of steatohepatitis were assessed by using multiple logistic regression models using generalized estimating equations with robust variance estimation and exchangeable correlation to account for correlations due to multiple readings within and between raters.21 Adjusted percentage distributions for each histological feature, holding other features constant and retaining the univariate marginal distributions, were calculated from the logistic regression model coefficients for comparison with the unadjusted univariate distributions of features. All statistical analyses were carried out by the Data Coordinating Center (M. Van N.) using SAS 8.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC) and Stata 7.0 (Stata Corp., College Station, TX) Results A total of 50 anonymous liver biopsy specimens formed the validation study set. The study set was chosen to sample the range of pathological conditions seen in pediatric and adult NAFLD. The 32 cases from adults were each read twice by the nine pathologists, for a total of 576 sets of observations; the 18 pediatric cases were each read once, for a total of 162 sets of observations. Each possible score was used at least once during the course of the validation. The distribution of recorded scores is shown in Table 1. Analysis of agreement on features in the adult cases showed reasonable agreement on the scores for the major scoring categories of steatosis grade, fibrosis, ballooning injury, and Mallory's hyaline, with weighted kappa values for the adult study set of 0.5 and above (Table 2). Agreement was not as strong for the inflammatory changes or for steatosis location; both lobular and portal inflammation had interrater kappa values of 0.45. The interrater agreement on the diagnosis of steatohepatitis was 0.61. There was absolute agreement on the diagnosis between the nine pathologists on six cases and agreement among eight of the nine on a further five cases. The intra-rater agreement was higher in all categories than the interrater agreement. Table 2. Inter- and Intra-rater Variability Item Agreement (Kappa Score) Intra-rater Interrater Adult Cases (32 cases, 9 raters) Adult Cases (32 cases, 9 raters) Pediatric Cases (18 cases, 9 raters) Steatosis, grade 0.83 0.79 0.64 Steatosis, location 0.39 0.31 0.39 Microvesicular steatosis 0.37 0.34 0.02 Fibrosis 0.85 0.84 0.62 Lobular inflammation 0.60 0.45 0.28 Microgranulomas 0.40 0.18 0.15 Lipogranulomas 0.38 0.26 0.00 Portal inflammation 0.55 0.45 0.42 Ballooning 0.66 0.56 0.22 Acidophil bodies 0.28 0.19 0.27 Pigmented macrophages 0.38 0.15 0.06 Megamitochondria 0.28 0.16 −0.03 Mallory's hyaline 0.64 0.58 0.69 Glycogenated nuclei 0.66 0.58 0.32 Diagnostic classification 0.66 0.61 0.32 NOTE. All values represent weighted kappa statistics where appropriate. Feature scoring agreement on the pediatric cases in the study set was not as robust as in the adult study set, with lower weighted kappa scores in all categories except steatosis (0.64). Some of the results were statistically no better than chance (microvesicular steatosis, pigmented macrophages, lipogranulomas and megamitochondria, and glycogenated nuclei); this may be caused in part by the low level of agreement on the presence or absence of the feature as seen in the adult cases and in part by the low frequency of observation of one of the two scores. Many of the pediatric cases appeared to have more zone 1 steatosis, more “periportal only” fibrosis, less ballooning, and rare Mallory's hyaline. In particular, there was disagreement between pathologists on the diagnosis of steatohepatitis when cases had fibrosis and steatosis but little or no ballooning or lobular inflammation. Although it is accepted that steatohepatitis is a pattern of injury