Stabilizing the prefusion SARS-CoV-2 spike The development of therapeutic antibodies and vaccines against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is focused on the spike (S) protein that decorates the viral surface. A version of the spike ectodomain that includes two proline substitutions (S-2P) and stabilizes the prefusion conformation has been used to determine high-resolution structures. However, even S-2P is unstable and difficult to produce in mammalian cells. Hsieh et al. characterized many individual and combined structure-guided substitutions and identified a variant, named HexaPro, that retains the prefusion conformation but shows higher expression than S-2P and can also withstand heating and freezing. This version of the protein is likely to be useful in the development of vaccines and diagnostics. Science , this issue p. 1501

The COVID-19 pandemic caused by the novel coronavirus SARS-CoV-2 has led to accelerated efforts to develop therapeutics, diagnostics, and vaccines to mitigate this public health emergency. A key target of these efforts is the spike (S) protein, a large trimeric class I fusion protein that is metastable and difficult to produce recombinantly in large quantities. Here, we designed and expressed over 100 structure-guided spike variants based upon a previously determined cryo-EM structure of the prefusion SARS-CoV-2 spike. Biochemical, biophysical and structural characterization of these variants identified numerous individual substitutions that increased protein yields and stability. The best variant, HexaPro, has six beneficial proline substitutions leading to ~10-fold higher expression than its parental construct and is able to withstand heat stress, storage at room temperature, and multiple freeze-thaws. A 3.2 Å-resolution cryo-EM structure of HexaPro confirmed that it retains the prefusion spike conformation. High-yield production of a stabilized prefusion spike protein will accelerate the development of vaccines and serological diagnostics for SARS-CoV-2.

Abstract The efficacy of polyclonal antibody responses is inherently linked to paratope diversity, as generated through V(D)J recombination and somatic hypermutation (SHM). These processes arose in early jawed vertebrates; however, little is known about how immunoglobulin diversity, mutability, and hypermutation have evolved in tandem with another more ubiquitous feature of protein-coding DNA – codon optimality. Here, we explore these relationships through analysis of germline IG genes, natural V(D)J repertoires, serum VH usage, and monoclonal antibody (mAb) expression, each through the lens of multiple optimality metrics. Strikingly, proteomic serum IgG sequencing showed that germline IGHV codon optimality positively correlated with VH representation after influenza vaccination, and in vitro , codon deoptimization of mAbs with synonymous amino acid sequences caused consistent expression loss. Germline V genes exhibit a range of codon optimality that is maintained by functionality, and inversely related to mutability. SHM caused a load-dependent deoptimization of IGH VDJ repertoires within human tonsils, bone marrow, and lymph nodes (including SARS-CoV-2-specific clones from mRNA vaccinees), influenza-infected mice, and zebrafish. Comparison of natural mutation profiles to true random suggests the presence of selective pressures that constrain deoptimization. These findings shed light on immunoglobulin evolution, providing unanticipated insights into the antagonistic relationship between variable region diversification, codon optimality, and antibody secretion; ultimately, the need for diversity takes precedence over that for the most efficient expression of the antibody repertoire.