Abstract Characterizing the transcriptome of individual cells is fundamental to understanding complex biological systems. We describe a droplet-based system that enables 3′ mRNA counting of tens of thousands of single cells per sample. Cell encapsulation, of up to 8 samples at a time, takes place in ∼6 min, with ∼50% cell capture efficiency. To demonstrate the system’s technical performance, we collected transcriptome data from ∼250k single cells across 29 samples. We validated the sensitivity of the system and its ability to detect rare populations using cell lines and synthetic RNAs. We profiled 68k peripheral blood mononuclear cells to demonstrate the system’s ability to characterize large immune populations. Finally, we used sequence variation in the transcriptome data to determine host and donor chimerism at single-cell resolution from bone marrow mononuclear cells isolated from transplant patients.

A microfluidics approach that links short sequence reads enables haplotype construction and complex variation identification from tiny amounts of input DNA. Haplotyping of human chromosomes is a prerequisite for cataloguing the full repertoire of genetic variation. We present a microfluidics-based, linked-read sequencing technology that can phase and haplotype germline and cancer genomes using nanograms of input DNA. This high-throughput platform prepares barcoded libraries for short-read sequencing and computationally reconstructs long-range haplotype and structural variant information. We generate haplotype blocks in a nuclear trio that are concordant with expected inheritance patterns and phase a set of structural variants. We also resolve the structure of the EML4-ALK gene fusion in the NCI-H2228 cancer cell line using phased exome sequencing. Finally, we assign genetic aberrations to specific megabase-scale haplotypes generated from whole-genome sequencing of a primary colorectal adenocarcinoma. This approach resolves haplotype information using up to 100 times less genomic DNA than some methods and enables the accurate detection of structural variants.

Recent work has shown that the murine BRCA2 tumor suppressor protein interacts with the murine RAD51 protein. This interaction suggests that BRCA2 participates in DNA repair. Residues 3196–3232 of the murine BRCA2 protein were shown to be involved in this interaction. Here, we report the detailed mapping of additional domains that are involved in interactions between the human homologs of these two proteins. Through yeast two-hybrid and biochemical assays, we demonstrate that the RAD51 protein interacts specifically with the eight evolutionarily conserved BRC motifs encoded in exon 11 of brca2 and with a similar motif found in a Caenorhabditis elegans hypothetical protein. Deletion analysis demonstrates that residues 98–339 of human RAD51 interact with the 59-residue minimal region that is conserved in all BRC motifs. These data suggest that the BRC repeats function to bind RAD51. Recent work has shown that the murine BRCA2 tumor suppressor protein interacts with the murine RAD51 protein. This interaction suggests that BRCA2 participates in DNA repair. Residues 3196–3232 of the murine BRCA2 protein were shown to be involved in this interaction. Here, we report the detailed mapping of additional domains that are involved in interactions between the human homologs of these two proteins. Through yeast two-hybrid and biochemical assays, we demonstrate that the RAD51 protein interacts specifically with the eight evolutionarily conserved BRC motifs encoded in exon 11 of brca2 and with a similar motif found in a Caenorhabditis elegans hypothetical protein. Deletion analysis demonstrates that residues 98–339 of human RAD51 interact with the 59-residue minimal region that is conserved in all BRC motifs. These data suggest that the BRC repeats function to bind RAD51. Germline mutations in the brca1 and brca2tumor suppressor genes account for approximately 5–10% of all breast cancer cases (1Miki Y. Swensen J. Shattuck-Eidens D. Futreal P.A. Harshman K. Tavtigian S. Liu Q. Cochran C. Bennett L.M. Ding W. Bell R. Rosenthal J. Hussey C. Tran T. McClure M. Frye C. Hattier T. Phelps R. Haugen-Strano A. Katcher H. Yakumo K. Gholami Z. Shaffer D. Stone S. Bayer S. Wray C. Bogden R. Dayanath P. Ward J. Tonin P. Narod S. Bristow P. Norris F. Helvering L. Morrison P. Rosteck P. Lai M. Barrett J.C. Lewis C. Neuhausen S. Cannon-Albright L. Goldgar D. Wiseman R. Kamb A. Skolnick M. Science. 1994; 266: 66-71Crossref PubMed Scopus (5389) Google Scholar, 2Wooster R. Bignell G. Lancaster J. Swift S. Seal S. Mangion J. Collins N. Gregory S. Gumbs C. Micklem G. Barfoot R. Hanmoudi R. Patel R. Rice C. Biggs P. Hashim Y. Smith A. Connor F. Arason A. Gudmundsson J. Ficenec D. Kelsell D. Ford D. Tonin P. Bishop D.T. Spurr N.K. Ponder B.A.J. Eeles R. Peto J. Devilee P. Cornelisse C. Lynch H. Narod S. Lenoir G. Egilsson V. Barkadottir R. Easton D.F. Bentley D.R. Futreal P.A. Ashworth A. Stratton M.R. Nature. 