Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an endothelial cell mitogen and permeability factor that is potently angiogenic in vivo.We report here studies that suggest that VEGF potentiates angiogenesis in vivo and prolongs the survival of human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs) in vitro by inducing expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2.Growth-factor-enriched and serum-deficient cultures of HDMECs grown on collagen type I gels with VEGF exhibited a 4-fold and a 1.6-fold reduction, respectively , in the proportion of apoptotic cells.Enhanced HDMEC survival was associated with a dosedependent increase in Bcl-2 expression and a decrease in the expression of the processed forms of the cysteine protease caspase-3.Cultures of HDMECs transduced with and overexpressing Bcl-2 and deprived of growth factors showed enhanced protection from apoptosis and exhibited a twofold increase in cell number and a fourfold increase in the number of capillary-like sprouts.HDMECs overexpressing Bcl-2 when incorporated into polylactic acid sponges and implanted into SCID mice exhibited a sustained fivefold increase in the number of microvessels and a fourfold decrease in the number of apoptotic cells when examined 7 and 14 days later.These results suggest that the angiogenic activity attributed to VEGF may be due in part to its ability to enhance endothelial cell survival by inducing expression of Bcl-2.

Abstract For many years, operative dentistry has been using regenerative approaches to treat dental disease. The use of calcium hydroxide to stimulate reparative or reactionary dentin is clearly an example of such a therapeutic strategy. The advent of tissue engineering is allowing dentistry to move forward in the use of regeneration as an underlying principle for the treatment of dental disease. Tissue engineering is a multi-disciplinary science that brings together biology, engineering and clinical sciences with developing new tissues and organs. It is based on fundamental principles that involve the identification of appropriate cells, the development of conducive scaffolds and an understanding of the morphogenic signals required to induce cells to regenerate the tissues that were lost. This review is focused on the presentation and discussion of existing literature that covers the engineering of enamel, dentin and pulp, as well on the engineering of entire teeth. There are clearly major roadblocks to overcome before such strategies move to the clinic and are used regularly to treat patients. However, existing evidence strongly suggests that the engineering of new dental structures to replace tissues lost during the process of caries or trauma will have a place in the future of operative dentistry.

Studies on mechanisms underlying the differentiation of dental pulp stem cells are critical for the understanding of the biology of odontogenesis and for dental tissue engineering. Here, we tested the hypothesis that stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) differentiate into functional odontoblasts and endothelial cells. SHED were seeded in tooth slice/scaffolds and implanted subcutaneously into immunodeficient mice. SHED differentiated into functional odontoblasts that generated tubular dentin, as determined by tetracycline staining and confocal microscopy. These cells also differentiated into vascular endothelial cells, as determined by beta-galactosidase staining of LacZ-tagged SHED. In vitro, vascular endothelial growth factor (VEGF) induced SHED to express VEGFR2, CD31, and VE-Cadherin (markers of endothelium) and to organize into capillary-like sprouts. VEGF induced ERK and AKT phosphorylation (indicative of differentiation), while inhibiting phosphorylation of STAT3 (indicative of ‘stemness’). Collectively, this work demonstrates that SHED can differentiate into angiogenic endothelial cells and odontoblasts capable of generating tubular dentin.

Summary

 While significant progress has been made in understanding the induction of tumor vasculature by secreted angiogenic factors, little is known regarding contact-dependent signals that promote tumor angiogenesis. Here, we report that the Notch ligand Jagged1 induced by growth factors via mitogen-activating protein kinase (MAPK) in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cells triggered Notch activation in neighboring endothelial cells (ECs) and promoted capillary-like sprout formation. Jagged1-expressing HNSCC cells significantly enhanced neovascularization and tumor growth in vivo. Moreover, the level of Jagged1 was significantly correlated with tumor blood vessel content and associated with HNSCC development. Our results elucidate a novel mechanism by which the direct interplay between tumor cells and ECs promotes angiogenesis through MAPK and Notch signaling pathways.

