From Genome to Regulatory Networks For biologists, having a genome in hand is only the beginning—much more investigation is still needed to characterize how the genome is used to help to produce a functional organism (see the Perspective by Blaxter ). In this vein, Gerstein et al. (p. 1775 ) summarize for the Caenorhabditis elegans genome, and The modENCODE Consortium (p. 1787 ) summarize for the Drosophila melanogaster genome, full transcriptome analyses over developmental stages, genome-wide identification of transcription factor binding sites, and high-resolution maps of chromatin organization. Both studies identified regions of the nematode and fly genomes that show highly occupied targets (or HOT) regions where DNA was bound by more than 15 of the transcription factors analyzed and the expression of related genes were characterized. Overall, the studies provide insights into the organization, structure, and function of the two genomes and provide basic information needed to guide and correlate both focused and genome-wide studies.

Abstract Purpose: The genetic differences between human papilloma virus (HPV)–positive and –negative head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) remain largely unknown. To identify differential biology and novel therapeutic targets for both entities, we determined mutations and copy-number aberrations in a large cohort of locoregionally advanced HNSCC. Experimental Design: We performed massively parallel sequencing of 617 cancer-associated genes in 120 matched tumor/normal samples (42.5% HPV-positive). Mutations and copy-number aberrations were determined and results validated with a secondary method. Results: The overall mutational burden in HPV-negative and HPV-positive HNSCC was similar with an average of 15.2 versus 14.4 somatic exonic mutations in the targeted cancer-associated genes. HPV-negative tumors showed a mutational spectrum concordant with published lung squamous cell carcinoma analyses with enrichment for mutations in TP53, CDKN2A, MLL2, CUL3, NSD1, PIK3CA, and NOTCH genes. HPV-positive tumors showed unique mutations in DDX3X, FGFR2/3 and aberrations in PIK3CA, KRAS, MLL2/3, and NOTCH1 were enriched in HPV-positive tumors. Currently targetable genomic alterations were identified in FGFR1, DDR2, EGFR, FGFR2/3, EPHA2, and PIK3CA. EGFR, CCND1, and FGFR1 amplifications occurred in HPV-negative tumors, whereas 17.6% of HPV-positive tumors harbored mutations in fibroblast growth factor receptor genes (FGFR2/3), including six recurrent FGFR3 S249C mutations. HPV-positive tumors showed a 5.8% incidence of KRAS mutations, and DNA-repair gene aberrations, including 7.8% BRCA1/2 mutations, were identified. Conclusions: The mutational makeup of HPV-positive and HPV-negative HNSCC differs significantly, including targetable genes. HNSCC harbors multiple therapeutically important genetic aberrations, including frequent aberrations in the FGFR and PI3K pathway genes. Clin Cancer Res; 21(3); 632–41. ©2014 AACR. See related commentary by Krigsfeld and Chung, p. 495

Abstract Purpose: Current classification of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) based on anatomic site and stage fails to capture biologic heterogeneity or adequately inform treatment. Experimental Design: Here, we use gene expression-based consensus clustering, copy number profiling, and human papillomavirus (HPV) status on a clinically homogenous cohort of 134 locoregionally advanced HNSCCs with 44% HPV+ tumors together with additional cohorts, which in total comprise 938 tumors, to identify HNSCC subtypes and discover several subtype-specific, translationally relevant characteristics. Results: We identified five subtypes of HNSCC, including two biologically distinct HPV subtypes. One HPV+ and one HPV− subtype show a prominent immune and mesenchymal phenotype. Prominent tumor infiltration with CD8+ lymphocytes characterizes this inflamed/mesenchymal subtype, independent of HPV status. Compared with other subtypes, the two HPV subtypes show low expression and no copy number events for EGFR/HER ligands. In contrast, the basal subtype is uniquely characterized by a prominent EGFR/HER signaling phenotype, negative HPV-status, as well as strong hypoxic differentiation not seen in other subtypes. Conclusion: Our five-subtype classification provides a comprehensive overview of HPV+ as well as HPV− HNSCC biology with significant translational implications for biomarker development and personalized care for patients with HNSCC. Clin Cancer Res; 21(4); 870–81. ©2014 AACR.