1995; 378: 789-792Crossref PubMed Scopus (3002) Google Scholar, 3Tavtigian S.V. Simard J. Rommens J. Couch F. Shattuck-Eidens D. Neuhausen S. Merajver S. Thorlacius S. Offit K. Soppa-Lyonnet D. Belanger C. Bell R. Berry S. Bogden R. Chen Q. Davis T. Dumont M. Frye C. Hattier T. Jammulapati S. Janecki T. Jiang P. Kehrer R. Leblanc J.-F. Mitchell J.T. McArthur-Morrison J. Nguyen K. Peng Y. Samson C. Schroeder M. Snyder S.C. Steele L. Stringfellow M. Stroup C. Swedlund B. Swensen J. Teng D. Thomas A. Tran T. Tran T. Tranchant M. Weaver-Feldhaus J. Wong A.K.C. Shizuya H. Eyfjord J.E. Cannon-Albright L. Labrie F. Skolnick M.H. Weber B. Kamb A. Goldgar D.E. Nat. Genet. 1996; 12: 333-337Crossref PubMed Scopus (736) Google Scholar, 4Easton D.F. Bishop D.T. Ford D. Crockford G.P. the Breast Cancer Linkage Consortium Am. J. Hum. Genet. 1993; 52: 678-701PubMed Google Scholar). In addition, deleterious alleles of brca1 or brca2 are responsible for almost all familial ovarian cancer, and deleterious alleles of brca2are involved in hereditary male breast cancer (1Miki Y. Swensen J. Shattuck-Eidens D. Futreal P.A. Harshman K. Tavtigian S. Liu Q. Cochran C. Bennett L.M. Ding W. Bell R. Rosenthal J. Hussey C. Tran T. McClure M. Frye C. Hattier T. Phelps R. Haugen-Strano A. Katcher H. Yakumo K. Gholami Z. Shaffer D. Stone S. Bayer S. Wray C. Bogden R. Dayanath P. Ward J. Tonin P. Narod S. Bristow P. Norris F. Helvering L. Morrison P. Rosteck P. Lai M. Barrett J.C. Lewis C. Neuhausen S. Cannon-Albright L. Goldgar D. Wiseman R. Kamb A. Skolnick M. Science. 1994; 266: 66-71Crossref PubMed Scopus (5389) Google Scholar, 2Wooster R. Bignell G. Lancaster J. Swift S. Seal S. Mangion J. Collins N. Gregory S. Gumbs C. Micklem G. Barfoot R. Hanmoudi R. Patel R. Rice C. Biggs P. Hashim Y. Smith A. Connor F. Arason A. Gudmundsson J. Ficenec D. Kelsell D. Ford D. Tonin P. Bishop D.T. Spurr N.K. Ponder B.A.J. Eeles R. Peto J. Devilee P. Cornelisse C. Lynch H. Narod S. Lenoir G. Egilsson V. Barkadottir R. Easton D.F. Bentley D.R. Futreal P.A. Ashworth A. Stratton M.R. Nature. 1995; 378: 789-792Crossref PubMed Scopus (3002) Google Scholar, 3Tavtigian S.V. Simard J. Rommens J. Couch F. Shattuck-Eidens D. Neuhausen S. Merajver S. Thorlacius S. Offit K. Soppa-Lyonnet D. Belanger C. Bell R. Berry S. Bogden R. Chen Q. Davis T. Dumont M. Frye C. Hattier T. Jammulapati S. Janecki T. Jiang P. Kehrer R. Leblanc J.-F. Mitchell J.T. McArthur-Morrison J. Nguyen K. Peng Y. Samson C. Schroeder M. Snyder S.C. Steele L. Stringfellow M. Stroup C. Swedlund B. Swensen J. Teng D. Thomas A. Tran T. Tran T. Tranchant M. Weaver-Feldhaus J. Wong A.K.C. Shizuya H. Eyfjord J.E. Cannon-Albright L. Labrie F. Skolnick M.H. Weber B. Kamb A. Goldgar D.E. Nat. Genet. 1996; 12: 333-337Crossref PubMed Scopus (736) Google Scholar, 4Easton D.F. Bishop D.T. Ford D. Crockford G.P. the Breast Cancer Linkage Consortium Am. J. Hum. Genet. 1993; 52: 678-701PubMed Google Scholar). Currently the mechanism of action of these two genes remains largely undefined. The brca1 and brca2 genes encode large proteins, 1863 and 3418 amino acids, respectively (1Miki Y. Swensen J. Shattuck-Eidens D. Futreal P.A. Harshman K. Tavtigian S. Liu Q. Cochran C. Bennett L.M. Ding W. Bell R. Rosenthal J. Hussey C. Tran T. McClure M. Frye C. Hattier T. Phelps R. Haugen-Strano A. Katcher H. Yakumo K. Gholami Z. Shaffer D. Stone S. Bayer S. Wray C. Bogden R. Dayanath P. Ward J. Tonin P. Narod S. Bristow P. Norris F. Helvering L. Morrison P. Rosteck P. Lai M. Barrett J.C. Lewis C. Neuhausen S. Cannon-Albright L. Goldgar D. Wiseman R. Kamb A. Skolnick M. Science. 1994; 266: 66-71Crossref PubMed Scopus (5389) Google Scholar, 3Tavtigian S.V. Simard J. Rommens J. Couch F. Shattuck-Eidens D. Neuhausen S. Merajver S. Thorlacius S. Offit K. Soppa-Lyonnet D. Belanger C. Bell R. Berry S. Bogden R. Chen Q. Davis T. Dumont M. Frye C. Hattier T. Jammulapati S. Janecki T. Jiang P. Kehrer R. Leblanc J.-F. Mitchell J.T. McArthur-Morrison J. Nguyen K. Peng Y. Samson C. Schroeder M. Snyder S.C. Steele L. Stringfellow M. Stroup C. Swedlund B. Swensen J. Teng D. Thomas A. Tran T. Tran T. Tranchant M. Weaver-Feldhaus J. Wong A.K.C. Shizuya H. Eyfjord J.E. Cannon-Albright L. Labrie F. Skolnick M.H. Weber B. Kamb A. Goldgar D.E. Nat. Genet. 1996; 12: 333-337Crossref PubMed Scopus (736) Google Scholar). A search of the public sequence data bases has revealed little sequence homology to previously identified proteins. However, analysis of the protein sequence has revealed several statistically significant repeated motifs in these genes (5Koonin E.V. Altschul S.F. Bork P. Nat. Genet. 1996; 13: 266-268Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar, 6Bork P. Blomberg N. Nilges M. Nat. Genet. 