composed of several features, it has been difficult to define exact diagnostic criteria that all pathologists agree on to precisely distinguish NAFLD cases with steatohepatitis from those with only steatosis and inflammation.14 Data generated by the NASH Network study on how each pathologist categorized each case along with the assigned feature scores allowed statistical examination of which individual features were useful in discriminating definite steatohepatitis from the other two categories. Both crude and adjusted analyses were performed to address these questions; the results are shown in Table 3. Several features showed significant association with the diagnosis of steatohepatitis on both analyses and for both adults and children, including lobular inflammation, ballooning degeneration, and fibrosis. In the adult cases, the degree of steatosis showed a trend toward significance in the crude analysis but was clearly associated with the diagnosis of NASH in the adjusted analysis. In children, the degree of steatosis above the 5% cutoff was not associated with the diagnosis of NASH in either analysis. Table 3. Logistic Regression Analysis of Features of NAFLD With Respect to the Diagnosis of NASH Histologic Feature of NAFLD Category Percent With Diagnosis of NASH Adult (n = 512 Readings From 32 Biopsies) Pediatric (n = 162 Readings From 18 Biopsies) No Adjustment Adjusted** Adjusted percent with NASH diagnosis calculated from a logistic regression model for correlated data with NASH diagnosis as the outcome and indicator variables for each histological feature. Marginal totals for adjusted percentages were fixed to equal the unadjusted marginal totals, and odds ratios from the adjusted percentages equal those from the logistic regression model. No Adjustment Adjusted** Adjusted percent with NASH diagnosis calculated from a logistic regression model for correlated data with NASH diagnosis as the outcome and indicator variables for each histological feature. Marginal totals for adjusted percentages were fixed to equal the unadjusted marginal totals, and odds ratios from the adjusted percentages equal those from the logistic regression model. Overall diagnosis of NASH (outcome) 43.1% 43.1% 34.6% 34.6% Steatosis Grade <5% 12.5% 5.8% †† Combined 5 observations in the <5% category with 5%-33% category because there were no events in the <5% category. †† Combined 5 observations in the <5% category with 5%-33% category because there were no events in the <5% category. 5%-33% 35.2% 37.3% 21.3% 35.2% >33%-66% 52.8% 46.2% 45.1% 32.9% >66% 51.8% 59.2% 39.0% 35.5% P value‡‡ P values were derived from comparisons of percentages with diagnosis of NASH across categories of each histological feature and were calculated from chi-square tests (unadjusted percentages) or from Wald's tests from the logistic regression model (adjusted percentages). .08 .009 .11 .98 Location Zone 3 45.7% 49.2% 27.3% 16.7% Zone 1 25.0% 20.8% 5.0% 18.5% Azonal 31.6% 36.6% 38.9% 28.5% Panacinar 54.6% 45.6% 41.7% 45.7% P value .01 .61 .17 .46 Microvesicular steatosis Absent 43.2% 44.8% 35.3% 35.3% Present 41.9% 24.6% 16.7% 15.5% P value .60 .28 .44 .39 Fibrosis stage None 10.1% 16.3% 14.9% 13.2% Mild, zone 3 53.3% 61.4% 66.7% 71.6% Moderate, zone 3 93.3% 97.7% 87.5% 99.1% Portal/periportal 11.1% 9.0% 13.6% 16.7% Zone 3 & periportal 76.6% 74.2% 43.8% 48.9% Bridging 83.6% 64.4% 70.4% 72.6% Cirrhosis 54.6% 42.1% 42.9% 20.1% P value <.0001 <.0001 <.0001 .0001 Inflammation Lobular inflammation No foci 1.2% 1.1% 12.0% 4.7% <2 foci 36.0% 38.0% 36.1% 32.5% 2-4 foci 76.6% 73.3% 42.9% 53.2% >4 foci 87.5% 82.1% 60.0% 93.7% P value <.0001 <.0001 .02 .01 Microgranulomas Absent 42.6% 36.1% 39.5% 38.2% Present 43.9% 51.8% 29.0% 30.4% P

