Members of the inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase (IKK) family are pivotal components of the innate immune signaling pathway responsible for regulating immune and inflammatory responses. Nevertheless, the various roles that IKKs play in the physiology of invertebrates, particularly marine mollusks, remain largely unexplored. In this study, an IKK gene was cloned from the Zhikong scallop, Chlamys farreri, and denoted as CfIKK2. CfIKK2 belongs to the TANK-binding kinase 1 (TBK1)/IKKε family. Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction analysis showed that CfIKK2 was expressed in various scallop tissues and that its transcript levels substantially increased under different pathogenic stress conditions (including lipopolysaccharide, peptidoglycan, poly(I:C), acute viral necrosis virus, and Vibrio challenge). Co-immunoprecipitation experiments revealed that CfIKK2 interacts with MyD88 (a crucial adaptor in the Toll-like receptor signaling pathway) proteins through its C-terminal TBK1 coiled-coil domain 1. Moreover, CfIKK2 has been shown to interact with itself. In HEK293T cells, CfIKK2 overexpression resulted in an augmentation of mitogen-activated protein kinase phosphorylation. Furthermore, overexpression of CfIKK2 resulted in the activation of interferon reporter genes. In summary, our findings offer valuable insights into the mechanisms through which CfIKK2 responds to stress generated by pathogen-associated molecular patterns, participates in Toll-like receptor signaling, and ultimately activates some of the key cytokines involved in innate immunity in C. farreri. As a critical signaling molecule and immunoregulatory factor, CfIKK2 plays a vital role in the innate immune system of the Zhikong scallop.

Myeloid differentiation factor-88 (MyD88) is a key adaptor of the toll-like receptor (TLR) signaling pathway and plays a crucial role in innate immune signal transduction in animals. However, the MyD88-mediated signal transduction mechanism in shellfish has not been well studied. In this study, a new MyD88 gene, CfMyD88-2, was identified in the Zhikong scallop, Chlamys farreri. The 1779 bp long open reading frame encodes 592 amino acids. The N-terminus of CfMyD88-2 contains a conserved death domain (DD), followed by a TIR (TLR/Interleukin-1 Receptor) domain. The results of the multi-sequence comparison showed that the TIR domain sequences were highly conserved. Phylogenetic analysis revealed that CfMyD88-2 was first associated with Mizuhopecten yessoensis MyD88-4 and Argopecten irradians MyD88-4. CfMyD88-2 mRNA was expressed in all scallop tissues, as detected by qRT-PCR, and the expression level was the highest in the mantle and hepatopancreas. In addition, CfMyD88-2 mRNA expression significantly increased after pathogen-associated molecular patterns (PAMPs, such as lipopolysaccharide, peptidoglycan, or polyinosinic-polycytidylic acid) stimulation. The results of the co-immunoprecipitation experiments in HEK293T cells showed that both CfMyD88-1 and CfMyD88-2 interacted with the TLR protein of scallops, suggesting the existence of more than one functional TLR-MyD88 signaling axis in scallops. Dual luciferase reporter gene assays indicated that the overexpressed CfMyD88-2 in HEK293T cells activated interferon (IFN) α, IFN-β, IFN-γ, and NF-κB reporter genes, indicating that the protein has multiple functions. The results of the subcellular localization experiment uncovered that CfMyD88-2 was mainly localized in the cytoplasm of human cells. In summary, the novel identified CfMyD88-2 can respond to the challenge of PAMPs, participate in TLR immune signaling, and may activate downstream effector genes such as NF-κB gene. These research results will be useful in advancing the theory of innate immunity in invertebrates and provide a reference for the selection of disease-resistant scallops in the future.