1996; 13: 22-23Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar). For example, eight internal repeats, known as BRC motifs, are found clustered in exon 11 of the human BRCA2 protein. These motifs are not found in BRCA1 but are conserved in all mammalian BRCA2 proteins that have been sequenced. A similar motif is also present in the hypothetical protein encoded by the Caenorhabditis elegans gene T07E3.5 (5Koonin E.V. Altschul S.F. Bork P. Nat. Genet. 1996; 13: 266-268Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar, 7Bignell G. Micklem G. Stratton M.R. Ashworth A. Wooster R. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 53-58Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar). A number of studies have been conducted in the past year to elucidate the biological roles of the brca1 and brca2genes. Knock-outs of the mouse homologs of these genes indicate that they are essential during development. The ablation of either brca1 or brca2 results in an embryonic lethal phenotype characterized by failure of proliferation during approximately days 6–8 of gestation (8Hakem R. de la Pompa J.L. Sirard C. Mo R. Woo M. Hakem A. Wakham A. Potter J. Reitmar A. Billia F. Firpo E. Hui C.C. Roberts J. Rossant J. Mak T.W. Cell. 1996; 85: 1009-1023Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (584) Google Scholar, 9Sharan S.K. Morimatsu M. Albrecht U. Lim D.-S. Regel E. Dinh Sands A. Eichele G. Hasty P. Bradley A. Nature. 1997; 386: 804-810Crossref PubMed Scopus (934) Google Scholar). Levels of RNA expression from brca1 and brca2 are coordinately regulated during proliferation and differentiation in mammary epithelial cells (11Rajan J. Wang M. Marquis S.T. Chodosh L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 13078-13083Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar, 12Rajan J.V. Marquis S.T. Gardner H.P. Chodosh L.A. Dev. Biol. 1997; 184: 385-401Crossref PubMed Scopus (142) Google Scholar). Furthermore, their expression varies at different stages of the cell cycle, with RNA levels peaking at the G1/S boundary (13Vaughn J.P. Cirisano F.D. Huper G. Berchuck A. Futreal PA. Marks J.R. Iglehart J.D. Cancer Res. 1996; 56: 4590-4594PubMed Google Scholar, 14Lane T.F. Deng C.X. Elson A. Kozak C.A. Leder P. Genes Dev. 1995; 9: 2712-2722Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). These findings provide preliminary evidence that these breast cancer genes participate in a common functional pathway. Three independent studies have now established that the RAD51 DNA repair protein is linked to the BRCA1 and BRCA2 pathways (9Sharan S.K. Morimatsu M. Albrecht U. Lim D.-S. Regel E. Dinh Sands A. Eichele G. Hasty P. Bradley A. Nature. 1997; 386: 804-810Crossref PubMed Scopus (934) Google Scholar, 10Mizuta R. LaSalle J.M. Chieng H.-L. Shinohara A. Ogawa H. Copeland N. Jenkins N.A. Lalande M. Alt F.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 6927-6932Crossref PubMed Scopus (218) Google Scholar, 15Scully R. Chen J. Plug A. Xiao Y. Weaver D. Feunteun J. Ashley T. Livingston D.M. Cell. 1997; 88: 265-275Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1337) Google Scholar). Immunoprecipitation experiments reveal that RAD51 forms a complex with BRCA1, and immunofluorescence analysis shows that both proteins are co-localized to the synaptonemal complex of mouse meiotic chromosomes (15Scully R. Chen J. Plug A. Xiao Y. Weaver D. Feunteun J. Ashley T. Livingston D.M. Cell. 1997; 88: 265-275Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1337) Google Scholar). The direct interaction of murine RAD51 with murine BRCA2 has been demonstrated in a yeast two-hybrid assay (9Sharan S.K. Morimatsu M. Albrecht U. Lim D.-S. Regel E. Dinh Sands A. Eichele G. Hasty P. Bradley A. Nature. 1997; 386: 804-810Crossref PubMed Scopus (934) Google Scholar, 10Mizuta R. LaSalle J.M. Chieng H.-L. Shinohara A. Ogawa H. Copeland N. Jenkins N.A. Lalande M. Alt F.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 6927-6932Crossref PubMed Scopus (218) Google Scholar). The loss of interaction of these two proteins probably accounts for the hypersensitivity to γ irradiation that is observed in mouse embryos deficient in BRCA2 (9Sharan S.K. Morimatsu M. Albrecht U. Lim D.-S. Regel E. Dinh Sands A. Eichele G. Hasty P. Bradley A. Nature. 1997; 386: 804-810Crossref PubMed Scopus (934) Google Scholar). rad51, a homolog of the Escherichia coli recA gene, is known to function in recombination and DNA repair (16Shinohara A. Ogawa H. Ogawa T. Cell. 1992; 69: 457-470Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1072) Google Scholar, 17Heyer W.-D. Experientia. 