Abstract Dendritic and axonal morphology reflects the input and output of neurons and is a defining feature of neuronal types 1,2 , yet our knowledge of its diversity remains limited. Here, to systematically examine complete single-neuron morphologies on a brain-wide scale, we established a pipeline encompassing sparse labelling, whole-brain imaging, reconstruction, registration and analysis. We fully reconstructed 1,741 neurons from cortex, claustrum, thalamus, striatum and other brain regions in mice. We identified 11 major projection neuron types with distinct morphological features and corresponding transcriptomic identities. Extensive projectional diversity was found within each of these major types, on the basis of which some types were clustered into more refined subtypes. This diversity follows a set of generalizable principles that govern long-range axonal projections at different levels, including molecular correspondence, divergent or convergent projection, axon termination pattern, regional specificity, topography, and individual cell variability. Although clear concordance with transcriptomic profiles is evident at the level of major projection type, fine-grained morphological diversity often does not readily correlate with transcriptomic subtypes derived from unsupervised clustering, highlighting the need for single-cell cross-modality studies. Overall, our study demonstrates the crucial need for quantitative description of complete single-cell anatomy in cell-type classification, as single-cell morphological diversity reveals a plethora of ways in which different cell types and their individual members may contribute to the configuration and function of their respective circuits.

Ever since the seminal findings of Ramon y Cajal, dendritic and axonal morphology has been recognized as a defining feature of neuronal types and their connectivity. Yet our knowledge about the diversity of neuronal morphology, in particular its distant axonal projections, is still extremely limited. To systematically obtain single neuron full morphology on a brain-wide scale in mice, we established a pipeline that encompasses five major components: sparse labeling, whole-brain imaging, reconstruction, registration, and classification. We achieved sparse, robust and consistent fluorescent labeling of a wide range of neuronal types across the mouse brain in an efficient way by combining transgenic or viral Cre delivery with novel transgenic reporter lines, and generated a large set of high-resolution whole-brain fluorescent imaging datasets containing thousands of reconstructable neurons using the fluorescence micro-optical sectioning tomography (fMOST) system. We developed a set of software tools based on the visualization and analysis suite, Vaa3D, for large-volume image data processing and computation-assisted morphological reconstruction. In a proof-of-principle case, we reconstructed full morphologies of 96 neurons from the claustrum and cortex that belong to a single transcriptomically-defined neuronal subclass. We developed a data-driven clustering approach to classify them into multiple morphological and projection types, suggesting that these neurons work in a targeted and coordinated manner to process cortical information. Imaging data and the new computational reconstruction tools are publicly available to enable community-based efforts towards large-scale full morphology reconstruction of neurons throughout the entire mouse brain.