Background & Aims

 There is a need for a reliable and inexpensive noninvasive marker of hepatic fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). We compared the performance of the FIB4 index (based on age, aspartate aminotransferase [AST] and alanine aminotransferase [ALT] levels, and platelet counts) with 6 other non-invasive markers of fibrosis in patients with NAFLD. 

Methods

 Using a nation-wide database of 541 adults with NAFLD, jackknife-validated areas under receiver operating characteristic curves (AUROC) of FIB4 and 7 other markers were compared. The sensitivity at 90% specificity, 80% positive predictive value, and 90% negative predictive values were determined along with cutoffs for advanced fibrosis. 

Results

 The median FIB4 score was 1.11 (interquartile range=0.74–1.67). The jackknife-validated AUROC for FIB4 was 0.802 (95% confidence interval [CI], 0.758–0.847), which was higher than that of the NAFLD fibrosis score (0.768; 95% CI, 0.720–0.816; P = .09), Goteburg University Cirrhosis Index (0.743; 95% CI, 0.695–0.791; P < .01), AST:ALT ratio (0.742; 95% CI, 0.690–0.794; P < .015), AST:platelet ratio index (0.730; 95% CI, 0.681–0.779; P < .001), AST:platelet ratio (0.720; 95% CI, 0.669–0.770; P < .001), body mass index, AST:ALT, diabetes (BARD) score (0.70; P < .001), or cirrhosis discriminant score (0.666; 95% CI, 0.614–0.718; P < .001). For a fixed specificity of 90% (FIB4 = 1.93), the sensitivity in identifying advanced fibrosis was only 50% (95% CI, 46–55). A FIB4 ≥ 2.67 had an 80% positive predictive value and a FIB4 index ≤ 1.30 had a 90% negative predictive value. 

Conclusions

 The FIB4 index is superior to 7 other noninvasive markers of fibrosis in patients with NAFLD; however its performance characteristics highlight the need for even better noninvasive markers.

The spectrum of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) includes a nonalcoholic fatty liver (NAFL) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). The specific types and amounts of lipids that accumulate in NAFLD are not fully defined. The free fatty acid (FFA), diacylglycerol (DAG), triacylglycerol (TAG), free cholesterol (FC), cholesterol ester, and phospholipid contents in normal livers were quantified and compared to those of NAFL and NASH, and the distribution of fatty acids within these classes was compared across these groups. Hepatic lipids were quantified by capillary gas chromatography. The mean (nmol/g of tissue) DAG (normal/NAFL/NASH: 1922 versus 4947 versus 3304) and TAG (13,609 versus 128,585 versus 104,036) increased significantly in NAFLD, but FFA remained unaltered (5533 versus 5929 versus 6115). There was a stepwise increase in the mean TAG/DAG ratio from normal livers to NAFL to NASH (7 versus 26 versus 31, P < 0.001). There was also a similar stepwise increment in hepatic FC (7539 versus 10,383 versus 12,863, P < 0.05 for NASH). The total phosphatidylcholine (PC) decreased in both NAFL and NASH. The FC/PC ratio increased progressively (0.34 versus 0.69 versus 0.71, P < 0.008 for both). Although the levels for linoleic acid (18:2n-6) and α-linolenic acid (18:3n-3) remained unaltered, there was a decrease in arachidonic acid (20:4n-6) in FFA, TAG, and PC (P < 0.05 for all) in NASH. Eicosapentanoic acid (20:5n-3) and docosahexanoic acid (22:6n-3) were decreased in TAG in NASH. The n-6:n-3 FFA ratio increased in NASH (P < 0.05). Conclusions: NAFLD is associated with numerous changes in the lipid composition of the liver. The potential implications are discussed. (HEPATOLOGY 2007.)

The expression of microRNA in nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and their role in the genesis of NASH are not known. The aims of this study were to: (1) identify differentially expressed microRNAs in human NASH, (2) tabulate their potential targets, and (3) define the effect of a specific differentially expressed microRNA, miR-122, on its targets and compare these effects with the pattern of expression of these targets in human NASH. The expression of 474 human microRNAs was compared in subjects with the metabolic syndrome and NASH versus controls with normal liver histology. Differentially expressed microRNAs were identified by the muParaflo microRNA microarray assay and validated using quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR). The effects of a specific differentially expressed miRNA (miR-122) on its predicted targets were assessed by silencing and overexpressing miR-122 in vitro. A total of 23 microRNAs were underexpressed or overexpressed. The predicted targets of these microRNAs are known to affect cell proliferation, protein translation, apoptosis, inflammation, oxidative stress, and metabolism. The miR-122 level was significantly decreased in subjects with NASH (63% by real-time PCR, P < 0.00001). Silencing miR-122 led to an initial increase in mRNA levels of these targets (P < 0.05 for all) followed by a decrease by 48 hours. This was accompanied by an increase in protein levels of these targets (P < 0.05 for all). Overexpression of miR-122 led to a significant decrease in protein levels of these targets.NASH is associated with altered hepatic microRNA expression. Underexpression of miR-122 potentially contributes to altered lipid metabolism implicated in the pathogenesis of NASH.

