SUMMARY Chimeric antigen receptors (CARs) repurpose natural signaling components to retarget T cells to refractory cancers, but have shown limited efficacy against solid tumors. Here, we introduce ‘CAR Pooling’, a multiplexed approach to rapidly identify CAR designs with clinical potential. Forty CARs with diverse immune costimulatory domains were assessed in pooled assays for their ability to stimulate critical T cell effector functions during repetitive stimulation that mimics long-term tumor antigen exposure. Several non-native domains from the TNF receptor family exhibited enhanced proliferation (CD40) or cytotoxicity (BAFF-R and TACI) relative to clinical benchmarks, and fell into distinct states of memory, cytotoxicity, and metabolism. BAFF-R CAR T cells were enriched for a highly cytotoxic and NK-cell-like innate phenotype previously associated with positive clinical outcomes. ‘CAR Pooling’ enables efficient exploration of how CAR design affects cell activity and can be applied to optimize receptors across a range of applications and cell types.

The development of DNA-barcoded antibodies to tag cell-surface molecules has enabled the use of droplet-based single cell sequencing (dsc-seq) to profile the surface proteomes of cells. Compared to flow and mass cytometry, the major limitation of current dsc-seq-based workflows is the high cost associated with profiling each cell, thus precluding its use in applications where millions of cells are required. Here, we introduce SCITO-seq, a new workflow that combines combinatorial indexing and commercially available dsc-seq to enable cost-effective cell surface proteomic sequencing of greater than 105 cells per microfluidic reaction. We demonstrate SCITO-seq's feasibility and scalability by profiling mixed species cell lines and mixed human T and B lymphocytes. To further demonstrate its applicability, we show comparable cellular composition estimates in peripheral blood mononuclear cells obtained with SCITO-seq and mass cytometry. SCITO-seq can be extended to include simultaneous profiling of additional modalities such as transcripts and accessible chromatin or tracking of experimental perturbations such as genome edits or extracellular stimuli.

A typical molecular cloning procedure requires Sanger sequencing for validation, which becomes cost-prohibitive and labour intensive for large-scale clonal analysis of genotype phenotype studies. Here we present a Tn5 mediated clonal analysis platform TnClone, which uses next-generation sequencing (NGS) to rapidly and cost-effectively analyze a large number of clones. We also developed a user-friendly graphical user interface and have provided general guidelines for conducting validation experiments. Using TnClone, we achieved more than 20-fold cost reduction compared with the cost incurred using conventional Sanger sequencing and detected low-frequency mutant clones (~10%) in mixed samples. We tested our programme and achieved 99.4% sensitivity. Our platform provides rapid turnaround with minimal hands-on time for secondary evaluation as NGS technology continues to evolve.

Determining cell lineage and function is critical to understanding human physiology and pathology. Although advances in lineage tracing methods have provided new insight into cell fate, defining cellular diversity at the mammalian level remains a challenge. Here, we developed a genome editing strategy using a cytidine deaminase fused with inactive Cas9 (dCas9) to specifically target endogenous interspersed repeat regions in mammalian cells. The resulting mutation patterns served as a genetic barcode, which was induced by targeted mutagenesis with single-guide RNA (sgRNA), leveraging substitution events, and subsequent read out by a single primer pair. By analyzing interspersed mutation signatures, we show the accurate reconstruction of cell lineage using both bulk cell and single-cell data. We envision that our genetic barcode system will enable fine-resolution mapping of organismal development in healthy and diseased mammalian states.

e16517 Background: While active surveillance for small renal cell carcinoma (RCC) gained acceptance due to harmless behavior, controversy still continues on aggressive potential of small RCC. Despite small tumor size, there still remains a risk for distant metastasis and recurrence. The biology of small RCC, especially the risk factors for metastasis and recurrence, has not been fully elucidated. It is therefore important to evaluate the aggressive potential of small RCCs to ensure that necessary treatments are given, but also to avoid overtreatment. Therefore, we used bulk RNA sequencing and single cell RNA sequencing (scRNA-seq) to reveal genetic biomarkers and distinct immune microenvironment in aggressive small RCC patients. Methods: Five cases of T1a (≤ 4cm) clear cell RCCs (ccRCCs) that were reported to have synchronous metastasis or recurrence were identified as an aggressive group and four cases with age, sex, and tumor size-matched ccRCCs patients with no metastasis or recurrence were identified as a non-aggressive group among prospective cohort (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03694912) RCC database. For the control, two healthy kidney donors were enrolled. We performed scRNA-seq using the 10X Genomics platform and bulk analysis for the total eleven cases of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples. We demultiplexed pooled 11 samples using Souporcell and sequencing reads were normalized and analyzed using R/Seurat package. Cellular components of each sample were determined based on known marker genes. Bulk analysis involved differential gene expression analysis and pathway enrichment analysis. Results: The mean tumor size and age was 2.6 cm and 63 years old, respectively. Among 5 aggressive ccRCC patients, two patients had synchronous lung metastasis and two patients had synchronous bone metastasis. One patient had recurrence after partial nephrectomy. We analyzed 36,303 cells and identified 31 cell subpopulations. Our single-cell analysis unveiled distinct variations in T cell and natural killer (NK) cell proportions among aggressive, non-aggressive, and normal groups, highlighting significant differences in these ratios. Additionally, a notable pattern of gene expression levels was found between non-aggressive and aggressive groups, with a substantial increase in the expression levels of GSTP, ASRG, and SNORD142 genes in aggressive group. Conclusions: As T1a ccRCCs present low but non-negligible risk of metastasis and recurrence, patients with small RCCs should be counseled on such risk when offered active surveillance. Patients with higher NK cells and lower naïve CD8+ T cell are associated with higher risk of metastasis and recurrence in T1a RCC. This study suggests a promising potential for leveraging genetic markers and immune cell dynamics in the diagnosis of aggressive ccRCC using non-invasive screening methods.