1994; 50: 223-233Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). It is currently unclear how the interaction of RAD51 with either BRCA1 or BRCA2 affects its function. Alteration of normal DNA repair function may lead to genomic instabilities that eventually contribute to tumorigenesis. We have conducted yeast two-hybrid searches using various segments of the human brca2 gene as "baits" and identified a number of interacting proteins, one of which is RAD51. To further understand the structural and functional relationships between human BRCA2 and RAD51, we map the minimal regions of the BRCA2 protein that mediate binding to RAD51. Specifically we show that RAD51 interacts with the eight BRC motifs of the human BRCA2 protein. These sites of interactions are distinct from those that have been previously reported for the murine BRCA2 and RAD51 proteins. Overlapping fragments of BRCA2 cDNA were ligated into the Gal4p DNA-binding domain vector pGBT.C and the Gal4p activation domain vector pGAD.C (18Bartel P. Roecklein J.A. SenGupta D. Fields S. Nat. Genet. 1996; 12: 72-77Crossref PubMed Scopus (278) Google Scholar) (see Table I). Homologous recombination in yeast was also used to create a number of fusion constructs (19Lorenz MC. Muir R.S. Lim E. McElver J. Weber S.C. Heitman J. Gene (Amst.). 1995; 158: 113-117Crossref PubMed Scopus (260) Google Scholar). BRCA2-Gal4p DNA-binding domain fusions were cotransformed into the yeast strain J692 with activation domain libraries from B-cell, liver, testis, and breast (20Schiestl R.H. Manivasakam P. Woods R.A. Gietz R.D. Methods. 1993; 5: 79-85Crossref Scopus (72) Google Scholar, 21Bendixen C. Gangloff S. Rothstein R. Nucleic Acids Res. 1994; 22: 1778-1779Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). The yeast transformants were plated on yeast minimal media lacking tryptophan, leucine, and histidine and containing 25 mm3-amino-1,2,4-triazole. After incubation for approximately 8 days at 30 °C, β-galactosidase activity was determined by a filter assay (22Breeden L. Naysmith K. Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 1985; 50: 643-650Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar).Table IInteractions of BRCA2 with RAD51 by yeast two-hybrid assayBinding domain plasmid (pGBT.C)Activation domain plasmid (pGAD.C)β-Galactosidase activityaa 196–386RAD51Whiteaa 272–379RAD51Whiteaa 361–667RAD51Whiteaa 444–479RAD51Whiteaa 570–715RAD51Whiteaa 736–1253RAD51Blueaa 1253–1708RAD51Dark Blueaa 1708–2099RAD51Dark Blueaa 1912–2126RAD51Blueaa 2683–2870RAD51Whiteaa 2706–3014RAD51Whiteaa 2758–2996RAD51Whiteaa 736–1253No InsertWhiteaa 1253–1708No InsertLight Blueaa 1708–2099No InsertLight Blueaa 1912–2126No InsertWhite Open table in a new tab Templates for the eight BRC motifs of the human BRCA2 protein and the BRC motif encoded by C. elegans T07E3.5 were generated by PCR 1The abbreviations used are: PCR, polymerase chain reaction; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis; GST, glutathione S-transferase. amplification using the following primer pairs: motif 1F, GGGAATTCCCAGAAAAAAATAATGATTACATGAACAA; motif 1R, GGGTCGACCTGTAAATGTGCAGATACAGTATTAATTG; motif 2F, GGGAATTCCTGTTGAAAAATGACTGTAACAAAAGTG; motif 2R, GGGTCGACATTATTTTGTAATATCAGTTGGCATTTATTA; motif 3F, GGGAATTCTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAA; motif 3R, GGGTCGACTTGATTTCCAGTACCAACTGGGACA; motif 4F, GGGAATTCGTTGGTACTGGAAATCAACTAGTGAC; motif 4R, GGGTCGACTTCTTTACACTTTGGGGCAGCTGTG; motif 5F, GGGAATTCGAAACAGCAAAAAGTCCTGCAACTTG; motif 5R, GGGTCGACATAAGTATCTTGTTTTTCGGAGAGATG; motif 6F, GGGAATTCCCCTGCAAAAATAAAAATGCAGCCATTA; motif 6R, GGGTCGACATGTGAATGCGTGCTACATTCATCATTA; motif 7F, GGGAATTCTTGGAAACTTCAGATATATGTAAATGTAG; motif 7R, GGGTCGACTAAATGTTCTGGAGTACGTATAGCAG; motif 8F, GGGAATTCATACGTACTCCAGAACATTTAATATCC; motif 8R, GGGTCGACGTGCTCTGGGTTTCTCTTATCAACA; C. elegans motif F, GGGAATTCGTAAAAGACAGTTTCGACACAA; and C. elegans motif R, GGGTCGACTGGAGCTTCGAAATCTTCGAAACC. The PCR products were subcloned into both pGBT.C and pGAD.C using standard techniques (23Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). Similarly, various truncated segments of RAD51 were created by PCR for subcloning. The sequence of all fusion constructs were verified by sequencing. Templates for making radiolabeled proteins were either from PCR-generated DNA fragments or recombinant plasmids. The primers T7-act-forward (TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACATGGATAAAGCGGAATTAATTCCCGA) and Adh-act-reverse (CCCTACATCATCATGCAGTATCTACGATTCATAGATCTCTG) specific for the pGAD.C vector were used to produce PCR templates of the BRC motifs and all other inserts that were fused to the Gal4p activation domain (24Bartel P. Fields S. Methods Enzymol. 