Specific alterations in hepatic lipid composition characterize the spectrum of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), which extends from nonalcoholic fatty liver (NAFL) to nonalcoholic steatohepatitis (NASH). However, the plasma lipidome of NAFLD and whether NASH has a distinct plasma lipidomic signature are unknown. A comprehensive analysis of plasma lipids and eicosanoid metabolites quantified by mass spectrometry was performed in NAFL (n = 25) and NASH (n = 50) subjects and compared with lean normal controls (n = 50). The key findings include significantly increased total plasma monounsaturated fatty acids driven by palmitoleic (16:1 n7) and oleic (18:1 n9) acids content (P < 0.01 for both acids in both NAFL and NASH). The levels of palmitoleic acid, oleic acid, and palmitoleic acid to palmitic acid (16:0) ratio were significantly increased in NAFLD across multiple lipid classes. Linoleic acid (8:2n6) was decreased (P < 0.05), with a concomitant increase in gamma-linolenic (18:3n6) and dihomo gamma-linolenic (20:3n6) acids in both NAFL and NASH (P < 0.001 for most lipid classes). The docosahexanoic acid (22:6 n3) to docosapentenoic acid (22:5n3) ratio was significantly decreased within phosphatidylcholine (PC), and phosphatidylethanolamine (PE) pools, which was most marked in NASH subjects (P < 0.01 for PC and P < 0.001 for PE). The total plasmalogen levels were significantly decreased in NASH compared with controls (P < 0.05). A stepwise increase in lipoxygenase (LOX) metabolites 5(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid (5-HETE), 8-HETE, and 15-HETE characterized progression from normal to NAFL to NASH. The level of 11-HETE, a nonenzymatic oxidation product of arachidonic (20:4) acid, was significantly increased in NASH only.Although increased lipogenesis, desaturases, and LOX activities characterize NAFL and NASH, impaired peroxisomal polyunsaturated fatty acid (PUFA) metabolism and nonenzymatic oxidation is associated with progression to NASH.

Summary

 Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is associated with increased cardiovascular and liver-related mortality. NAFLD is characterized by both triglyceride and free cholesterol (FC) accumulation without a corresponding increment in cholesterol esters. The aim of this study was to evaluate the expression of cholesterol metabolic genes in NAFLD and relate these to disease phenotype. NAFLD was associated with increased SREBP-2 maturation, HMG CoA reductase (HMGCR) expression and decreased phosphorylation of HMGCR. Cholesterol synthesis was increased as measured by the circulating desmosterol:cholesterol ratio. miR-34a, a microRNA increased in NAFLD, inhibited sirtuin-1 with downstream dephosphorylation of AMP kinase and HMGCR. Cholesterol ester hydrolase was increased while ACAT-2 remained unchanged. LDL receptor expression was significantly decreased and similar in NAFLD subjects on or off statins. HMGCR expression was correlated with FC, histologic severity of NAFLD and LDL-cholesterol. These data demonstrate dysregulated cholesterol metabolism in NAFLD which may contribute to disease severity and cardiovascular risks.

The objective of this study was to prospectively define outcomes of cirrhosis due to nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and compare them with those associated with hepatitis C virus (HCV) infection. We compared 152 patients with cirrhosis due to NASH with 150 matched patients with cirrhosis due to HCV. Over 10 years, 29/152 patients with cirrhosis due to NASH died compared with 44/150 patients with HCV (P < .04). This was mainly due to the lower mortality rate in patients with Child class A cirrhosis due to NASH versus HCV (3/74 vs. 15/75; P < .004). There were no significant across-group differences in mortality in patients with Child class B or C cirrhosis. Sepsis was the most common cause of death in both groups; patients with NASH had a higher cardiac mortality (8/152 vs. 1/150; P < .03). Patients with Child class A cirrhosis due to NASH also had a significantly lower risk of decompensation, defined by a 2-point increase in Child-Turcotte-Pugh score (P < .007). Cirrhosis due to NASH was associated with a lower rate of development of ascites (14/101 vs. 40/97 patients at risk; P < .006). NASH also had a significantly lower risk of development of hepatocellular carcinoma (10/149 vs. 25/147 patients at risk; P < .01). In conclusion, compensated cirrhosis due to NASH is associated with a lower mortality rate compared with that due to HCV. It is also associated with a lower rate of development of ascites, hyperbilirubinemia, and hepatocellular carcinoma. However, cardiovascular mortality is greater in patients with NASH. (HEPATOLOGY 2006.)