Macromolecular phase separation is thought to be one of the processes that drives the formation of membraneless biomolecular condensates in cells. The dynamics of phase separation are thought to follow the tenets of classical nucleation theory, and, therefore, subsaturated solutions should be devoid of clusters with more than a few molecules. We tested this prediction using in vitro biophysical studies to characterize subsaturated solutions of phase-separating RNA-binding proteins with intrinsically disordered prion-like domains and RNA-binding domains. Surprisingly, and in direct contradiction to expectations from classical nucleation theory, we find that subsaturated solutions are characterized by the presence of heterogeneous distributions of clusters. The distributions of cluster sizes, which are dominated by small species, shift continuously toward larger sizes as protein concentrations increase and approach the saturation concentration. As a result, many of the clusters encompass tens to hundreds of molecules, while less than 1% of the solutions are mesoscale species that are several hundred nanometers in diameter. We find that cluster formation in subsaturated solutions and phase separation in supersaturated solutions are strongly coupled via sequence-encoded interactions. We also find that cluster formation and phase separation can be decoupled using solutes as well as specific sets of mutations. Our findings, which are concordant with predictions for associative polymers, implicate an interplay between networks of sequence-specific and solubility-determining interactions that, respectively, govern cluster formation in subsaturated solutions and the saturation concentrations above which phase separation occurs.

Abstract Macromolecular phase separation is thought to be one of the processes that drives the formation of membraneless biomolecular condensates in cells. The dynamics of phase separation, especially at low endogenous concentrations found in cells, are thought to follow the tenets of classical nucleation theory describing a sharp transition between a dense phase and a dilute phase characterized by dispersed monomers. Here, we used in vitro biophysical studies to study subsaturated solutions of phase separating RNA binding proteins with intrinsically disordered prion like domains (PLDs) and RNA binding domains (RBDs). Surprisingly, we find that subsaturated solutions are characterized by heterogeneous distributions of clusters comprising tens to hundreds of molecules. These clusters also include low abundance mesoscale species that are several hundreds of nanometers in diameter. Our results show that cluster formation in subsaturated solutions and phase separation in supersaturated solutions are strongly coupled via sequence-encoded interactions. Interestingly, however, cluster formation and phase separation can be decoupled from one another using solutes that impact the solubilities of phase separating proteins. They can also be decoupled by specific types of mutations. Overall, our findings implicate the presence of distinct, sequence-specific energy scales that contribute to the overall phase behaviors of RNA binding proteins. We discuss our findings in the context of theories of associative polymers. Significance Statement Membraneless biomolecular condensates are molecular communities with distinct compositional preferences and functions. Considerable attention has focused on phase separation as the process that gives rise to condensates. Here, we show that subsaturated solutions of RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. The formation of clusters in subsaturated solutions and condensates in supersaturated solution are coupled through sequence-specific interactions. Given the low endogenous concentrations of phase separating proteins, our findings suggest that clusters in subsaturated conditions might be of functional relevance in cells.

Multivalent proteins undergo coupled segregative and associative phase transitions. Phase separation, a segregative transition, is driven by macromolecular solubility, and this leads to coexisting phases above system-specific saturation concentrations. Percolation is a continuous transition that is driven by multivalent associations among cohesive motifs. Contributions from percolation are highlighted by the formation of heterogeneous distributions of clusters in sub-saturated solutions, as was recently reported for Fused in sarcoma (FUS) and FET family proteins. Here, we show that clustering and phase separation are defined by a separation of length- and energy-scales. This is unmasked when glutamate is the primary solution anion. Glutamate is preferentially excluded from protein sites, and this enhances molecular associations. Differences between glutamate and chloride are manifest at ultra-low protein concentrations. These differences are amplified as concentrations increase, and they saturate as the micron-scale is approached. Therefore, condensate formation in supersaturated solutions and clustering in sub-saturated are governed by distinct energy and length scales. Glutamate, unlike chloride, is the dominant intracellular anion, and the separation of scales, which is masked in chloride, is unmasked in glutamate. Our work highlights how components of cellular milieus and sequence-encoded interactions contribute to amplifying distinct contributions from associative versus segregative phase transitions.