Abstract Expression quantitative trait locus (eQTL) mapping provides a powerful means to identify functional variants influencing gene expression and disease pathogenesis. We report the identification of cis-eQTLs from 7,051 post-mortem samples representing 44 tissues and 449 individuals as part of the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project. We find a cis-eQTL for 88% of all annotated protein-coding genes, with one-third having multiple independent effects. We identify numerous tissue-specific cis-eQTLs, highlighting the unique functional impact of regulatory variation in diverse tissues. By integrating large-scale functional genomics data and state-of-the-art fine-mapping algorithms, we identify multiple features predictive of tissue-specific and shared regulatory effects. We improve estimates of cis-eQTL sharing and effect sizes using allele specific expression across tissues. Finally, we demonstrate the utility of this large compendium of cis-eQTLs for understanding the tissue-specific etiology of complex traits, including coronary artery disease. The GTEx project provides an exceptional resource that has improved our understanding of gene regulation across tissues and the role of regulatory variation in human genetic diseases.

ABSTRACT Motivation The majority of the human genome is composed of non-coding regions containing regulatory elements such as enhancers, which are crucial for controlling gene expression. Many variants associated with complex traits are in these regions, and may disrupt gene regulatory sequences. Consequently, it is important to not only identify true enhancers but also to test if a variant within an enhancer affects gene regulation. Recently, allele-specific analysis in high-throughput reporter assays, such as massively parallel reporter assays (MPRA), have been used to functionally validate non-coding variants. However, we are still missing high-quality and robust data analysis tools for these datasets. Results We have further developed our method for allele-specific analysis QuASAR (quantitative allele-specific analysis of reads) to analyze allele-specific signals in barcoded read counts data from MPRA. Using this approach, we can take into account the uncertainty on the original plasmid proportions, over-dispersion, and sequencing errors. The provided allelic skew estimate and its standard error also simplifies meta-analysis of replicate experiments. Additionally, we show that a beta-binomial distribution better models the variability present in the allelic imbalance of these synthetic reporters and results in a test that is statistically well calibrated under the null. Applying this approach to the MPRA data by Tewhey et al. (2016), we found 602 SNPs with significant (FDR 10%) allele-specific regulatory function in LCLs. We also show that we can combine MPRA with QuASAR estimates to validate existing experimental and computational annotations of regulatory variants. Our study shows that with appropriate data analysis tools, we can improve the power to detect allelic effects in high throughput reporter assays. Availability http://github.com/piquelab/QuASAR/tree/master/mpra Contact fluca@wayne.edu ; rpique@wayne.edu

Abstract Background Mapping of quantitative trait loci (QTL) associated with molecular phenotypes is a powerful approach for identifying the genes and molecular mechanisms underlying human traits and diseases. How the genetic architecture of molecular traits varies across human populations, however, has been less explored. To better understand the genetics of gene regulation in East Africans, we perform expression and splicing QTL mapping in whole blood from a cohort of 162 diverse Africans from Ethiopia and Tanzania. We assess replication of these QTLs in cohorts of predominantly European ancestry and identify candidate genes under selection in human populations. Results We find the gene regulatory architecture of African and non-African populations is broadly shared, though there is a considerable amount of variation at individual loci across populations. Comparing our analyses to an equivalently sized cohort of European Americans, we find that QTL mapping in Africans improves the detection of expression QTLs and fine mapping of causal variation. Integrating our QTL scans with signatures of selection, we find several genes related to immunity and metabolism that are highly differentiated between Africans and non-Africans, as well as a gene associated with pigmentation, TMEM216 , with evidence of population-specific selection in Nilo-Saharan speaking pastoralists. Conclusion Extending QTL-mapping studies beyond groups of European ancestry, particularly to diverse indigenous populations, is vital for a complete understanding of the genetic architecture of human traits and can reveal novel functional variation underlying human traits and disease.