1995; 254: 241-263Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar). The T7-act-forward primer contains the T7 RNA polymerase promoter. The PCR DNA templates were transcribed in vitro by T7 RNA polymerase using the Ribomax Kit (Promega) and translated in vitro in the presence of [35S]methionine using rabbit reticulocyte lysate (Promega). In some experiments, the Single Tube Protein System 2 from Novagen was used to synthesize radiolabeled proteins. GST fusion protein constructs were made by cloning the PCR products containing amino acid residues 1–44, 1–95, or 98–339 of human RAD51 and residues 1912–2126 of BRCA2 into the GST expression vector pGEX (Pharmacia Biotech Inc.). All GST and GST fusion constructs were transformed into E. coli BL21(DE3)pLysS competent cells (Stratagene). The transformants were induced by isopropylthiogalactopyranoside, harvested, and lysed by sonication in phosphate-buffered saline with 0.1% Triton X-100. The binding assay of GST fusion protein with the radiolabeled protein was performed according to the protocol of Sande and Privalsky (25Sande S. Privalsky M.L. Mol. Endocrinol. 1996; 7: 813-825Google Scholar). Equal amounts of GST and GST fusion proteins, as determined by Coomassie Blue staining of aliquots run on gels, were used in each assay. The protein complexes bound to the beads were washed extensively and released by heating to 90 °C in an equal volume of 2 × SDS-PAGE loading buffer. The radiolabeled proteins were resolved by SDS-PAGE and visualized using the Molecular Dynamics Storm PhosphorImager System (Molecular Dynamics). The yeast two-hybrid system provides a powerful approach for identifying protein-protein interactions in vivo. In our initial experiments, we cloned the DNA segment of brca2 encoding amino acid residues 1912–2126 as a Gal4p DNA-binding domain fusion (Table I). This clone was used as a "bait" to search four different human Gal4p activation domain libraries. From a human B-cell library, we obtained 115His +, blue clones of approximately three million transformants. Sequencing of these potentially positive clones indicated that 22 of 115 were derived from the rad51 gene. The shortest of the RAD51 clones contained the cDNA segment encompassing amino acids 98–339. This result indicates that the N-terminal portion of RAD51 is not necessary for binding amino acid residues 1912–2126 of the human BRCA2 protein. However, while our work was in progress, it was reported that the N terminus of the murine RAD51 protein is required for binding the C-terminal portion of the murine BRCA2 protein (9Sharan S.K. Morimatsu M. Albrecht U. Lim D.-S. Regel E. Dinh Sands A. Eichele G. Hasty P. Bradley A. Nature. 1997; 386: 804-810Crossref PubMed Scopus (934) Google Scholar). For this reason, we also examined several overlapping segments that encompassed most of the BRCA2 gene to determine if additional regions of BRCA2 could interact with RAD51. Several BRCA2 segments as Gal4p DNA-binding domain fusions and RAD51 as a Gal4p activation domain fusion were co-expressed in yeast cells. The results of β-galactosidase filter assays are summarized in Table I. Four regions (amino acid residues 736–1253, 1253–1708, 1708–2099, and 1912–2126) of the BRCA2 protein scored positive for β-galactosidase activity, indicating an interaction with RAD51. Two regions of BRCA2, encompassing residues 1253–1708 and 1708–2099, when expressed as DNA-binding domain fusions, gave rise to light blue color. However, the intensity of the blue color increased dramatically when the RAD51 activation domain fusion was present, indicating an interaction with RAD51. Eight BRC motifs are found in exon 11 (encoding amino acid residues 638–2280) of the human brca2 gene (5Koonin E.V. Altschul S.F. Bork P. Nat. Genet. 1996; 13: 266-268Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar, 7Bignell G. Micklem G. Stratton M.R. Ashworth A. Wooster R. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 53-58Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar). Interactions of RAD51 with fragments of BRCA2 encompassing residues 736–2126 raised the possibility that the BRC motifs might serve as specific sites for RAD51 interaction. To test this hypothesis, each BRC motif was tested individually for interaction with RAD51 in a yeast two-hybrid assay. As shown in TableII, six of the eight motifs (BRC1, -2, -3, -4, -7, and -8) interacted with RAD51 when it was expressed as an activation domain fusion. Because the context of folding in the Gal4p-DNA-binding domain fusion might have affected the binding of motifs 5 and 6 to RAD51, we performed swapping experiments in which motifs 5 and 6 were engineered as activation domain fusions and RAD51 was engineered as a DNA-binding domain fusion. After co-transformation, motifs 5 and 6 remained negative in the β-galactosidase assay (TableII). We also examined the BRC motif from C. elegans to see if it was able to interact with RAD51 in a similar yeast two-hybrid assay. A positive interaction with RAD51 was observed (Table II).Table IIInteractions of BRC motifs with RAD51 by yeast two-hybrid assayBinding domain plasmid (pGBT.C)Activation domain plasmid (pGAD.C)β-Galactosidase activityBRC 1 (987–1069)RAD51BlueBRC 2 (1198–1293)RAD51BlueBRC 3 (1407–1498)RAD51BlueBRC 4 (1501–1589)RAD51BlueBRC 5 (1649–1735)RAD51WhiteBRC 