Calcium hydroxide (Ca(OH)2) has been used extensively to induce dentine regeneration through formation of dentine bridges at sites of pulp exposure after dental tissue injury, however, the biological processes underpinning these events are unclear. We hypothesise that growth factors and other bio-active molecules, sequestered within dentine matrix, may be released by the action of Ca(OH)2 and signal gene expression in pulp cells, which mediates the changes in cell behaviour observed during regeneration. Powdered sound, human dentine samples were extracted with either 0.02 m Ca(OH)2, pH 11.7 or 10% EDTA, pH 7.2 ( a control known extractant of bio-active and other ECM molecules from dentine) over a 14-day period. Extracts were compared for non-collagenous protein (NCP) and glycosaminoglycan (GAG) content using dye binding assays and protein compositions were analysed by 1D-polyacrylamide gel electrophoresis (1D-PAGE) and TGF-β1 ELISA. The effects of extracts on TGF-β1, Collagen-1α and Nestin gene expression were analysed using semi-quantitative RT-PCR in the dental MDPC-23, OD-21 and fibroblastic Swiss 3T3 cell lines following 24 h of exposure. Ca(OH)2 solubilised NCPs and GAGs from the dentine ECM, although with a lower yield than the EDTA solution and with different kinetics. 1D-PAGE analysis demonstrated some differences in profiles for proteins solubilised from dentine by Ca(OH)2 and EDTA. Both solutions released TGF-β1 from the dentine with higher concentrations present in the EDTA (1.395±0.036 ng/mg) versus the Ca(OH)2 (0.364±0.012 ng/mg) extract. Notably, both extracts induced similar gene expression profiles in all cell lines. These data provide a rational explanation for the action of Ca(OH)2 during pulp capping in which the cellular activities involved in dentine bridge formation may be mediated through release of growth factors and other bio-active molecules from the dentine by Ca(OH)2.

The clinical translation of stem-cell-based dental pulp regeneration will require the use of injectable scaffolds. Here, we tested the hypothesis that stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) can generate a functional dental pulp when injected into full-length root canals. SHED survived and began to express putative markers of odontoblastic differentiation after 7 days when mixed with Puramatrix™ (peptide hydrogel), or after 14 days when mixed with recombinant human Collagen (rhCollagen) type I, and injected into the root canals of human premolars in vitro. Roots of human premolars injected with scaffolds (Puramatrix™ or rhCollagen) containing SHED were implanted subcutaneously into immunodeficient mice (CB-17 SCID). We observed pulp-like tissues with odontoblasts capable of generating new tubular dentin throughout the root canals. Notably, the pulp tissue engineered with SHED injected with either Puramatrix™ or rhCollagen type I presented similar cellularity and vascularization when compared with control human dental pulps. Analysis of these data, collectively, demonstrates that SHED injected into full-length human root canals differentiate into functional odontoblasts, and suggests that such a strategy might facilitate the completion of root formation in necrotic immature permanent teeth.

It is known that stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) can be induced to differentiate into odontoblasts. However, the nature of dentin-derived morphogenic signals required for dental pulp stem cell differentiation remains unclear. The hypothesis underlying this work is that dentin-derived Bone Morphogenetic Proteins (BMP) are necessary for the differentiation of SHED into odontoblasts. We observed that SHED express markers of odontoblastic differentiation (DSPP, DMP-1, MEPE) when seeded in human tooth slice/scaffolds and cultured in vitro, or implanted subcutaneously into immunodeficient mice. In contrast, SHED cultured in deproteinized tooth slice/scaffolds, or scaffolds without a tooth slice, do not express these markers. SHED express the BMP receptors BMPR-IA, BMPR-IB, and BMPR-II. Notably, blockade of BMP-2 signaling inhibited the expression of markers of odontoblastic differentiation by SHED cultured in tooth slice/scaffolds. Collectively, this work demonstrates that dentin-derived BMP-2 is required to induce the differentiation of SHED into odontoblasts.

Recent studies have demonstrated that cancer stem cells play an important role in the pathobiology of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). However, little is known about functional interactions between head and neck cancer stem-like cells (CSC) and surrounding stromal cells. Here, we used aldehyde dehydrogenase activity and CD44 expression to sort putative stem cells from primary human HNSCC. Implantation of 1,000 CSC (ALDH+CD44+Lin-) led to tumors in 13 (out of 15) mice, whereas 10,000 noncancer stem cells (ALDH-CD44-Lin-) resulted in 2 tumors in 15 mice. These data demonstrated that ALDH and CD44 select a subpopulation of cells that are highly tumorigenic. The ability to self-renew was confirmed by the observation that ALDH+CD44+Lin- cells sorted from human HNSCC formed more spheroids (orospheres) in 3-D agarose matrices or ultra-low attachment plates than controls and were serially passaged in vivo. We observed that approximately 80% of the CSC were located in close proximity (within 100-μm radius) of blood vessels in human tumors, suggesting the existence of perivascular niches in HNSCC. In vitro studies demonstrated that endothelial cell-secreted factors promoted self-renewal of CSC, as demonstrated by the upregulation of Bmi-1 expression and the increase in the number of orospheres as compared with controls. Notably, selective ablation of tumor-associated endothelial cells stably transduced with a caspase-based artificial death switch (iCaspase-9) caused a marked reduction in the fraction of CSC in xenograft tumors. Collectively, these findings indicate that endothelial cell-initiated signaling can enhance the survival and self-renewal of head and neck CSC.

Limited availability of authentic human adenoid cystic carcinoma (ACC) cell lines has hindered progress in understanding mechanisms underpinning the biology of this disease and the development of safe and effective therapies.