Abstract INTRODUCTION The difference in APOEε4 risk for Alzheimer disease (AD) between different populations is associated with APOEε4 local ancestry (LA). We examined LA SNPs with significant frequency differences between African and European/Japanese APOEε4 haplotypes for areas of differential regulation. METHODS We performed two enhancer Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) approaches, supplemented with single fragment reporter assays. We utilized Capture C analyses to support interactions with the APOE promoter. RESULTS The TOMM40 intron 2 and 3 region showed increased enhancer activity in the European/Japanese versus African LA haplotypes in astrocytes and microglia. This region overlaps with APOE promoter interactions as assessed by Capture C analysis. Single variant analyses pinpoints rs2075650/rs157581, and rs59007384 as functionally different on these haplotypes. DISCUSSION Both differential regulatory function and Capture C data support an intronic region in TOMM40 as contributing to the differential APOE expression between African and European/Japanese LA.

The Genotype-Tissue Expression (GTEx) project was established to characterize genetic effects on the transcriptome across human tissues, and to link these regulatory mechanisms to trait and disease associations. Here, we present analyses of the v8 data, based on 17,382 RNA-sequencing samples from 54 tissues of 948 post-mortem donors. We comprehensively characterize genetic associations for gene expression and splicing in cis and trans, showing that regulatory associations are found for almost all genes, and describe the underlying molecular mechanisms and their contribution to allelic heterogeneity and pleiotropy of complex traits. Leveraging the large diversity of tissues, we provide insights into the tissue-specificity of genetic effects, and show that cell type composition is a key factor in understanding gene regulatory mechanisms in human tissues.

The resources generated by the GTEx consortium offer unprecedented opportunities to advance our understanding of the biology of human traits and diseases. Here, we present an in-depth examination of the phenotypic consequences of transcriptome regulation and a blueprint for the functional interpretation of genetic loci discovered by Genome-Wide Association Studies (GWAS). Across a broad set of complex traits and diseases, we find widespread dose-dependent effects of RNA expression and splicing, with higher impact on molecular phenotypes translating into higher impact downstream. Using colocalization and association approaches that take into account the observed allelic heterogeneity, we propose potential target genes for 47% (2,519 out of 5,385) of the GWAS loci examined. Our results demonstrate the translational relevance of the GTEx resources and highlight the need to increase their resolution and breadth to further our understanding of the genotype-phenotype link.

Background: Genome-wide association studies have identified 150+ loci associated with lipid levels. However, the genetic mechanisms underlying most of these loci are not well-understood. Recent work indicates that changes in the abundance of alternatively spliced transcripts contributes to complex trait variation. Consequently, identifying genetic loci that associate with alternative splicing in disease-relevant cell types and determining the degree to which these loci are informative for lipid biology is of broad interest. Methods and Results: We analyze gene splicing in 83 sample-matched induced pluripotent stem cell (iPSC) and hepatocyte-like cell (HLC) lines (n=166), as well as in an independent collection of primary liver tissues (n=96). We observe that transcript splicing is highly cell-type specific, and the genes that are differentially spliced between iPSCs and HLCs are enriched for metabolism pathway annotations. We identify 1,381 HLC splicing quantitative trait loci (sQTLs) and 1,462 iPSC sQTLs and find that sQTLs are often shared across cell types. To evaluate the contribution of sQTLs to variation in lipid levels, we conduct colocalization analysis using lipid genome-wide association data. We identify 19 lipid-associated loci that colocalize either with an HLC expression quantitative trait locus (eQTL) or sQTL. Only one locus colocalizes with both an sQTL and eQTL, indicating that sQTLs contribute information about GWAS loci that cannot be obtained by analysis of steady-state gene expression alone. Conclusions: These results provide an important foundation for future efforts that use iPSC and iPSC-derived cells to evaluate genetic mechanisms influencing both cardiovascular disease risk and complex traits in general.