6 (1822–1914)RAD51WhiteBRC 7 (1955–2035)RAD51BlueBRC 8 (2036–2112)RAD51BlueC. elegans(8–113)RAD51BlueBRC 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8No InsertWhiteC. elegansNo InsertWhiteRAD51BRC5WhiteRAD51BRC6White Open table in a new tab In vitro biochemical assays provide an alternative means to investigate protein-protein interaction. Different segments of the RAD51 protein, residues 1–44, 1–95, and 98–339, cloned as glutathione S-transferase fusions, were examined for in vitro association with radiolabeled BRCA2. The BRCA2 segment encompassing residues 1912–2126 was first used to optimize our assay. It was found that this region interacts with GST-RAD98–339 but not with nonrecombinant GST, GST-RAD1–44, or GST-RAD1–95 (Fig.1 A). In a negative control, radiolabeled β-galactosidase was not retained on beads coupled to GST or GST-RAD51 fusions (data not shown). This assay was also used to confirm the physical associations of RAD51 with the BRC motifs of human BRCA2 and C. elegans. It was found that only amino acid residues 98–339 of RAD51 could associate with each of the radiolabeled BRC motifs (representative examples are shown in Fig. 1, B,C, and D). Interestingly, BRC motifs 5 and 6, which scored negative in the yeast two-hybrid assay, appeared to interact significantly and specifically with RAD51 in the in vitro assay. To determine the minimal region of RAD51 that can interact with the BRC motifs, we cloned a series of truncated segments of RAD51 into pGBT.C and co-transformed them into yeast with the BRC motif 3 in pGAD.C. As summarized in TableIII, the segment from residues 98–339 of RAD51 is required for the interaction with BRC3, which indicates that most of the C-terminal part of RAD51 is crucial to binding. In addition, we performed the reciprocal experiment to determine the minimal region of a BRC motif necessary for binding to RAD51. The motif BRC3 was arbitrarily chosen for the deletion analysis. It was found that the amino acid residues from positions 1414 to 1463 of BRCA2 are critical to binding (Table III). This minimal region includes all the conserved amino acids that form the basis of the BRC consensus sequence (5Koonin E.V. Altschul S.F. Bork P. Nat. Genet. 1996; 13: 266-268Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar, 7Bignell G. Micklem G. Stratton M.R. Ashworth A. Wooster R. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 53-58Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar).Table IIIMapping of the minimal binding domain in BRC motif 3 and RAD51Binding domain plasmid (pGBT.C)Activation domain plasmid (pGAD.C)β-Galactosidase activityBRC 3 (1404–1502)RAD51 (98–339)BlueBRC 3RAD51 (120–339)WhiteBRC 3RAD51 (150–339)WhiteBRC 3RAD51 (200–339)WhiteBRC 3RAD51 (250–339)WhiteBRC 3RAD51 (98–300)WhiteBRC 3RAD51 (98–200)WhiteBRC 3RAD51 (98–150)WhiteBRC 3 (1404–1423)RAD51 (98–339)WhiteBRC 3 (1404–1443)RAD51WhiteBRC 3 (1404–1463)RAD51Light BlueBRC 3 (1404–1483)RAD51BlueBRC 3 (1414–1502)RAD51BlueBRC 3 (1434–1502)RAD51WhiteBRC 3 (1454–1502)RAD51WhiteBRC 3 (1474–1502)RAD51White Open table in a new tab The identification of components in the BRCA2 functional pathway should further our understanding of BRCA2 function and its role in tumorigenesis. Through yeast two-hybrid screens of human cDNA libraries, we identified RAD51 as a BRCA2-binding protein. Sharan et al. (9Sharan S.K. Morimatsu M. Albrecht U. Lim D.-S. Regel E. Dinh Sands A. Eichele G. Hasty P. Bradley A. Nature. 1997; 386: 804-810Crossref PubMed Scopus (934) Google Scholar) previously demonstrated that the C-terminal region of murine BRCA2 interacts with the N-terminal portion of murine RAD51. We identified eight sites of interaction between these proteins. Specifically the eight BRC motifs encoded in exon 11 of the human brca2 gene interact with RAD51. In addition, a similar motif found in a C. elegans hypothetical protein also interacts with RAD51. These data suggest that the BRC motifs function to bind RAD51. Sequence comparison of the BRCA2 proteins from six mammalian species have revealed sequences conserved among the eight BRC motifs, which strongly implies functional significance (5Koonin E.V. Altschul S.F. Bork P. Nat. Genet. 1996; 13: 266-268Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar, 7Bignell G. Micklem G. Stratton M.R. Ashworth A. Wooster R. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 53-58Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar). Our findings that RAD51 binds to different protein sequences encoded by the 5-kilobase exon 11 of BRCA2 led us to examine whether the BRC internal repeats are the actual sites of interactions with RAD51. Because the amino acid sequences of these motifs are not identical, we analyzed each BRC motif individually to determine if they could associate with RAD51. All eight human BRC motifs showed interaction in biochemical assays, but only six of eight BRC motifs bound specifically to RAD51 in the yeast two-hybrid assays. This discrepancy in binding specificity might be caused by the different protein context of Gal4p and GST fusions. Subtle changes in the amino acid sequence of BRC motif 5 and 6 could have affected the proper folding of the predicted globular domain in these motifs in yeast. Deletion analyses of the BRC motif 3 and RAD51 identified the minimal regions in both proteins that are required for binding. Our results indicate that the minimal region defined for the BRC motif 3 encompasses the entire consensus sequence that is highly conserved among mammalian species (7Bignell G. Micklem G. Stratton M.R. Ashworth A. Wooster R. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 53-58Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar). Similarly, the minimal region of human RAD51, amino acid residues 98–339, that interacts with human BRCA2 is conserved among prokaryotic and eukaryotic species. The homologous region in the E. coli recA protein has been demonstrated to contain ATPase activity and is involved in oligomer formation and recombination (26Ogawa T. Shinohara A. Ogawa H. Tomizawa J. J. Mol. Biol. 1992; 226: 651-660Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). The role of multiple RAD51-binding sites in BRCA2 is open to interpretation. It seems reasonable that BRCA2 might bind several molecules of RAD51 simultaneously and therefore might serve as a scaffold for RAD51 assembly during DNA repair and recombination. Alternatively the multiple binding sites might play a role in the sequestration of active RAD51 or the facilitation of functional interactions of RAD51 with itself or other proteins. Because a similar BRC motif in a hypothetical protein from C. elegans is capable of binding to human RAD51, this same structural and functional relationship may hold in other eukaryotic species. Using biochemical assays, we have confirmed that the association between RAD51 and BRCA2 is direct (10Mizuta R. LaSalle J.M. Chieng H.-L. Shinohara A. Ogawa H. Copeland N. Jenkins N.A. Lalande M. Alt F.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 6927-6932Crossref PubMed Scopus (218) Google Scholar). In contrast, the binding of RAD51 to BRCA1 may be mediated through another protein in a complex (15Scully R. Chen J. Plug A. Xiao Y. Weaver D. Feunteun J. Ashley T. Livingston D.M. Cell. 1997; 88: 265-275Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1337) Google Scholar). We have searched extensively for possible interactions between RAD51 and BRCA1 using the yeast two-hybrid assay, but so far without success (data not shown). It is interesting to note that the tumor suppressor gene p53 also associates with RAD51 (27Sturzbecher H.-W. Donzelmann B. Henning W. Knippschild U. Buchhop S. EMBO J. 1996; 15: 1992-2002Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar). Together these data strongly suggest that RAD51 represents a crucial functional junction linking recombination and repair to cell cycle checkpoint signaling. Our protein-protein interaction data, coupled with the previous observations that 1) brca2-null mouse embryos are hypersensitive to γ irradiation, 2) brca1 and brca2-null mouse embryos drastically overexpress p21 and suffer a failure of embryonic cell proliferation, and 3) there is a direct protein-protein interaction between RAD51 and p53, raise a critical question about the function of BRCA1 and BRCA2 (28Kinzler K.W. Vogelstein B. Cell. 1996; 87: 159-170Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4321) Google Scholar, 29Ludwig T. Chapman D.L. Papaioannou V.E. Efstratiadis A. Genes Dev. 1997; 11: 1226-1241Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar, 30Hakem R. de la Pompa J.L. Elia J. Mak T.W. Nat. Genet. 1997; 16: 298-302Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar, 31Suzuki A. de la Pompa J.L. Hakem R. Elia A. Yoshida R. Mo R. Nishina H. Chuang T. Wakeman A. Itie A. Koo W. Billia P. Ho A. Fukumoto M. Hui C.C. Mak T.W. Genes Dev. 1997; 11: 1242-1252Crossref PubMed Scopus (237) Google Scholar). Is the primary deficit in brca1-null and/or brca2-null tumors a failure of DNA repair, or is it a failure of signal transduction associated with the need for DNA repair? The answer to this question could have bearings on the rationale for use of brca1 and brca2 as anti-tumor gene therapy agents in patients. The restoration of BRCA1 and BRCA2 function might stabilize genome integrity in the tumor without reversing the damages that have already occurred. In contrast, restoration of signal transduction might render the tumors more sensitive to apoptosis, a process that can be triggered by p53 or possibly chemotherapeutic agents. Further research is needed to address these possibilities. We thank Drs. D. Ballinger, G. Frech, L. Fitzgerald, and D. Teng for helpful comments on the manuscript.

Early detection of lung cancer can help in a sharp decrease in the lung cancer mortality rate, which accounts for more than 17% percent of the total cancer related deaths. A large number of cases are encountered by radiologists on a daily basis for initial diagnosis. Computer-aided diagnosis (CAD) systems can assist radiologists by offering a "second opinion" and making the whole process faster. We propose a CAD system which uses deep features extracted from an auto encoder to classify lung nodules as either malignant or benign. We use 4303 instances containing 4323 nodules from the National Cancer Institute (NCI) Lung Image Database Consortium (LIDC) dataset to obtain an overall accuracy of 75.01% with a sensitivity of 83.35% and false positive of 0.39/patient over a 10 fold cross validation.

Abstract Robotic leg prostheses and exoskeletons can provide powered locomotor assistance to older adults and/or persons with physical disabilities. However, the current locomotion mode recognition systems being developed for intelligent high-level control and decision-making use mechanical, inertial, and/or neuromuscular data, which inherently have limited prediction horizons (i.e., analogous to walking blindfolded). Inspired by the human vision-locomotor control system, we designed and evaluated an advanced environment classification system that uses computer vision and deep learning to forward predict the oncoming walking environments prior to physical interaction, therein allowing for more accurate and robust locomotion mode transitions. In this study, we first reviewed the development of the ExoNet database – the largest and most diverse open-source dataset of wearable camera images of indoor and outdoor real-world walking environments, which were annotated using a hierarchical labelling architecture. We then trained and tested over a dozen state-of-the-art deep convolutional neural networks (CNNs) on the ExoNet database for large-scale image classification of the walking environments, including: EfficientNetB0, InceptionV3, MobileNet, MobileNetV2, VGG16, VGG19, Xception, ResNet50, ResNet101, ResNet152, DenseNet121, DenseNet169, and DenseNet201. Lastly, we quantitatively compared the benchmarked CNN architectures and their environment classification predictions using an operational metric called NetScore, which balances the image classification accuracy with the computational and memory storage requirements (i.e., important for onboard real-time inference). Although we designed this environment classification system to support the development of next-generation environment-adaptive locomotor control systems for robotic prostheses and exoskeletons, applications could extend to humanoids, autonomous legged robots, powered wheelchairs, and assistive devices for persons with visual impairments.

Abstract Advances in computer vision and artificial intelligence are allowing researchers to develop environment recognition systems for powered lower-limb exoskeletons and prostheses. However, small-scale and private training datasets have impeded the widespread development and dissemination of image classification algorithms for classifying human walking environments. To address these limitations, we developed ExoNet - the first open-source, large-scale hierarchical database of high-resolution wearable camera images of human locomotion environments. Unparalleled in scale and diversity, ExoNet contains over 5.6 million RGB images of different indoor and outdoor real-world walking environments, which were collected using a lightweight wearable camera system throughout the summer, fall, and winter seasons. Approximately 923,000 images in ExoNet were human-annotated using a 12-class hierarchical labelling architecture. Available publicly through IEEE DataPort, ExoNet offers an unprecedented communal platform to train, develop, and compare next-generation image classification algorithms for human locomotion environment recognition. Besides the control of powered lower-limb exoskeletons and prostheses, applications of ExoNet could extend to humanoids and autonomous legged robots.

The trade-off between transverse resolution and depth-of-focus (DOF) typical for optical coherence tomography (OCT) systems based on conventional optics, prevents "single-shot" acquisition of volumetric OCT images with sustained high transverse resolution over the entire imaging depth. Computational approaches for correcting defocus and higher order aberrations in OCT images developed in the past require highly stable phase data, which poses a significant technological challenge. Here, we present an alternative computational approach to sharpening OCT images and reducing speckle noise, based on intensity OCT data. The novel algorithm uses non-local priors to model correlated speckle noise within a maximum